HOMOGENIZACIÓN

DE TEJIDOS

Los tejidos son ricos en proteínas las cuales tienen características propias y por ende cumplen
diferentes funciones. Según las características de las proteínas son posibles solubilizarlas,
separarlas y purificarlas mediante diversos métodos.

El primer paso en la purificación de la mayoría de las proteínas y estructuras subcelulares es la

rotura de los tejidos o de las células para obtener un “lisado” celular en el que la proteína, el
complejo multiproteico o la estructura subcelular se encuentre en condiciones que permitan su
aislamiento. Esto se consigue homogenizando el tejido empleando procedimientos mecánicos
suaves. Estos métodos producen la rotura de las membranas celulares, suavemente, con lo que se
libera el contenido celular, dentro de los que se encuentran: shock osmótico, mortero (fricción) y
sonicación.

Lisis celular. Válido para células sin pared celular como las células de tejidos animales, pero no es
suficiente para células vegetales o bacterias. Consiste en suspender las células en una solución
hipotónica (más diluida que el interior celular). Debido a la diferencia osmótica el agua difunde al
interior de la célula, causando su hinchamiento y rotura.

Destrucción mecánica. Entre estos métodos se encuentran la homogenización (hacer pasar las
células entre un tubo y un pistón de vidrio que ajustan casi totalmente); moler en un mortero y la
sonicación (someter las células a vibraciones de ultrasonido).

Congelación-descongelación. La rotura se produce al someter las células a un cambio brusco de

temperatura, congelando primero a -196 ºC (con nitrógeno líquido) y pasándolas rápidamente a
temperatura ambiente (25 ºC).

Tras la rotura o bien, si se requiere, durante el proceso de rotura, se utilizan tampones de

extracción para solubilizar las proteínas. Pueden utilizarse como tales, soluciones acuosas de
tampones específicos para proteínas solubles o bien que contengan además detergentes si se
pretende purificar proteínas asociadas a membranas.

Una vez que la proteína se ha extraído de su entorno natural está expuesta a muchos agentes que
pueden dañarla. Los cambios bruscos de pH, ácidos y bases fuertes, temperaturas extremas y la
acción de las proteasas (enzimas que hidrolizan los enlaces peptídicos) son los principales factores
que pueden desnaturalizar las proteínas. Para evitar o minimizar estos factores la manipulación de
las proteínas durante el proceso de purificación suele llevarse a cabo en disoluciones tamponadas,
a bajas temperaturas (4ºC) y se procura que el proceso sea lo más corto posible, además en
ocasiones es necesario añadir el tampón de extracción agentes protectores de grupos funcionales
específicos de la proteína o bien inhibidores de proteasas.

El resultado de todos estos tratamientos es un lisado u homogenado que contiene una mezcla de
enzimas, membranas y células rotas. Esta preparación se somete a centrifugación (10.000 – 15.000
rpm) para eliminar los restos celulares y separar, el sobrenadante, que contiene las proteínas
solubles, del precipitado que además de restos celulares también contienen proteínas asociadas a
membranas y que para solubilizarlas requiere un tratamiento adicional con detergentes. En
cualquier caso, la fase soluble (con o sin detergente) constituye el extracto crudo donde se
encuentra la proteína de interés objeto de la purificación. A la hora de centrifugar hay que tener
en cuenta que la centrífuga sea refrigerada, balancear los tubos y asegurarse siempre que los
rotores estén fijos.

Actividades

Realización de un protocolo para la homogenización de tejido y solubilización de proteínas

Homogenización de tejido

1) Extraer tejido de plátano

2) Poner en un mortero y homogenizar, moliendo por completo.

3) Mezclar con el buffer en un tubo falcón en una relación 1:5 (v/v)

4) Homogenizar con vortex

5) Alícuotar en Tubos eppendorf de 1,5 ml.

6) Centrifugar a 12000 rpm por 20 minutos

7) Rescatar sobrenadante

8) Conservar a -20°C.
 CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
Una de las operaciones más frecuentes utilizadas en los laboratorios de investigación es la
determinación de la concentración total de proteínas presentes en una preparación. El método a
seguir para determinar la cantidad de proteínas presentes en la muestra va a depender de las
características de la muestra, rango de detección, tolerancia a diferentes interferentes y
sensibilidad del método. Los diferentes métodos existentes pueden detectar las proteínas
mediante la absorción de luz en UV, unión a colorantes o formación de complejos. Los métodos
más usados son: Biuret, BCA, Lowry y Bradford.

Método de Biuret

Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces
peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es
directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante
específica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy baja y
sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados (por
ejemplo en suero).

Método de BCA

El ácido bicinconínico, sal sódica, es un compuesto capaz de formar un complejo púrpura intenso
con iones Cu1+ en medio alcalino. Este reactivo forma la base de un método analítico capaz de
monitorizar el ión cuproso producido en una reacción entre las proteínas con Cu2+ en medio
alcalino (reacción de Biuret). La estabilidad del reactivo y el cromóforo proporciona un método
para la cuantificación de proteínas que es sencillo, rápido, muy sensible, y que muestra una gran
tolerancia a compuestos que afectan a otros métodos.

Método de Bradford

El método de Bradford es muy utilizado, el ensayo se basa en la observación del cambio de

absorbancia máxima de la solución ácida Azul de Comassie Brillante que varía de 465 a 595 nm
cuando ocurre la unión con la proteína. Esta unión se debe a la estabilización de la forma aniónica
del colorante mediante interacciones hidrofóbicas e iónicas, causando un cambio visible de color.
Este método es sensible, simple, rápido, barato y pocas sustancias interfieren en su
determinación. Entre las sustancias que interfieren están los detergentes y las soluciones básicas.
En estos ensayos se requiere la realización de una curva de calibración para la determinación de la
concentración de proteínas de una muestra, utilizándose comúnmente BSA (albumina de suero
bovino) como proteína patrón. Existen otros métodos como se resumen en la siguiente tabla

ACTIVIDAD PRÁCTICA

Construcción de la curva de calibrado con BSA

• Se preparan 100 μl de cada dilución de acuerdo a la siguiente tabla.

• El stock de BSA utilizado estará a 1 μg/μl.

• Se transfieren las soluciones a cubetas espectrofotométricas.

• Se agregan 1000 μl de reactivo de Bradford a cada cubeta.

• Se sellan las cubetas con parafilm, se homogeniza la solución y se deja reaccionar por 3 minutos.

• Se mide la absorbancia de cada cubeta a 595 nm.

• Se construye una regresión lineal graficando Absorbancia v/s Concentración de BSA.

Determinación de la concentración de proteína total en la muestra

• Se agregan 100 μl de cada muestra de proteínas a cubetas espectrofotométricas (si están muy
concentradas se deben hacer diluciones).

• Se agregan 1000 μl de reactivo de Bradford.

• Se sellan las cubetas con parafilm, se homogeniza la solución y se deja reaccionar por 3 minutos.

• Se mide la absorbancia de cada cubeta a 595 nm.

• Se calcula la concentración total de proteína, interpolando la absorbancia de la muestra en la

curva estándar. El intercepto (n) debe ser cero.

Donde: y= absorbancia

x= concentración de proteína.

y = mx + n

BIBLIOGRAFIA

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