los revista New England de medicina

establecida en 1812 22 de de diciembre de, 2011 vol. 365 no. 25

Virus Vector transferencia génica mediada por adenovirus asociados

en la hemofilia B
Amit C Nathwani, MB, Ch.B., Ph.D., Edward GD Tuddenham, MB, BS, MD, Savita Rangarajan, MB, BS, Cecilia Rosales, Ph.D., Jenny
McIntosh, Ph.D., David C. Linch, MB, B.Chir., Pratima Chowdary, MB, BS, Anne Riddell, licenciatura, Arnulfo Jaquilmac Pie, BSN, Chris
Harrington, BSN, James O'Beirne, MB, BS, MD, Keith Smith, M.Sc., John Pasi, MD, Bertil Glader, MD, Ph.D., Pradip Rustagi, MD,
Catherine YC Ng, MS, Mark A. Kay, MD, Ph.D., Junfang Zhou, MD, Yunyu Spence, Ph.D., Christopher L. Morton, BS, James Allay, Ph.D.,

John Coleman, MS, Susan sueño, Ph.D., John M. Cunningham, MD, Deokumar Srivastava, Ph.D., Etiena Basner-Tschakarjan,
MD, Federico Mingozzi, Ph.D., Katherine A. High, MD, John T. Gray, Ph.D.,
Ulrike M. Reiss, MD, Arthur W. Nienhuis, MD, y Andrew M. Davidoff, MD

ABSTRACTO

Fondo
La hemofilia B, un trastorno ligado al cromosoma X, es ideal para la terapia génica. Se investigó el uso de una nueva Desde el Departamento de Hematología del
University College de Londres Cancer Institute (ACN,
terapia génica en pacientes con el trastorno.
CR, JM, DCL); el Centro de Hemofilia Dormandy

métodos Katharine y Unidad de Trombosis (ACN, EGDT, PC,

Nos infunde una dosis única de un vector de serotipo-8-pseudotyped, virus asociado a virus AR, AJP, CH) y la Unidad de Hígado (JO), el Royal
adeno-auto-complementaria (AAV) que expresa un factor humano IX codones optimizados (FIX) transgén (scAAV2 / National Health Service libre (NHS) Fiduciario; NHS
Sangre y Trasplantes (ACN,
8-LP1-hFIXco) en un periférico vena en seis pacientes con hemofilia B severa (actividad FIX, <1% de los valores
CR, JM, KS); y el Centro de Hematología, Barts y el
normales). Los participantes del estudio se inscribieron secuen- cialmente en una de las tres cohortes (que recibieron London, Escuela Queen Mary de Medicina (JP) -
una dosis alta, intermedia o baja de vector), con dos participantes en cada grupo. Vector se administró sin terapia sive todo en Londres; Basingstoke Hampshire y el norte
inmunosupresión, y los participantes fueron seguidos durante 6 a 16 meses. de NHS Foundation Trust, Basingstoke, Reino Unido
(SR); la Escuela Universitaria de Medicina de
Stanford, Palo Alto, CA (BG, PR, MAK); los
Departamentos de Cirugía (CYCN, JZ, YS, CLM,
resultados
AMD), Bioestadística (DS), y Hematología (JTG,
Se observó la expresión mediada por AAV de FIX en 2 a 11% de los niveles normales en todos los partici- pantes. UMR, AWN), Hospital de Investigación Infantil St.
Cuatro de los seis profilaxis FIX descontinuado y permanecieron libres de hemorragia espontánea; en los otros dos, se Jude; y GMP para la Infancia (JA, JC, SS) - tanto en
Memphis, TN; el Departamento de Pediatría,
aumentó el intervalo entre inyecciones profilácticas. De los dos participantes que recibieron la dosis alta de vector, uno
Universidad de Chicago, Chicago (JMC); el Centro
tenía un sient tran-, elevación asintomática de los niveles de aminotransferasa en suero, que se asoció con la detección
de Terapéutica Celular y Molecular en el Hospital de
de células T AAV8-cápside-específica en la sangre periférica; el otro tenía un ligero aumento en los niveles de enzimas Niños de Filadelfia, Filadelfia (EB-T, FM, KAH.); y
hepáticas, la causa de las cuales fue menos claro. Cada uno de estos dos participantes recibieron un curso corto de Howard Hughes Medical Institute, Chevy Chase, MD
(KAH). solicitudes de reimpresión al Dr. Nathwani en
terapia con glucocorticoides, que rap- niveles de aminotransferasa de brazos cruzados normalizados y los niveles de
el Instituto UCL cáncer, Paul O'Gorman Bldg.,
FIX mantiene en el intervalo de 3 a 11% de los valores normales. University College de Londres, 72 Huntley Street,
Londres WC1E 6BT, Reino Unido, o al
a.nathwani@ucl.ac.uk. En este artículo (10.1056 /
NEJMoa1108046) se publicó el 10 de diciembre de
conclusiones 2011, en NEJM.org. N Engl J Med 2011; 365:
2357-65.
infusión venosa periférica de scAAV2 / 8-LP1-hFIXco resultó en transgén FIX expresiones sion a niveles suficientes
para mejorar el fenotipo de hemorragia, con pocos efectos secundarios. Aunque aclaramiento inmune mediada de los
hepatocitos de AAV transducidas sigue siendo una preocupación, este proceso puede ser controlado con un ciclo
corto de glucocorticoides sin pérdida de la expresión del transgen. (Financiado por el Consejo de Investigación Médica
y otros;. Número ClinicalTrials.gov, NCT00979238)
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H
métodos
ing trastorno que resulta de un defecto en el factor de gen
emophilia
que codifica B es un bleed-
la coagulación ligada
IX (FIX), unaalserina
cromosoma X que es crítico
proteasa Diseño del estudio

para la coagulación de la sangre. Las personas con hemofilia B severa Los pacientes que cumplieron los criterios de entrada y no tienen
tienen niveles FIX funcionales que son menos del 1% de los valores anticuerpos neutralizantes frente a AAV8, tal como se determina
nor- males y tienen frecuentes episodios de sangrado, que se asocian mediante un ensayo de transducción de inhibición in vivo (véase la
con la artropatía invalidante y muerte prematura. 1,2 El tratamiento actual Tabla 1 y la sección Métodos en el anexo complementario, disponible
implica fre- inyecciones intravenosas cuencias de proteína FIX con el texto completo de este tícu Ar- en NEJM .org), se inscribieron
concentrado con- (es decir, de dos a tres veces a la semana). Sin después de proporcionar el consentimiento informado por escrito. Los
embargo, este tratamiento es profiláctico más que curativa, es participantes 1 a 5 fueron reclutados en 2010 y fue reclutado
extremadamente caro, y está asociado con la formación de hibitor in-. Participante 6 a principios de 2011. Todos fueron ingresados ​en el
la terapia génica somática para él- mophilia B ofrece el potencial para Hospital Royal Free para la administración del vector y observación
una curación a través de la producción endógena continua de FIX posterior durante la noche. Los participantes se inscribieron
después de una sola administración de vector, especialmente desde un secuencialmente en uno de los tres Horts co según el nivel de dosis:
pequeño aumento en la circulación de FIX a por lo menos 1% de los bajo (2 × 10 11 genomas de vector [VG] por kilogramo de peso corporal),
niveles nor- males puede mejorar sustancialmente la purga - fenotipo termediate in- (6 × 10 11 vg por kilogramo), y alto (2 × 10 12 vg por
ing. kilogramo).

El estudio fue patrocinado por el Hospital de Investigación

En la actualidad, la transferencia de genes mediada por un vector Infantil St. Jude, y se llevó a cabo de forma independiente por los
ade- virus novirus-asociado (AAV) muestra la mayor promesa para la
corrección a largo plazo de he- mophilia B en el entorno preclínico. 3-7 Sin
NEJM.org, y con las disposiciones de las directrices de Buena
embargo, un combinado de fase 1 y 2 estudio que involucró vectores
AAV rotype SE- 2 basados ​en (AAV2) mostraron expresión sólo
transitoria de FIX y sugirieron que la expresión estable de niveles
terapéuticos de FIX puede estar limitado por una célula T citotóxica
específica de la cápside respuesta contra los hepatocitos
transducidos. 8,9
Hemos probado un enfoque para el tratamiento de pacientes con
hemofilia B severa que es distinto de los enfoques utilizados en los
ensayos clínicos previos de AAV transferencia de genes mediada en
tres spects re- importantes. En primer lugar, se desarrolló un casete de
expresión de FIX con codones optimizados (FIXco) que se empaqueta
como dímeros complementarias dentro de un único virión. Estos
vectores AAV auto-complementario (VAAac) median la expresión de los
transgenes a niveles sustancialmente más altos que hacer vectores de
cadena sencilla de AAV. 6,10 En segundo lugar, para eludir la posibilidad
de la inmunidad humoral a AAV, que pseudotyped estos vectores con
una cápside del serotipo 8 (AAV8), que tiene una seroprevalencia
inferior en los seres humanos que lo hace AAV2. 11,12 Finalmente, dado
que AAV8 tiene una fuerte PISM Tro para el hígado, hemos sido
capaces de administrar el vector en la vena periférica - un enfoque
simple, NO VIOLACIÓN vasive que es seguro para los pacientes con
diátesis hemorrágica. Sobre la base de nuestros datos de seguridad y
eficacia preclínica, se realizó una fase combinada com- 1 y 2 del ensayo
clínico de la transferencia de genes mediada por LP1-hFIXco scAAV2 /
8- en pacientes con hemofilia B. 6,7,10
autores de acuerdo con el protocolo, el cual está disponible en
Práctica Clínica.
La producción del vector y la Formulación
El vector viral, scAAV2 / 8-LP1-hFIXco, se ha descrito
previamente. 6,10 Fue fabricado y formulado en solución salina
tamponada con fosfato (PBS) suplementado con albúmina de
suero humano 0,25% en GMP de los Niños, en Memphis,
Tennessee, en AC- la concordancia con buenas prácticas de
fabricación y los requisitos reglamentarios. 13 El título de vector
informaron inicialmente se determinó por medio de un tiempo real
de la polimerasa-reacción en cadena cuantitativa ensayo validado,
(qPCR). 14 Estudios posteriores han demostrado que con el ensayo
qPCR, la presencia de la horquilla cerrada covalentemente en un
extremo de la AAVsc-vector ge- resultados Nome en una
subestimación del título por un factor de casi 10; Por lo tanto, las
dosis aquí presentados se basan en los títulos determinados por
un método que evita este problema y los resultados en más cura
AC- y fiable titulación vector-genoma del vector AAVsc (ver
Métodos en el anexo complementario). 15 Preparación y infusión del
vector se describen en el protocolo.
Las evaluaciones de seguridad y eficacia

Evaluaciones llevadas a cabo después de la infusión vector in- cluded

signos vitales, así como la actividad de FIX en plasma, anti-cápside y los
niveles de anticuerpos anti-FIX, derramando vector, y la respuesta inmune
celular. 8-10,16 EF

2358 med j N Engl 365; 25 nejm.org diciembre 22, 2011

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 Mediada por vector Transferencia de genes en la hemofilia B

ficacy se definió como la persistencia de camente biológicamente FIX de dos veces por semana profilaxis FIX (Fig. 1A). Este nivel era
activo a 3% o más de los niveles normales. sustancialmente más alto que su línea de base el nivel de actividad
FIX (<1% de los niveles normales) y es consistentes con la síntesis

resultados endógena de FIX. No tenía hemorragias espontáneas durante este

Características de los participantes del estudio
Seis hombres con hemofilia B severa (actividad FIX, <1% de los
valores normales) se inscribieron en virtud de un pro- tocolo aprobado
por la correspondiente comités de ética y las agencias reguladoras,
después de proporcionar el consentimiento informado por escrito.
Todos excepto uno de los participantes re- profilaxis ordinario
concebido con concentrados de FIX (dos o tres veces por semana)
antes de la transferencia de genes (Tabla 1). Participante 4 recibía
dirigido profilaxis (aproximadamente una vez por semana), que se
adaptan a sus actividades deportivas y el riesgo de sufrir lesiones
traumáticas. Participante 2 tenía una mutación nula en el gen FIX, y
Participante 6 tenía una mutación promotor; En consecuencia, ninguno y 3 semanas después de la última inyección de concentrado de FIX, su
de ellos tenía expresión de la proteína FIX. Los otros cuatro
participantes tenían mutaciones de sentido aborto espontáneo, lo que
resultó en los niveles plasmáticos normales de antígeno FIX pero
menos de 1% tividad AC- coagulación. Todos los participantes tenían
niveles modestos (>
período, pero se requiere profilaxis FIX en cinco ocasiones para
proporcionar protección en caso de lesiones accidentales y durante
la cirugía electiva.
En Participante 2, el nivel de FIX en plasma fue 1% de los niveles
normales de 18 días después de la transferencia de genes, que fue de
3 semanas después de su última inyección de concentrado FIX con-.
Aunque este nivel fue consistente con la síntesis endógena de FIX
transgénico, que con- tinued tener hemorragias espontáneas y reanudó
la profilaxis FIX regulares. Con el tiempo, se incrementó gradualmente
el intervalo entre las inyecciones de FIX profilácticas a 2 semanas, sin
hemorragias espontáneas. A las 23 semanas después de fer gen trans-
nivel de FIX en plasma fue del 2% de los valores normales, lo que
sugiere la síntesis de FIX endógeno en curso (Fig. 1B).

Seguridad y eficacia de la vena periférica-Infusión
de vector
No hay cambios inmediatos en los signos vitales No se observaron durante
o después de la infusión vector en cualquier participante, a pesar de la
persistencia del vector en ids con la influenza corporales (incluyendo
plasma) por hasta 15 días después de la transferencia de genes (Fig. 1 en
el anexo complementario). No hubo cambios clínicamente significativos en
los valores químicos ron Se- (incluyendo enzima hepática lev- els) en
cualquier participante para las primeras 6 semanas después de la infusión
vector (Fig. 2 en el pendix complementario PA-). Se han reportado eventos
Intermedio-Dose Group
En Participante 3, el nivel de actividad FIX en plasma deriva
constantemente hacia abajo por debajo de 1% de los valores
normales en ausencia de concentrado de FIX durante las primeras 5
semanas después de la infusión de 6 × 10 11 vg de scAAV2 /
8-LP1-hFIXco por kilogramo. Este cambio planteó la posibilidad de
que la ducción trans- de los hepatocitos fue bloqueada debido a que
el nivel de anticuerpo anti-AAV8 antes de la transferencia de genes
fue mayor en este participante que en los otros participantes (Tabla
1). Sin embargo, con el tiempo, partici- pant 3 extendió el período
entre las inyecciones FIX profilácticos a 2 semanas. Entre las
semanas 20 y

adversos Tres: ane- mia desarrollado en los participantes 1 y 2 a los 5 y 7
semanas, respectivamente, después de la transferencia génica, y Par-
partici- 3 tenido un período transitorio de la bradicardia a las 16 semanas
después de la transferencia de genes, cuando se estaba preparando para
la cirugía en la rodilla izquierda (véase el apéndice complementario SUP-
para más detalles).
Grupo de dosis baja
En Participante 1, después de la eliminación inicial de exog- administra
enously proteína FIX, FIX plasma ac- tividad estabilizó en 2% de los
niveles normales en el día 14 después de la infusión de 2 × 10 11 vg de
scAAV2 / 8-LP1- hFIXco por kilogramo. actividad FIX se mantuvo
relativa- mente estable a este nivel durante más de 16 meses después
de la transferencia de genes, a pesar de la interrupción
33, que no recibieron profilaxis FIX y permanecieron libres de
sangrado espontáneo. Durante este período, su nivel de FIX en
plasma fue entre 1 y 3% de los valores normales, que es
coherente con la síntesis endógena de proteínas transgénicas
(Fig. 1C).
los niveles de FIX Plasma en Participante 4 aumentó de un valor de
referencia de menos de 1% de los valores normales a un máximo de 4%
4 semanas después de gen trans- fer. expresión FIX se mantuvo a este
nivel durante casi 3 meses antes de disminuir a 2 a 3% de los valores
normales (Fig. 1D). La razón de este descenso es UN- claro, ya que los
resultados de las pruebas de función hepática re- mained en el rango
normal, y ensayos para anticuerpos anti-FIX tralizing neu- fueron
consistentemente negativos. A pesar de esta caída de la actividad FIX,
que no tenía episodios de sangrado, a pesar de que se involucró en
actividades físicas que habían provocado anteriormente

med j N Engl 365; 25 nejm.org diciembre 22, 2011 2359

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 2360
Tabla 1. Características de los participantes del estudio Seis al inicio del estudio y después de la transferencia génica, de acuerdo con la dosis de vector. *

Característica Vector Dosis, 2 × 10 11 VG / kg Vector Dosis, 6 × 10 11 VG / kg Vector Dosis, 2 × 10 12 VG / kg

participante 1 participante 2 participante 3 participante 4 participante 5 participante 6

En la línea de base

Edad (años) 31 64 43 29 32 27
Los

Mutación en el gen FIX 31280G → A E387K eliminación 2BP, cambio de marco 30097G → T W215C 31290G → A A309T 20518C → T R180W -52 C del

profilaxis FIX Dos veces semanalmente Dos veces semanalmente Dos veces semanalmente Targeted (media, semanal) Dos veces semanalmente tres veces por semana

estado de la hepatitis C Negativo Positiva, espontánea Positiva, con espacio libre Positiva, espontánea Positiva, con espacio libre Negativo
despeje interferón más la terapia despeje interferón más la terapia
anti-viral anti-viral

Título de anticuerpos (unidades relativas) †

AAV2 IgG 5 20 77 12 10 22

AAV8 IgG 1 12 37 1 5 8
New Engl y el diario de medicina

Después de la transferencia de genes

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Nivel máximo FIX (UI / dl) ‡ 2 2 3 4 8 12

med j N Engl 365; 25 nejm.org diciembre 22, 2011

Duración de la expresión FIX (MO) > 15 > 11 >9 >8 >6 >5

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FIX expresión en in vivo 138 116 42 109 92 93
ensayo de transducción de inhibición (% del
valor control) §

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valor alanina aminotransferasa Pico 36 20 39 34 202 36
(UI / litro) ¶

* FIX marca el factor IX, y genomas vg vectoriales.

† El límite inferior de detección para el serotipo-2 de virus asociado a adenovirus anticuerpos (AAV2) IgG fue de 3 unidades relativas; el límite inferior de detección para el serotipo-8 de virus asociado a adenovirus anticuerpos (AAV8) IgG fue de 1 unidad relativa. ‡
El límite inferior de detección fue de 1%. § El límite inferior de detección fue de 0,7%.

¶ El límite superior del rango normal es de 41 UI por litro.

 Mediada por vector Transferencia de genes en la hemofilia B

UN participante 1 segundo participante 2

FIJAR FIJAR

7 30
6 20

10
FIX (UI / dl)

FIX (UI / dl)

4
8
3
6
2
4
15 2

00 00
20 10 30 40 50 60 70 20 10 30 40 50

Semanas después de Vector Infusion Semanas después de Vector Infusion

do participante 3 re participante 4

FIJAR
FIJAR

9
8
8
7
6
6
FIX (UI / dl)

FIX (UI / dl)

4 4
3
2 2
15
00 00
20 10 30 40 10 20 30

Semanas después de Vector Infusion Semanas después de Vector Infusion

mi participante 5 F participante 6
Pred Pred
FIJAR 60 mg
FIJAR
60 mg
0 0

12
200 200
10 ALT 15
150 150
8
ALT (UI / litro)

ALT (UI / litro)

FIJAR
FIX (UI / dl)

FIX (UI / dl)

10
6 100 100

4 FIJAR
5
50 50
2 ALT

00 0 00 0
10 20 30 10 20

Semanas después de Vector Infusion Semanas después de Vector Infusion

Figura 1. El factor IX (FIX) Actividad después periférica venosa Infusión del virus asociado a adenovirus (AAV) en los participantes del estudio Seis.

Se utilizó un ensayo de coagulación de una etapa para determinar la actividad de coagulación FIX en puntos de tiempo especificados previamente (flechas) después de la
administración del vector de AAV (scAAV2 / 8-LP1-hFIXco). Los paneles A y B muestran los niveles de FIX en los participantes 1 y 2, respectivamente, que recibió la dosis
baja de vector (2 × 10 11 genomas de vector [VG] por kilogramo de peso corporal). Los paneles C y D muestran los niveles de FIX en los participantes 3 y 4,
respectivamente, que recibieron la dosis intermedia de vector (6 × 10 11 vg por kilogramo). Los paneles E y F muestran ambos niveles FIX y alanina aminotransferasa (ALT)
niveles en los participantes 5 y 6, respectivamente, que recibió la dosis alta de vector (2 × 10 12 vg por kilogramo). También se muestra la duración del tratamiento con
prednisolona (Pred), que se inició a una dosis de 60 mg por día y luego disminuya gradualmente,.

episodios de este tipo (por ejemplo, jugar al fútbol y el cricket sin haber Las dosis altas de grupo

recibido profilaxis dirigidas). Aproximadamente el 9 semanas después de la Catorce días después de la infusión periférica-vena de 2 × 10 12 vg de
transferencia de genes, sin embargo, él recibió un bolo de concentrado de scAAV2 / 8-LP1-hFIXco por kilogramo (17 días después de la última
FIX para prevenir el sangrado severo después de una caída. infusión de concentrado de FIX), el nivel de FIX en plasma en
Participante 5 fue del 7% de

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ing debido a lesiones traumáticas sufridas durante un viaje reciente

2500 campo geológico.

AAV8 IgM específica 150
En Participante 6, la expresión de FIX plasma re- mained entre 8 y
2000 12% de los niveles normales Duran- un período de 8 semanas después

Anti-AAV8 anticuerpos IgM

Anti-AAV8 anticuerpos IgG

de la administración del vector. Él fue capaz de detener la profilaxis FIX

(unidades relativas)

(unidades relativas)
el total de IgG 100
1500
incluso mientras se estaba entrenando para un maratón. medidas tory
clínicos y de labora- permanecieron dentro del rango normal hasta la
1000
50 semana 9 (día 62 después de la transferencia de genes), cuando los
IgG1
500 valores de aspartato aminotransferasa y alanina aminotransferasa más
o menos se duplicó, en comparación con los niveles de referencia (con
00 0 tanto alcanzando 36 IU por litro). Este cambio siguió un fin de semana
50 100
de la actividad física intensiva, que incluyó la participación en una
Días después de la inyección del vector
media maratón, y se asoció con un aumento en el nivel de lactato
deshidrogenasa (a 523 UI por litro; rango normal, 240 a 480). Cuando
Figura 2. Respuesta inmune humoral en Participante 1. la actividad de FIX se negó a 5% de los niveles normales, Participante
El perfil de la respuesta inmune humoral en Participante 1 es representativa de las respuestas observadas
6 también comenzó un curso corto (4 semanas) de prednisolona por
en los otros participantes. Las muestras de plasma obtenidas después de la infusión venosa periférica del
sospecha de aclaramiento de hepatocitos mediada inmune después de
vector scAAV2 / 8-LP1-hFIXco se analizaron con el uso de un ensayo de inmunoabsorción ligado a
otras posibles causas se han descartado. Los niveles de
enzimas para la presencia de anticuerpos AAV8-IgM específicos, los anticuerpos IgG totales, y los isotipos
de IgG. Se muestran los datos de isotipo IgG1. los niveles de IgG2 e IgG4 no aumentó por encima de la aminotransferasa devueltas posteriormente a los valores basales, y fijar
línea de base (datos no mostrados). expresión se mantuvo en un nivel que fue entre 8 y 12% de los valores
normales (Fig. 1F). Sin embargo, incluso en su pico, los niveles de
enzimas hepáticas en Participante 6 permanecieron por debajo del
límite superior del rango normal y por lo tanto no cumplir los criterios de
los valores normales, y este nivel se mantuvo ONU-til semana 7 sin la un evento adverso.
administración de trar concen-. En el día 49 después de la infusión vector,

los niveles de aminotransferasa y alanina aminotransferasa aspartato

fueron elevados, alcanzando picos de 143 y 202 UI por litro,

respectivamente, a los 58 días (límite superior del rango normal, 37 y 41 UI

por litro, respectivamente ). Él era asintomático, con niveles bin biliru-

normales y tiempo de protrombina, pero el nivel de FIX en plasma se redujo Las respuestas inmunes a Vector y Transgene

a 3% de los valores normales (Fig. 1E). Después de descartar posibles Los anticuerpos neutralizantes para FIX no se hayan detectado en
causas de esta reducción, tales como las respuestas autoinmunes, factores cualquier punto de tiempo en cualquier participante. Las carac- terísticas

tóxicos (al- cohol, drogas o toxinas), o causas virales infecciosas (hepatitis
A, B, C o E, virus de herpes simplex, virus de Epstein-Barr virus,
citomegalovirus, virus de la inmunodeficiencia humana, o el tipo virus
T-linfotrópico humano I o II), se consideró una respuesta inmunológica a
scAAV2 / 8-LP1-hFIX como un potencial aplanamiento ex para la lesión
cinéticas de la respuesta inmune humoral a la cápside AAV8 fueron
similares en todos los seis participantes y fueron consistentes con una
respuesta inmune primaria a AAV8 (Fig. 2 y en la Tabla 1 y los resultados
en el anexo complementario).

hepática. Esto fue reportado como grado 3 evento adverso relacionado con
el agente del estudio. El tratamiento con prednisolona se inició en el día 58
a una dosis de 60 mg por día, con la posterior Pering ta- de la dosis, lo que
reduce rápidamente aminotransfer- niveles de ASE. Nueve semanas
después de la terapia de glucocorticoides se suspendió, la expresión del
transgen persistió a nivel de 3%, y los resultados de las pruebas de función
hepática se mantuvo en el intervalo normal. El paciente estaba libre de
hemorragia espontánea durante más de 6 meses después de la
transferencia de genes, pero requiere tres bolos de concentrado de FIX
para evitar bleed- El tratamiento con prednisolona se inició en el día 58 a
una dosis de 60 mg por día, con la posterior Pering ta- de la dosis, lo que
reduce rápidamente aminotransfer- niveles de ASE. Nueve semanas
después de la terapia de glucocorticoides se suspendió, la expresión del
transgen persistió a nivel de 3%, y los resultados de las pruebas de función
hepática se mantuvo en el intervalo normal. El paciente estaba libre de
T-célula mediada por la respuesta inmune al transgén FIX o de los
productos putativos de traducción de marcos de lectura abiertos
alternativos en el ADN complementario FIX mized codón-opti- 17 no fueron
detectable capaz en cualquiera de los participantes (datos no
mostrados), tal como se determina con el uso de un interferón-γ en-
Zyme inmunoabsorbente ligado a detectar (ELISPOT) as- decir. El
mismo ensayo mostró que los participantes en la cohorte de dosis baja
no tenían respuestas de células T-cápside específica significativa AAV8-
después gen trans- fer. En el nivel de dosis intermedia, se observó un
aumento significativo en la frecuencia de células T
AAV8-cápside-específico. En particular, el Participante 3 tenía
reactividad de células T a la cápside AAV hasta la semana 33 después
de la transferencia de genes (Fig. 3), y Participante 4 tenía una
respuesta de células T-cápside específica muy fuerte

hemorragia espontánea durante más de 6 meses después de la transferencia de genes, pero requiere tres bolos de concentrado de FIX para evitar bleed- El tratamiento con pr

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UN participante 1 segundo participante 2

700 700

600 600

500 500
SFU por 10 6 PBMCs

SFU por 10 6 PBMCs

400 400

300 300

200 200

100 100

0 0
0 1 2 3 4 y cinco sesenta 7 0 1 2 3 y cinco
sesenta 87 10 9

Semanas Semanas

do participante 3 re participante 4
700 1700

600 600

500 500
SFU por 10 6 PBMCs

SFU por 10 6 PBMCs

400 400

300 300

200 200

100 100

00 00
1 2 3 4 6 7 8 9 11 12 33 1 2 3 4 y cinco
sesenta 12 9 8 7 28

Semanas Semanas

mi participante 5 F participante 6
700 700

600 600

500 500
SFU por 10 6 PBMCs

SFU por 10 6 PBMCs

400 400

300 300

200 200

100 100

01 001234
2 3 4 5 6 8 9 10 12 13 20 21 y cinco
sesenta 10 11 12 14 9 8 7 15

Semanas Semanas

Figura 3. Respuesta inmune celular en los participantes del estudio Seis.

Los resultados del ensayo punto de inmunoabsorción ligado a enzimas interferón-γ para respuestas de células T-cápside específica se muestran como el número máximo de unidades formadoras de
manchas (SFU) por 1 millón de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) en respuesta a AAV8- reservas de péptidos de la cápside. Las líneas horizontales en cada panel representan el umbral
para la positividad, definido como tres veces la respuesta de células T para el control negativo (medio solamente) y como al menos 50 SFU por 1 millón de PBMC. los niveles de enzimas hepáticas estaban
elevadas en Participante 5 en las semanas 8 y 9 y en Participante 6 en la semana 9. En Participante 6, mala recuperación de células y la viabilidad se observaron en las semanas 4 a 8.

en la semana 2 (alrededor de 1700 unidades formadoras de manchas servido en Participante 5, comenzando en la semana 5 después de la
[SFU] por 1 millón de células mononucleares de sangre periférica transducción y alcanzando un pico de más de 500 SFU por 1 millón de
[PBMCs]). En el nivel de dosis más alta, un aumento en las células T PBMC por semana 8, que era concomitante con el aumento de las
AAV8-cápside-específicos circulantes fue ob- enzimas hepáticas

med j N Engl 365; 25 nejm.org diciembre 22, 2011 2363

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los niveles. En este participante, se observó amplia reactividad a través de jadear 4 a las 2 semanas después de la transferencia génica. 8,19,20 No
las reservas de péptidos de seis cápside as- sessed (Fig. 3 en el anexo hubo evidencia de daño hepatocelular en este participante, lo que
complementario). En la semana 10, las células T específicas de la cápside sugiere que el repertorio de células T en la sangre periférica puede ser
fueron una vez más indetectable. No reactividad de las células T a la sid distinta de la que en el hígado o que los hepatocitos de clase niveles de

AAV cap- era detectable en PBMCs de Participante 6 hasta la semana 8 AAV8-cápside-antígeno pre- sentación en

después de la transferencia de genes, aunque esto puede haber sido major-histocompatibilidad-complejo I eran insuficientes para conducir el

debido en parte a la recuperación celular reducida y viabilidad. En las aclaramiento inmune mediada por las células transducidas. Se observó

semanas 9 y 10, las células T-cápside específica se convirtieron detectable, un escenario consistente con la destrucción mediada por células T

con niveles de hasta aproxima- damente 200 SFU por 1 millón de PBMC, AAV8-cápside-específica de citos hepatocitos transducidos 7 semanas

un ing hallazgo que era concomitante con el aumento menor en los niveles después de la transferencia de genes en Participante 5. Es menos cierto

de enzimas del hígado. si el pequeño aumento en los niveles de enzimas hepáticas 9 semanas
después de la transferencia de genes en Participante 6 era debido a
inmuno destrucción mediada de los hepatocitos transducidos. Este
aumento se produjo después de un período de esfuerzo físico intenso,
que se sabe que aumenta notransferase AMI- y los niveles de lactato
Discusión
deshidrogenasa. 21,22

El desarrollo y uso generalizado de concentrados de factores

coagulantes para el tratamiento de IA hemophil- en la década de 1970
mejoró considerablemente la esperanza de vida de los pacientes con En tanto Participante 5 y Participante 6, el ción iniciativa de la terapia de
la enfermedad. el desarrollo subsiguiente de concentrados de factores prednisolona fue seguido por un retorno de los niveles de
de coagulación recombinantes ha mejorado su perfil de seguridad, aminotransferasa a los valores basales y la desaparición de las células
pero aún hay un gran interés en gías de tratamiento estrate- que T de la cápside específica de la sangre periférica. Posiblemente, esto
eliminaría la necesidad de infusiones intravenosas a largo plazo y que podría haber ocurrido sin tratamiento con glucocorticoides, ya que a las
estaría disponible a la población con hemofilia en todo el mundo. Este 7 semanas después de la transferencia de genes, muchos de los
estudio documenta un paso crítico hacia ese objetivo y muestra que hepatocitos transducidos se habrá despejado el voking pro- AAV8
sufrieron expresión terapéutica de que se puede lograr en el ser péptido de la cápside a través de la degradación proteolítica pro- natural
humano un gen del factor IX transferido. El aumento en los niveles de y por lo tanto escapar eliminación por las células T efectoras.
FIX en nuestros participantes en el estudio era aproximadamente
dependiente de la dosis, con la dosis alta del vector scAAV2 / 8-LP1-
hFIX (2 × 10 12 vg por kilogramo) la mediación de pico de expresión a Los diferentes resultados de la transferencia de genes en los
las 8 a 12% de los niveles normales. Después de la administración de participantes en este estudio y en el juicio anterior de la terapia génica de
la vena periférica de scAAV2 / 8-LP1- hFIXco, cuatro de los seis la hemofilia B AAV2 8 sugieren que, además de la dosis del vector AAV,
participantes fueron capaces de detener el uso de la profilaxis con otros factores tales como las variaciones individuales en el
concentrado de FIX con- fuera de tener hemorragia espontánea, procesamiento y presentación de antígenos, así como la exposición a
incluso cuando se llevaron a cabo actividades que habían provocado AAV de tipo salvaje, parecen influir en el tipo y la magnitud de la
bleed- ING en el pasado. Para los otros dos participantes, el intervalo respuesta inmunológica a las partículas de vector de AAV. 23

entre las inyecciones profiláctico de concentrado de FIX fue extendido,

pero la profilaxis no fue completa- mente suspendió. Estos dos
participantes tuvieron graves artropatía hemofílica preexistente.
protección mal Maxi de sangrado en este subgrupo puede requerir
una mayor expresión endógena de FIX. 18
Ninguno de los participantes tenía una respuesta inmunológica al
producto FIX transgén. Como se informó en los estudios anteriores, la
cinética y la magnitud de las respuestas de células T-cápside
específica en PBMCs fueron muy variables en nuestro estudio, con el
mayor nú- mero de células T-cápside específica detectada en parti-
Es muy importante identificar estos factores modificadores
inmunológicos, así como para determinar la frecuencia de las
elevaciones clínicamente significativas en los niveles de
aminotransferasas después de la transferencia génica. SIN
EMBARGO, esto requerirá un mayor número de partici- pantes
tratados en el nivel de dosis alta. Actualmente, no creemos que el uso
rutinario de un curso de glucocorticoides profiláctico está indicado, ya
que la incidencia y el momento de vaciones ele- autoinmunes en los
niveles de aminotransferasas son inciertos, mientras que la
intervención temprana, cuando sea necesario, parece ser eficaz en la
frenar la respuesta inmune a los hepatocitos transducidos.
En resumen, hemos encontrado que una sola infusión de pe-
ripheral-vena de nuestra scAAV2 / 8-LP1-hFIXco

2364 med j N Engl 365; 25 nejm.org diciembre 22, 2011

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 Mediada por vector Transferencia de genes en la hemofilia B

vector conduce sistemáticamente a la expresión a largo plazo del
transgén FIX a niveles terapéuticos, sin aguda o de larga duración
toxicidad en pacientes con mediada inmune hemofilia grave B.,
elevaciones inducidas AAV-capsid- en los niveles de
aminotransferasas RE- una preocupación principal, pero nuestros
datos sugieren que este proceso puede ser controlado por un curso
Las opiniones expresadas en este artículo son las de los autores y no
necesariamente las del Servicio Nacional de Salud (NHS), el Instituto Nacional de
Investigación en Salud (INDH), o el Departamento de Salud del Reino Unido.
Apoyado por becas de la INDH (RP-PG-0.310 a 1.001), el Consejo de
Investigación Médica, el Katharine Dormandy Trust, el Departamento de Salud del
Reino Unido, NHS Sangre y Trasplantes, los Centros de Investigación Biomédica
(NIHR a la University College London hos- pital y la University College London), la

corto de glucocorticoides, sin pérdida de Sion transgén expre-. El
seguimiento de un mayor número de pacientes por períodos más
largos de tiempo es necesaria para definir completamente los
Fundación ASIS de Memphis, los libaneses estadounidenses Caridad Asociada
sirios, el Instituto Médico Howard Hughes, del Instituto Nacional del corazón, pulmón
y la sangre (HL094396), el Fondo de Síndicos Caridad especial Royal Free hospital
35, la Real Free hospital NHS Trust, y el hospital de Investigación Infantil St. Jude.

beneficios y riesgos y optimizar la dosificación. Sin embargo, este

enfoque de la terapia génica, incluso con el riesgo asociado de
formularios de divulgación proporcionados por los autores están disponibles con el texto completo
disfunción hepática transitoria ción, tiene el potencial de convertir el de este artículo en NEJM.org.

fenotipo severo ing bleed- en una forma leve de la enfermedad o Agradecemos a todos los participantes en el estudio por su interés y partici- pación en este
estudio y Patricia Lilley, Anja Griffioen, Cheng-Toh Hock, Paul Eddlemon, Alison Evans, Paul
revertir por completo.
Lloyd-Evans, y Keith Williams por su ayuda con las actividades relacionadas con el estudio ,
incluyendo la importación de vectores y calificación, la entrada de datos y asuntos regulatorios.

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