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Serratia marcescens: de patógeno oportunista al control de insectos que afectan

cultivos agrícolas.

Article · January 2003

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4 authors, including:

Ruben Salcedo-Hernández José E. Barboza Corona

Universidad de Guanajuato University of Guanajuato. México
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Serratia marcescens: DE PATÓGENO OPORTUNISTA AL CONTROL DE INSECTOS
QUE AFECTAN CULTIVOS AGRÍCOLAS

Alejandro Ruíz Sánchez 1,2, Ramón Cruz Camarillo1 y Rubén Salcedo Hernandez2,
J. Eleazar Barboza Corona2*
1
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional. México, D. F. 2Instituto de
Ciencias Agrícolas, Universidad de Guanajuato. Carretera Irapuato-Silao, Km 9. Apartado Postal 311, 36500,
Irapuato, Gto. México. e-mail: josebar@dulcinea.ugto.mx.

Palabras clave: Serratia marcescens, Bacillus thuringiensis, quitina, quitinasas, proteínas Cry.
Key words: Serratia marcescens, Bacillus thuringiensis, chitinases, Cry protein.

Resumen

Serratia marcescens es una bacteria que produce quitinasas (Chi), las cuales hidrolizan los enlaces
glicosídicos !-1,4 de la quitina. Esta bacteria tiene un sistema quitinolítico completo formado de tres clases de
enzimas (endoquitinasas, exoquitinasas y quitobiasas) y una proteína que se une a quitina. Varios estudios han
mostrado cómo las quitinasas de diferentes bacterias, entre ellas las de S. marcescens, han incrementado el
efecto insecticida de las proteínas Cry de Bacillus. thuringiensis. Aun cuando se han expresado varios genes chi
heterólogos en B. thuringiensis, ninguno ha sido de S. marcescens. Los genes chi de S. marcescens se podrían
clonar en B. thuringiensis y aumentar así su potencia en contra de insectos de importancia agronómica, sobre
todo contra aquellas plagas que son poco susceptibles a las proteínas Cry.

Abstract

Serratia marcescens is a chitinolytic bacterium able to hydrolize the !-1,4 chitin glicosidic bonds. This
bacterium has a chitinolytic system constituted of three types of enzymes (endochitinases, exochitinases, and
chitobiases), and one chitin binding protein. Several studies have shown that chitinases from diverse bacteria,
like S. marcescens, have improved the insecticidal activity of Cry proteins from Bacillus thuringiensis. Even
though different heterologous chi genes have been used to transform B. thuringiensis, not chitinase genes from
S. marcescens has been used to get a transgenic B. thuringiensis strain. Chitinase genes from S. marcescens
can be cloned in B. thuringiensis for increasing the insecticidal activity of this bacterium, particularly against pest
that are less susceptible toward Cry proteins.

CARACTERÍSTICAS GENERALES DE S. de un milagro y que las figuras lloraban sangre. El

Marcescens color rojo también aparecía en ostias y crucifijos.
Más tarde se descubrió que las lágrimas estaban
No es sorprendente que en algunas constituidas por una bacteria que tiene la
ocasiones se haya escuchado o leído que han particularidad de producir un pigmento rojo (Figura
aparecido manchas rojas en la zona de los ojos de 1), el que se llamó prodigiosina, un compuesto
figuras religiosas. Esto hacia creer que se trataba derivado del pirrol (Stainer y col., 1994). Serratia
marcescens es una bacteria Gram-negativa, que
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BioTecnología 2003 Vol. 8 No. 2
 artículos
pertenece a la familia Enterobacteriaceae
(Freeman, 1985), que puede vivir en diferentes
tipos de ambiente, con o sin oxígeno (anaerobio
facultativo). Además de la prodigiosina, produce
lecitinasas, fosforilasas, toxinas extracelulares y
quitinasas (Escobar y col., 2001). Por otro lado,
Serratia marcescens es una bacteria cosmopolita
que se ha encontrado sobre hongos Basidiomicetos
y Ascomicetos (Ordentlich y col., 1988), caracoles,
insectos, vertebrados, semillas de fríjol y
crustáceos, suelo, agua y plantas. También se ha
aislado en hospitales y clínicas, debido a que es un
patógeno oportunista intrahospitalario, que puede
ocasionar infección en los tractos urinario y
respiratorio, y producir meningitis y artritis (Escobar
y col., 2001).
H H
N N N CH3
OCH3 C5H11
Fig. 1. Fórmula química de la prodigiosina,
pigmento sintetizado por Serratia marcescens,
responsable del color rojo de la bacteria (Stainer et
al., 1994).
Cuando S. marcescens infecta a un insecto,
éste puede morir en un lapso de uno a tres días,
proporcionando frecuentemente un tono rojo en los
cadáveres (Boucias, 1998). Ciertos parásitos de
himenópteros han sido reportados como vectores
de esta bacteria. Por otro lado también es capaz de
producir citotoxinas que tienen efecto en las líneas
celulares CHO, Vero y Hep-2. Estas citotoxinas son
similares a las producidas por aislados clínicos, y
son tóxicas a diferentes líneas celulares de
mamíferos. Estos hallazgos deben de tomarse muy
en cuenta cuando se hagan estudios relacionados
con el uso de S. marcescens en el control biológico
(Escobar y col., 2001).
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BioTecnología 2003 Vol. 8 No. 2
QUITINASAS DE S. Marcescens
La quitina es un polímero renovable, que
ocupa en la naturaleza el segundo lugar en
abundancia, sólo superado por la celulosa. Se
puede encontrar en protozoarios, crustáceos,
insectos y hongos. La quitina está formada por
unidades de N-acetilglucosamina (NAG) unidas por
enlace glicosídico !-1,4. Las quitinasas (Chi) son
enzimas que hidrolizan la quitina en el enlace
glicosídico. En general se pueden distinguir los
siguientes tipos de quitinasas.(i) Las endoquitinasas
que hidrolizan la quitina de manera azarosa en los
enlaces glicosídicos internos liberando
principalmente quitobiosa (dímero de NAG) y
pequeñas cantidades de otros oligosacáridos
superiores. (ii) Las exoquitinasas, entre las cuales
se encuentran las quitobiosidasas, que catalizan la
liberación de quitobiosa a partir del extremo no
reductor de la quitina; y las N-
acetilglucosaminidasas que liberan NAG a partir del
extremo no reductor. (iii) Las quitobiasas que
actúan sobre la quitobiosa y producen monómeros
de NAG (Barboza-Corona y col., 1998).
Serratia marcescens es una de las bacterias
con mayor capacidad quitinolítica hasta ahora
conocidas. Su sistema quitinolítico esta constituido
por endoquitinasas, exoquitinasas, quitobiasas y
una proteína que se une a quitina (Brurberg y col.,
1996) (Fig. 2). Los genes de S. marcescens han
sido clonados en varias bacterias como Escherichia
coli (Tews y col., 1996; Brurberg y col., 1995; Jones
y col., 1986), Pseudomonas fluorescens (Shaikh y
Deshpande, 1993), pero hasta ahora, ninguno en
Bacillus thuringiensis. Las quitinasas producidas
por S. marcescens pueden ser usadas en la
degradación de materiales que tengan quitina, tales
como el exoesqueleto de los crustáceos, membrana
peritrófica de los insectos y en la degradación de la
pared celular de hongos como Sclerotium rolfsii
(Ordentlich y col., 1988). Al igual que la celulosa, la
quitina es químicamente muy estable, y el
 artículos
reciclamiento del carbono y nitrógeno que contiene
es un proceso lento que sólo se produce si hay
presencia de enzimas que la degraden. En relación
con el control de insectos, las quitinasas de S.
marcescens se han empleado como agentes
sinérgicos de las proteínas Cry en el control del
gusano soldado (Spodoptera littoralis) (Regev y
col., 1996), y del barrenador de la caña de azúcar
(Eldana saccharina) (Downing y col., 2000). En este
caso las quitinasas de S. marcescens actúan en la
membrana peritróficas de las larvas de los insectos,
permitiendo que las proteínas Cry tengan un mayor
acceso a los receptores del intestino medio,
obteniéndose así una mayor capacidad insecticida,
que si actuaran por sí solas (Fig. 3). Esto es de
particular importancia, especialmente para el caso
de los insectos que son poco susceptibles a Cry.

Fig. 2. Sistema quitinolítico de Serratia

marcescens. La quitina que se encuentra
en el medio es degradada por una
Espacio periplásmico endoquitinasa (ChiA) que es secretada por
Porina Serratia marcescens. Esta rompe los
enlaces internos !-1,4 de la quitina y se
ChiB ChiA forman oligómeros de N-acetilglucosamina,
los cuales pasan al espacio periplásmico
N-Acetilglucosamina gracias a la ayuda de la proteína porina
que se encuentra en la pared celular de la
Quitobiosa
bacteria. Los oligómeros son degradados
por una quitobiosidasa (ChiB) que cataliza
Quitobiasa la formación de la quitobiosa.
EII Posteriormente la quitobiosa es hidrolizada
por quitobiasas para formar monómeros de
N-acetilglucosamina. La proteína EII
N-Acetilglucosamina permite el paso de la N-acetilglucosamina
Quitina al citoplasma lugar donde serán usadas
como fuentes de carbono y nitrógeno.
(Modificado de Brurberg y col., 1996).

Figura 3. Representación esquemática del

mecanismo de acción de las proteínas Cry

y el posible papel de las quitinasas.( ),

cristales formados por las proteínas Cry

( ) y quitinasas ( ). Las proteínas Cry

son solubilizadas en el estómago medio y
liberan las protoxinas, las cuales son
digeridas por las proteasas intestinales
formándose las "-endotoxinas. Las
quitinasas degradan la membrana
peritrófica. Las "-endotoxinas pueden
alcanzar más fácilmente los receptores de
membrana presentes en el intestino medio
al degradarse la quitina. Las "-endotoxinas
ejercen su efecto tóxico y las larvas
mueren.

33
BioTecnología 2003 Vol. 8 No. 2
 artículos
PROTEINAS Cry Y QUITINASAS DE B.
Thuringiensis
Bacillus thuringiensis es una bacteria
esporogénica Gram positiva, y ampliamente
conocida en el ámbito agrícola debido a su uso
para el control de plagas que afectan cultivos como
la papa, maíz, brócoli, y coliflor. Dicha bacteria es
sorprendente ya que sintetiza proteínas llamadas
Cry, las cuales son capaces de formar cristales y
aniquilar a diversos insectos susceptibles. Las
proteínas Cry forman cristales, esto es importante
ya que asegura que al ser ingerido por un insecto,
este reciba suficiente dosis para que lo incapacite y
permita la germinación de esporas de B.
thuringiensis. La rápida proliferación de bacterias
ocasiona septicemia y muerte. Los cristales pueden
adoptar diversas formas como los bipiramidales,
cúbicos, esféricos, triangulares, etc. La formación y
tamaño de los cristales depende del control
genético de ciertas regiones (promotores fuertes,
terminadores de la transcripción, secuencias Shine
Dalgarno) presentes en los propios genes
(llamados cry) que sintetizan las proteínas Cry, o
bien de proteínas auxiliadoras (“helper proteins”)
que ayudan a estabilizar a Cry después de que se
han formado (efecto p os tra ducc io na l) .
Bac i ll us thuringiensis también sintetiza las
proteínas Cyt y Vip que son insecticidas, y otros
compuestos con probable uso biotecnológico.
Algunos ejemplos son las proteasas (enzimas que
degradan proteínas), quitosanasas (enzimas que
degradan quitosana), quitinasas, melanina
(pigmento presente en la piel del ser humano),
bacteriocinas (antibióticos que atacan bacterias),
amilasas (actúan sobre almidones), queratinasas
(actúan sobre queratina, proteína presente en pelo,
piel y uñas) (Barboza-Corona y Escudero-Abarca,
2002).
Con respecto a las quitinasas de B.
thuringiensis, éstas se empezaron a estudiar desde
la década de los 70´s (Chigaileichik, 1976),
34
BioTecnología 2003 Vol. 8 No. 2
principalmente debido a su probable uso como
agente para incrementar la toxicidad de las
proteínas Cry. Varios grupos se han dedicado a la
selección de cepas productoras de quitinasas. Por
ejemplo, se han estudiado cepas aisladas de
México, Tailandia y varias de la colección de B.
thuringiensis mantenidas en el Instituto Pasteur de
Francia y del Banco Genético de Bacillus en Ohio,
Estados Unidos. En general, se ha observado que
B. thuringiensis expresa quitinasas solamente en
presencia de la quitina como inductor, es decir no lo
hace de manera constitutiva. Esta producción es
muy baja comparada con otras bacterias como S.
marcescens, e incluso en algunas ocasiones la
expresión puede ser tan baja que es muy difícil
detectarla. Contrario a lo anterior, recientemente se
publicó la detección y purificación de una
exoquitinasa de B. thuringiensis HD-1, la cual se
expresa de manera constitutiva (incluso con
glucosa) cuya expresión es independiente de la
presencia de quitina (Arora y col., 2003). Por otro
lado, solamente se ha reportado la clonación de
tres genes chi, uno proveniente de una cepa nativa
de Pakistán (B. thuringiensis subsp. pakistani)
(Thamthiankul y col., 2001), otro de B. thuringiensis
HD-1 (Arora y col., 2003) y otro de una cepa de
México (B. thuringiensis LBIT-82 subsp. kenyae)
(Barboza-Corona y col., 2003). Los dos primeros
genes producen exoquitinasas y presentan una
masa molecular de 71 y 36 kDa, respectivamente.
El último gen codifica una endoquitinasa de 74 kDa.
Las tres enzimas han quedado agrupadas en la
familia 18 de las glicosilhidrolasas.
QUITINASAS DE S. marcescens EN B.
Thuringiensis
Existen varios trabajos en los cuales se ha
demostrado que el uso de quitinasas heterólogas,
como las de S. marcescens, B. lincheniformis, B.
circulans o del mismo B. thuringiensis, son capaces
de incrementar la actividad tóxica de las proteínas
Cry o Vip en varios insectos plaga como
 artículos
Spodoptera exigua, S. littura, Plutella xylostella y
Aedes aegypti (Regev y col., 1996; Wiwat y col.,
2000; Arora y col., 2003). Por ejemplo, la adición de
10 mU #una unidad (U) es la cantidad de enzima
necesaria para liberar en un minuto, 1 $mol de N-
acetilglucosamina a partir de quitina coloidal% de
quitinasas de B. lincheniformis son capaces de
aumentar 8 veces la toxicidad de B. thuringiensis
subsp. aizawai hacia Spodoptera exigua
(Tantimavanich y col., 1997). Asimismo, cuando se
agregaron 0.1 $g/ml de quitinasas de S.
marcescens a la proteína Cry1C, la toxicidad contra
Spodoptera littoralis se incrementó 6 veces (Regev
y col., 1996). Por otro lado, se ha observado que si
se mezclan 19.3 mU/ml de las quitinasas
producidas por B. thuringiensis subsp. kurstaki con
esporas y cristales de la misma bacteria, la
toxicidad hacia Plutella xylostella aumenta 8 veces
(Wiwat y col. 2000). Sin embargo, en la mayoría de
esos estudios resulta difícil dar una conclusión
definitiva sobre el efecto sinérgico, especialmente
por el uso de extractos crudos, los cuales además
de las quitinasas pueden llevar otros compuestos
como proteasas, exotoxinas o proteínas Vip. Con
esta información, surge la necesidad de
sobreexpresar genes chi en B. thuringiensis, de tal
forma que se facilite la purificación de las
quitinasas y directa evaluación con Cry. Además,
se han reportado la obtención de cepas
transgénicas de B. thuringiensis transformadas con
genes chi heterólogos, como los de B. circulans y
B. lincheniformis (Lertcanawanichakul y Wiwat,
2000; Sirichotpakorn y col., 2001). En estos casos
la expresión de quitinasas ha sido baja y se ha
reducido el número de células formadoras de
esporas.
Por otro lado, como ya se mencionó
anteriormente, la actividad quitinolítica de Serratia
marcescens es muy superior a la observada en
otras bacterias incluyendo a B. thuringiensis. Por
ejemplo, se ha reportado que S. marcescens WF
presenta hasta 20 veces mas actividad de quitinasa
35
BioTecnología 2003 Vol. 8 No. 2
que B. thuringiensis subsp. tolworthi (Rojas-
Avelizapa y col., 1999). De manera particular, S.
marcescens NIMA es una cepa con gran capacidad
quitinolítica, la cual presenta mayor actividad (hasta
3 veces) que otras cepas de S. marcescens como
la WF (Ruíz-Romero, 1977). Además, no se ha
reportado la transformación de B. thuringiensis con
algún gen chi de S. marcescens. Hasta donde
sabemos, no existe ningún estudio donde se haya
usado las mismas concentraciones de diversas
quitinasas bacterianas y se haya comparado su
efecto sinérgico con las proteínas Cry. Es decir, no
sabemos si una unidad de quitinasa de S.
marcescens es más efectiva que una de B.
lincheniformis, B. circulans, o que del mismo B.
thuringiensis. Suponemos que debido a la gran
capacidad quitinolítica de S. marcescens NIMA
pudiera ser que una unidad de quitinasa de la cepa
NIMA sea más efectiva que la de las otras
bacterias; sin embargo, esto tendría que
demostrarse. Debido a que S. marcescens es
considerado un patógeno oportunista para el ser
humano, no es recomendable utilizar quitinasas
provenientes directamente de la bacteria. Para
resolver lo anterior, hemos pensado en la clonación
de un gen de quitinasa de S. marcescens NIMA. Es
importante comentar que aún cuando se han
reportado varios genes chi de dicha bacteria,
ninguno ha sido de la cepa NIMA. La clonación de
un gen chi de dicha cepa permitiría entre otras
cosas poderlo manipular e introducirlo en B.
thuringiensis. Consideramos que con las
herramientas que se cuenta actualmente para la
trasformación de B. thuringiensis, tales como
vectores de expresión estables, promotores fuertes
que se expresan en la fase vegetativa o durante la
esporulación, regiones que estabilizan al RNA
mensajero y de proteínas auxilidoras (“helper
proteins”), podría facilitarse la clonación de un gen
chi de S. marcescens en B. thuringiensis. Esto
podría implicar la obtención de cepas de B.
thuringiensis no solo con mayor capacidad
insecticida, sino que puedan usarse con otros
 artículos
propósitos como en el control de hongos
fitopatógenos y aprovechamiento de desperdicios
de camarón (ricos en proteína-quitina) para la
producción de harinas para consumo animal
(Rojas-Avelizapa y col., 1999).
Agradecimientos.
El presente trabajo fue realizado gracias al
apoyo parcial del proyecto CONACYT J35306-B.
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