TEMA: Métodos y técnicas de diagnóstico de hongos de la piel en Ranas.

OBJETIVO GENERAL:
 Conocer las diferentes técnicas de diagnóstico las cuales nos ayudaran
para saber los diferentes tipos de hongos en la piel de las ranas.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Conocer los diferentes tipos de nombres y tipos de hongos que se
producen en la piel de las ranas.
 Conocer los cuidados que deben tener la rana.
 Distinguir los diferentes tipos de hongos

INTRODUCCIÓN
Hace ya casi dos décadas que la extinción repentina y catastrófica de los
anfibios en varias regiones del mundo pasaron a la palestra pública, sin que
hubiera una reacción inmediata frente a la crisis. El escepticismo inicial,
paradójicamente generado por la idiosincrasia científica, al pasar de los años
pasaría una factura actualmente impagable: cientos de especies de ranas,
sapos y salamandras cuyas poblaciones aún mantenían unos pocos individuos
remanentes se extinguieron. Durante las últimas décadas, el aumento en la
prevalencia de las infecciones fúngicas ha sido constante, relacionado
fundamentalmente con el incremento de pacientes inmunocomprometidos y
con el uso generalizado de antimicrobianos, la utilización de inmunosupresores,
maniobras diagnósticas invasoras y la implantación de alimentación parenteral.
Junto a estas micosis invasoras, que podríamos llamar oportunistas, coexisten
otras micosis, que podríamos considerar primarias, causadas por hongos muy
adaptados para la supervivencia en los tejidos infectados. Algunas de ellas se
comportan como micosis profundas, y se caracterizan porque se distribuyen en
determinadas zonas geográficas, donde resultan endémicas. Otras, ubicuas, se
caracterizan por afectar a piel y mucosas: se trata de las dermatomicosis y
candidosis de las mucosas. Con menos frecuencia, se encuentran las micosis
subcutáneas, caracterizadas por la agresividad local y poca tendencia a la
diseminación a distancia, y que suelen contar con antecedentes traumáticos
que justifican la inoculación del hongo
Las pruebas de sensibilidad a los antifúngicos están basadas en las técnicas
de microdilución en caldo, que se desarrollaron para conocer la actividad in
vitro de los antibacterianos. Estas técnicas determinan la CMI (concentración
mínima inhibitoria), que se obtiene calculando porcentajes de inhibición
respecto a un control de crecimiento. Los estándares incluyen
recomendaciones para la conservación, la preparación y la interpretación de las
pruebas, así como un sistema para controlar la calidad de los resultados. La
introducción de estas
técnicas produjo un cambio cualitativo en los estudios de sensibilidad a los
antifúngicos. Por primera vez se disponía de métodos reproducibles para
detectar la resistencia in vitro a estos antimicrobianos, por lo que se podía
evaluar su utilidad clínica. La aplicabilidad práctica de una técnica de
determinación de sensibilidad reside en la fiabilidad de sus resultados; si estos
no son reproducibles no pueden establecerse puntos de corte que guíen las
recomendaciones terapéuticas. Además, la aparición de estos estándares ha
permitido diseñar y validar varios métodos de difusión en agar y técnicas
comerciales para realizar pruebas de sensibilidad a los antifúngicos, que
pueden utilizarse para detectar la resistencia a los azoles, particularmente la
resistencia a fluconazol en levaduras, que es el reto asistencial más destacable
en este campo.
DESARROLLO
El patógeno causante de la quitridiomicosis es Batrachochytrium dendrobatidis,
(Bd) (Longcore et al., 1999), un hongo que pertenece al Phylum
Chytridiomycota, Clase Chytridiomycetes y Orden Chytridiales .Este hongo es
único ya que es uno de los dos Chytridiomycota que parasitan vertebrados y el
único que parasita anfibios. Este hongo degrada la queratina, 6 invadiendo el
stratum corneum y granulosum de la epidermis en anfibios postmetamorfos y
los dentículos en renacuajos y es el único que tiene una zoospora flagelada
móvil. El pH óptimo para el crecimiento de Bd es de 6.0 a 7.5, pero también
puede crecer en un pH entre 5–8. El hongo se desarrolla entre los 4° y 25° C y
se reproduce con mayor rapidez a 17–25° C. Temperaturas mayores a 30° C
matan al hongo demostraron que a pesar de que el crecimiento es más lento
bajo 17° C, el número de zoosporas producidas por talo aumenta, y por lo tanto
el crecimiento de la población en el huésped puede mantenerse entre 10 y 25°
C. También encontraron que cuando la temperatura disminuye bruscamente se
estimula la liberación de zoosporas. Berger (2001) y Johnson et al., (2003)
sostienen que dado que las zoosporas no tienen pared pueden sucumbir por
desecación. Por esta razón Bd requiere agua para su reproducción y para estar
activo. El ciclo de vida es una progresión desde la zoospora hasta el talo que
produce un único zoosporangio. El ciclo tiene dos estadios: la zoospora móvil,
acuática de corta vida, para la dispersión, y el talo estacionario, el cual se
desarrolla en zoosporangio para la reproducción asexual. Después del periodo
de motilidad (24h) las zoosporas se enquistan, reabsorben el flagelo, forman un
germling (esporangio joven), y aparecen rizoides de una o más áreas. El talo se
hace más largo y se convierte en esporangio maduro a los 4 o 5 días. Dentro
del talo ahora ya llamado zoosporangio se forman zoosporas mientras se forma
el tubo de descarga, después las zoosporas son liberadas. La duración del
ciclo de vida in vitro es de 4 a 5 días a 22° C y se asume que es el mismo en la
piel de los anfibios (Berger et al., 2005). Batrachochytrium dendrobatidis podría
reproducirse también por fertilización cruzada o por recombinación sexual. La
reproducción sexual inicia la producción de esporangios resistentes que le
permitirían 7 dispersión a larga distancia y mantenerse un mayor tiempo fuera
del huésped.
EFECTOS DE Bd EN LOS ANFIBIOS
El hongo no se distribuye en toda la superficie del cuerpo de los anfibios
infectados. Se lo encuentra en el stratum corneum de los dedos, en la parte
ventral (los muslos y la región inguinal) y con menor frecuencia en la región
dorsal. Los síntomas clínicos de la quitridiomicosis se manifiestan de tres
maneras en adultos: cambios comportamentales, señales neurológicas
(letargia, falta de apetito, postura anormal) y lesiones en la piel. Produce
hiperplasia de la epidermis, desorden en la posición de las células, y
desprendimiento de piel, pero rara vez se observan lesiones visibles a simple
vista. Las infecciones más severas se han encontrado generalmente en el
parche pélvico y en las membranas entre los dedos. La quitridiomicosis
generalmente no mata a los renacuajos; los síntomas solo se visualizan en la
parte queratinizada localizada en la región oral, encontraron anomalías
incluyendo despigmentación y pérdida de los discos orales, despigmentación
de la mandíbula superior e inferior y una hinchazón de las papilas labiales.
Para explicar como un hongo que está restringido a la superficie de la
epidermis tiene la capacidad de matar a los sapos Voyles et al., (2009) afirma
que Bd impide la función osmorreguladora provocando un desbalance de
electrolitos causando finalmente un paro cardíaco.
MECANISMO DE INFECCIÓN
La infección por Bd puede transmitirse entre animales por contacto entre ellos o
con zoosporas móviles vehiculadas con el agua. Se considera que la
transmisión a largas distancias tiene lugar por medios distintos del agua, como
el traslado de animales durante el comercio internacional y posiblemente por el
movimiento de agua contaminada o suelo húmedo.
Los brotes de quitridiomicosis se asocian principalmente a estaciones (meses
más fríos), altitudes (la mayoría de casos graves en general se restringen a
poblaciones de grandes altitudes), y a hábitats de reproducción. Respecto a los
últimos, los declives de poblaciones son pronunciados en especies que viven
en arroyos. La gravedad del impacto de la enfermedad en la población también
está correlacionada con pequeñas distribuciones de poblaciones que son
menos fecundas, existen interacciones más complejas y diferencias de
susceptibilidad aparentemente inherentes que actúan junto con estos “factores”
identificados.
CONTROL Y PREVENCIÓN
Bd es susceptible a gran variedad de agentes antifúngicos y a niveles bajos de
calor (>30°C) cuando se analiza in vitro, pero existen pocos métodos que
hayan demostrado eliminar Bd de los anfibios. Se ha comprobado que el
calentamiento (a 32°C durante 5 días y a 37ºC durante dos periodos de 8
horas, con un intervalo de 24 horas entre ellos) es igual de eficaz contra la
quitridiomicosis en dos especies de anfibios. Debe comprobarse el efecto del
calor y optimizarse en varias especies, y se observará que muchos anfibios de
climas templados no toleran los 37ºC. Aunque tanto los baños de itraconazol y
(al 0,01% durante 5 minutos al día y un total de 11 días) como los de
formalina/verde de malaquita parecen ser tratamientos eficaces para las ranas
postmetamórficas, estas pruebas no fueron rigurosas y se observó el problema
de la toxicidad, en concreto en el caso de la formalina/verde de malaquita. No
obstante, los baños de itraconazol se han utilizado mucho en programas de
rescate y conservación de anfibios, y observaciones puntuales sugieren que es
eficaz para adultos y subadultos. Se ha observado un tratamiento eficaz de
renacuajos infectados de una especie en una prueba controlada en la que se
ha utilizado itraconazol a dosis bajas (1,5 mg litro–1), pero podría ir asociado a
despigmentación. Nota: la formulación hidrosoluble de itraconazol no es fácil de
conseguir. Se ha documentado un tratamiento seguro y eficaz contra
infecciones por Bd (en adultos y renacuajos) con voriconazol. Este tratamiento
consiste en aplicar spray una vez al día durante 7 días a razón de 1,25 mg
litro–1 (Martel et al., 2010).
ELECCIÓN DE EJEMPLARES
Bd se replica en las partes queratinizadas de los aparatos bucales de los
renacuajos y en casi todas las superficies ventrales, así como en los dedos de
los pies de los anfibios adultos. Los órganos infectados son los dedos de los
pies (que deberían cortarse, pero no se recomienda por motivos éticos), la piel
(deben tomarse hisopos) y los aparatos bucales (renacuajos), y también debe
realizarse baños de animales enteros (adultos y renacuajos).
Los hisopos y los discos orales extirpados pueden guardarse secos a
temperatura ambiente (de hasta 23ºC). Nota: la exposición a temperaturas
altas durante largos periodos de tiempo (por ejemplo, en un coche) puede
reducir la obtención de ácido nucleico. En caso de realizar el examen mediante
microscopía óptica o electrónica, se fijan los tejidos en formalina tamponada
neutra al 10% y glutaraldehído tamponado al 2,5%. Las muestras deben
procesarse como se describe para la Necrosis hematopoyética epizoótica o la
Infección por ranavirus.
MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO
En la mayoría de los animales infectados no se observan signos clínicos. El
periodo de manifestación de signos clínicos suele ser corto y se limita a los
anfibios que después morirán. Predominan los signos del sistema nervioso
central. Las alteraciones del comportamiento consisten en un movimiento lento
y descoordinado, posturas de sedestación anómalas, espasmos tetánicos,
pérdida del reflejo de erguido y parálisis.
MÉTODOS CLÍNICOS
ANATOMOPATOLOGÌA MACROSCÓPICA
Pueden observarse alteraciones macroscópicas de la piel en las infecciones
graves, que consisten en una muda anómala de la piel (más frecuente de lo
normal y en trozos más pequeños) y eritema. Estos signos clínicos no son
específicos de la quitridiomicosis.
BIOQUÍMICA CLÍNICA
En la rana arborícola verde de Australia enferma (Litoria caerulea) se observan
reducciones en las concentraciones plasmáticas de sodio y de potasio de un
20% y un 50%, respectivamente.
ANATOMOPATOLOGÍA MICROSCÓPICA
La microscopía consiste en el examen de preparaciones húmedas de piel
(raspados, frotis o piel entera), cortes histológicos de piel teñido con
hematoxilina y eosina, e inmunohistoquímica de cortes de piel. Estas pruebas
sistemáticas tienen un alto valor predictivo positivo. A continuación, se explican
detalles de estas técnicas y sobre cómo interpretar los resultados.
PREPARACIONES HÚMEDAS
Pueden examinarse muestras de piel entera, de las membranas interdigitales o
de cualquier otro lugar; esta técnica mantiene la anatomía de la piel y permite
examinar una gran superficie. La ventaja es que la muestra se puede orientar y
que la localización del agente sospechoso puede ayudar a identificarlo. Así, por
ejemplo, puede determinarse si en las células superficiales hay perfiles
fúngicos sospechosos, lo cual sería indicativo de Bd, o bien si se encuentran en
capas más profundas, lo cual es normal en la morfología normal del anfibio.
Esta técnica es rápida, barata y, cuando es utilizada por observadores con
experiencia, ofrece una sensibilidad equivalente a la de la tinción con
hematoxilina y eosina (Longcore et al., 2007). Es útil para estudiar ranas sanas
de las que no puedan obtenerse hojas de piel mudada. Los renacuajos
infectados a menudo pueden identificarse en el campo por la falta de color en
las capas dérmicas de las mandíbulas, lo cual puede observarse mediante
lupas (x10). Los aparatos bucales del renacuajo también se pueden examinar
cortando trozos de las filas de dientes o de las capas dérmicas y aplastándolos
bajo un cubreobjetos, donde se podrán observar agrupaciones de esporangios.
En las preparaciones húmedas y los frotis (véase abajo), normalmente se
observan esporangios intracelulares de forma entre redonda y ovalada
formando agrupaciones. En piel mudada el estadio más frecuente es el de
esporangios vacíos viejos, aunque también es frecuente hallar esporangios que
contengan zoosporas. Los tubos de descarga (asociados a los zoosporangios),
de los cuales salen zoosporas, suelen apuntar perpendicularmente a la
superficie de la piel y, por tanto, son pequeños círculos, tal vez difíciles de
diferenciar. La observación de septos internos dentro de los esporangios
aumenta la confianza en el diagnóstico. Los núcleos de las células de la
epidermis son de tamaño similar al de los esporangios, pero pueden
diferenciarse por sus membranas irregulares y poco definidas, y por su aspecto
plano, granular y gris.
CONCLUSIÓN
  Con la investigación de este trabajo nos podemos dar cuenta que el
hongo que predomina en casi todas las especies es el Batrachochytrium
dendrobatidis (Bd)
 La patogenia de esta enfermedad cutánea ha sido difícil de determinar,
puesto que no se ha detectado ninguna alteración anatomopatológica
constante en ningún órgano interno.
 Bd es susceptible a una gran variedad de tratamientos químicos y físico
RECOMENDACIONES
 Se debe seguir las reglas tal y cual lo indica cada método por ejemplos
Se extrae ADN de dedos cortados, hisopos, filtros o discos orales de
renacuajos mediante PrepMan Ultra.
 Se recomienda que en cada placa también debe incluirse un control de
extracción sin ADN.
 Se recomienda la creación de una vacuna para este hongo.
BIBLIOGRAFÍA
http://www.ins.gob.pe/insvirtual/images/otrpubs/pdf/Manual%20Hongos.pdf
http://www.oie.int/esp/normes/fmanual/2.01.01_INF_BATRACHOCHYRIUM_7.3
.11.pdf