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Curso:
“Métodos Fisíco-Químicos en Biotecnología”
Plataformas de Proteómica
Presentan:
Ing. Daniela Morales Sánchez.
Ing. Lilí Esmeralda Gallo Ramírez.
1. Introducción 1
1.1 Tecnología de la proteómica 3
1.1.1 Separación de proteínas 3
1.1.2 Identificación y caracterización de proteínas 5
2. Fundamentos de la electrofóresis 7
3. Tipos de electrofóresis 8
3.1 Electrofóresis libre 8
3.2 Electrofóresis zonal 9
3.2.1 Equipamiento de la electrofóresis 9
3.3 Tipos de soporte 10
3.3.1 Soportes no restrictivos tipo I 10
3.3.2 Soportes restrictivos tipo II 11
3.4 Factores que afectan la electroforesis 11
3.4.1 Campo eléctrico 11
3.4.2 Muestra 11
3.4.3 Tampón 12
3.4.4 Soporte 12
3.5 Tipos de electroforesis 13
3.5.1 Inmunoelectroforesis 14
3.5.2 Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) 16
3.5.2.1 Formación del gel de poliacrilamida 16
3.5.2.2 Tipos de monómeros 18
3.5.2.3 Catalizadores empleados en la formación del gel de
poliacrilamida 18
3.5.2.4 Sistemas de tampones que se emplean en la electroforesis en
geles de poliacrilamida 19
3.5.2.5 Formatos de la PAGE 19
3.5.2.6 PAGE en condiciones no desnaturalizantes 20
3.5.2.7 PAGE en condiciones desnaturalizantes 20
3.5.2.8 PAGE-SDS 21
3.5.3 Electroforesis en geles de gradientes 25
3.5.4 Electroforesis en geles de azarosa 26
3.5.5 Electroforesis capilar 26
3.5.6 Enfoque isoeléctrico 27
3.5.7 Electroforesis bidimensional 29
4. Información sobre la estructura de las proteínas 30
4.1 Fragmentación de proteínas 30
4.1.1 Proteólisis 30
4.1.1.1 Digestión en solución 31
4.1.1.2 Digestión en gel 31
4.1.2 Rompimiento químico 32
4.2 Análisis de secuencia amino y carboxilo terminal 33
4.2.1 Secuenciación del extremo amino terminal 33
4.2.1.1 Proteínas con modificaciones en el amino terminal 34
4.2.2 Secuenciación del extremo carboxilo terminal 35
5. Espectrometría de masas 35
5.1 Preparación de la muestra 35
5.2 Ionización de la muestra 35
5.2.1 MALDI (Matrix Assisted Lasser Desorption Ionization) 36
5.2.2 ESI (ElectroSpray Ionization) 36
5.3 Análisis de masa 38
5.3.1 Analizador de cuadrupolo 38
5.3.2 Analizalizador de tiempo de vuelo (Time of Flight, ToF) 40
5.3.3 Analizador de trampa de iones 41
5.3.4 Analizadores híbridos. 41
5.3.5 Analizadores ToF/ToF 42
5.3.6 FT-ICR (Fourier transform-ion cyclotron resonance) 42
5.3.7 Fragmentación de iones 43
6. Identificación de proteínas utilizando bases de datos. 43
6.1 Huella de masa del péptido (peptide mass fingerprint, PMF) 44
6.2 Secuenciación utilizando datos generados con la técnica product
ion scan MS/MS 45
6.3 Secuenciación de novo 45
7. Identificación de modificaciones post-traduccionales 46
7.1 Identificación de sitios de fosforilación 47
7.1.1 Enriquecimiento de fosfoproteínas 47
7.1.2 Determinación de sitios de fosforilación mediante degradación
de Edman 47
7.1.3 Determinación de sitios de fosforilación mediante
espectrometría de masas 47
8. Bibliografía 49
1. INTRODUCCIÓN
La proteómica es uno de los campos que puede ayudar a establecer una conexión
entre las secuencias genómicas y su comportamiento biológico, constituyendo una
herramienta importante en el análisis funcional de genes de función desconocida.
El término “Proteoma” fue usado por vez primera en 1995 para describir el
conjunto de PROTEínas de un genOMA, en una célula o un tejido. De forma
imperceptible, la palabra proteoma dio lugar a una nueva disciplina, la “Proteómica”.
Pero, ¿qué es la proteómica? Esencialmente la proteómica es el estudio a gran escala de
los productos génicos de un genoma mediante métodos bioquímicos, con el fin de
obtener una visión global integrada de los procesos celulares. El término proteómica se
ha asociado tradicionalmente con la separación de un gran número de proteínas de una
célula u organismo mediante 2D-PAGE. Según esto, la proteómica comienzo en los
años setenta cuando se empezaron a construir bases de datos de proteínas utilizando la
electroforesis bidimensional. Sin embargo, la identificación de las proteínas era difícil
debido a la falta de métodos analíticos rápidos y sensibles para la caracterización de las
proteínas. En los años noventa la espectrometría de masas surge como un método
analítico muy poderoso, ya que limita la mayoría de las limitaciones del análisis de
proteínas. Este desarrollo, junto con la disponibilidad de los genomas secuenciados
marca el comienzo de una nueva era. Actualmente muchas áreas de estudio han sido
agrupadas dentro de la proteómica. Se pueden incluir, entre otros, los estudios de
interacciones de proteínas, de modificaciones pos-traduccionales, el análisis funcional
de las proteínas y estudios de localización.
1
en transducción de señales, la identificación de proteínas específicas de una
enfermedad y proteínas de interés en microbiología médica.
Proteómica Estructural
de Proteínas afinidad, IEX, E-2D, E-1D, FFE,
y E-2D)
SEC, HIC CZE
Proteómica Funcional
Caracterización posttraduccionales: covalentes
fosforilación, glicosilación, Uniones por enlaces
Conformación de
metilación, acetilación disulfuro
proteínas
Fig. 1. Estrategias utilizadas en proteómica para la identificación y el análisis de proteínas. Siglas: (SEC)
Size-exclusion chromatography; (IEX) ion-exchange chromatography; (HIC) hidrophobic interaction
chromatography; (FFE) free flow electrophoresis; (CZE) capillary zone electrophoresis; (FRET)
flourescence resonance energy transfer.
2
Como respuesta a estímulos externos e internos, las proteínas pueden ser modificadas
post-traduccionalmente, translocadas, sintetizadas o degradadas (Fig. 2).
Fig. 2 Mecanismos por los que un gen puede dar lugar a múltiples productos génicos.
• Mapeo celular
3
realiza mediante isoelectroenfoque, durante el cual las proteínas son separadas en un
gradiente de pH hasta alcanzar una posición en la que su carga neta es cero, es decir,
su punto isoeléctrico. En una segunda dimensión, las proteínas son separadas
mediante electroforesis en presencia de SDS. La alta resolución de la técnica se basa en
que las dos separaciones se basan en parámetros independientes. La innovación clave
para la 2D-PAGE fue el desarrollo de geles con un gradiente de pH inmovilizado (IPG).
El gradiente de pH inmovilizado elimina los problemas de inestabilidad del gradiente
y baja capacidad de carga que iban asociados a los gradientes de pH preparados con
anfolitos acarreadores. En los geles IPG, el gradiente es generado por las llamadas
“inmobilinas” y está copolimerizado con la matriz de acrilamida del gel. Este sistema
ha permitido mejorar la resolución y reproducibilidad de los geles así como aumentar
la cantidad de proteína que puede ser cargada. La reproducibilidad conseguida con los
IPGs ha hecho posible la comparación de mapas entre distintos laboratorios,
facilitando así el intercambio de información.
4
extractos. Debido a estas limitaciones, la mayor aplicación de esta técnica en el futuro
será el análisis y caracterización de subproteomas y de complejos proteicos.
Las proteínas pueden ser identificadas por diversos procedimientos, entre los
que se incluyen la secuenciación del extremo N-terminal, detección con anticuerpos
específicos, composición de aminoácidos, co-migración con proteínas conocidas, y
sobre-expresión y deleción de genes. Todos estos métodos generalmente son lentos,
laboriosos, o caros, y por tanto no resultan apropiados para su utilización como
estrategias a gran escala.
Los espectrómetros de masa están formados al menos por una fuente de iones,
un analizador de masas y un detector que mide la relación masa/carga (m/z) de los
iones en fase gaseosa.
5
2.- Separación de los iones según su m/z en un analizador de masas (por ejemplo un
analizador tipo ToF (Time of Flight), cuadrupolo, trampa iónica, etc.)
3.- Fragmentación opcional de los iones peptídicos.
4.- Medida de las masas en un detector obteniendo un espectro de masas que refleja la
abundancia de los iones frente a su valor m/z.
Fig. 3 Estrategia para la identificación de proteínas mediante espectrometría de masas (Pitarch et al. 2003).
6
Fig. 4 Dos nuevas aproximaciones para la detección y cuantificación diferencial de proteínas. A. ICAT
(isotope coded affinity tag). B. DIGE (Differential gel electrophoresis). (Pitarch et al. 2003).
2. FUNDAMENTOS DE LA ELECTROFORESIS
7
La velocidad de migración (v) de la partícula es directamente proporcional al
producto de su carga efectiva (q) y el gradiente de potencial eléctrico (E) e
inversamente proporcional al coeficiente de fricción (f) relativo a la talla y forma de la
molécula, o sea, a la resistencia que le ofrece el medio.
V=qE/f
3. TIPOS DE ELECTROFORESIS
8
Fig. 5 Las moléculas cargadas migran hacia los electrodos, aunque no bien separadas por tratarse de una
disolución.
Este método tiene gran poder resolutivo porque se aplica una cantidad pequeña de
proteína a una zona estrecha, mientras que la longitud del trayecto es mucho mayor
que la zona de aplicación. El equipamiento requerido es simple (fuente de poder y
cubeta vertical u horizontal donde se coloca el soporte y 2 electrodos). Con el
desarrollo de la ciencia se han diseñado equipos automatizados de electroforesis como
el PhastSystem.
Para llevar a cabo una separación electroforética zonal se necesitan los elementos
mostrados en la Fig. 7:
• Soporte electroforético.
9
Fig. 7 Equipo electroforético. La cubeta tiene en sus extremos los reservorios para el tampón de
electroforesis. En el centro se aloja el soporte (gel) con la muestra aplicada en su zona central.
Fig. 8 Estructura química de la agarosa, polisacárido lineal formado por la repetición de la estructura
básica (agarobiosa), con un peso molecular medio de 120kDa (que corresponde a unas 400 unidades). Las
características de la agarosa se ven modificadas dependiendo de la naturaleza de los diferentes radicales
R.
10
3.3.2 Soportes restrictivos tipo II
3.4.2 Muestra
11
tamaño y carga, pero de diferente forma, pueden tener una movilidad electroforética
diferente y ser, por tanto, separables mediante una electroforesis.
3.4.3 Tampón
Durante una electroforesis, se produce una electrolisis del agua por acción del
campo eléctrico, lo cual genera protones en la proximidad del ánodo e iones hidroxilo
en el cátodo. El tampón es, por esta razón, esencial durante la electroforesis para evitar
que el ánodo se acidifique y el cátodo se haga más básico, pero no debe afectar a las
moléculas a separar.
3.4.4 Soporte
La simple presencia del soporte en una electroforesis hace que se presenten una serie
de fenómenos de elevada trascendencia para el resultado del proceso:
12
Fig. 9 Efecto electroendosmótico en la superficie de un soporte cargado negativamente. Los aniones
migran desplazándose por el centro del poro, mientras que los cationes lo hacen por la superficie.
Las proteínas son moléculas cuya carga neta depende del contenido de una serie de
aminoácidos (fundamentalmente ácido glutámico, ácido aspártico, lisina, arginina e
histidina) y del grado de ionización de éstos al pH considerado (Fig. 10 ).
Fig. 10 Principales aminoácidos responsables de la carga neta de una proteína, dependiendo del pH.
13
de desplazamiento de la misma) y de forma perpendicular a la dirección del campo
eléctrico. Conviene evitar la proximidad de los bordes del papel, ya que allí el campo
eléctrico no es homogéneo y se distorsionan las bandas según avanzan. El volumen que
se aplica suele ser inferior a 10 µL y si se necesitan mayores volúmenes porque la
muestra se encuentre muy diluida, pueden hacerse aplicaciones sucesivas sobre la
misma zona, dejando secar entre aplicación y aplicación. Es necesario humedecer el
soporte (papel o acetato de celulosa) para que sea conductor; para ello, se impregna el
soporte de tampón de electroforesis por ambos extremos y de forma simultánea para
que por capilaridad se desplace hacia la zona de aplicación de la muestra.
En los geles de agarosa, se perfora el gel con ayuda de un troquel o una pipeta
de diámetro adecuado y se elimina esa porción por succión. La perforación puede ser
cilíndrica o rectangular, dependiendo del número y cantidad de muestra a analizar y la
muestra se deposita en el orificio practicado sin que llegue a rebosar. En este caso, el
tampón está embebido en el soporte (agarosa).
En todos los casos, la zona de aplicación debe ser lo más estrecha posible, para
aumentar la resolución y evitar solapamientos entre bandas que migren en posiciones
cercanas.
3.5.1 Inmunoelectrofóresis
14
Los geles se mantienen así a temperatura ambiente (20-22°C) durante 24-48 horas.
Los anticuerpos y las proteínas (que actúan como antígenos) difunden, y si se
encuentran en la proporción adecuada, producen complejos antígeno-anticuerpo
insolubles que precipitan y aparecen en el gel como bandas elipsoidales.
Una vez formadas las bandas de precipitación, el gel puede lavarse para eliminar
las proteínas que no hayan inmunoprecipitado y, posteriormente, teñirse como se ha
descrito anteriormente. Cada proteína de la muestra produce una banda de
precipitación independiente, por lo que es posible identificar el número de
constituyentes de la muestra que son reconocidos por los anticuerpos.
15
3.5.2 Electrofóresis en gel de poliacrilamida (PAGE)
16
acrilamida (% C) representa el porcentaje de este monómero en el gel y determina el
grado de entrecruzamiento.
La estructura del gel comienza a ser evidente a 4 % T; 0,2-5 % C. Los factores que
gobiernan la talla del poro del gel son complicados, pero en general el tamaño del poro
disminuye con el incremento del % T. Las proporciones en que ambas se encuentran
determinan las propiedades físicas del gel como su densidad, elasticidad, resistencia
mecánica y el tamaño del poro. En general se recomiendan valores de T de 5 a 15 % y
de C de 2 a 4 %. Para separar moléculas por tamaño, es necesario tomar en cuenta la
relación entre el poro efectivo del medio y el tamaño de la molécula que se pretende
separar. Si el poro del medio es significativamente mayor que la molécula, la
separación electroforética será sobre la base de diferencias de carga y el tamizaje
molecular será mínimo. Al aplicar muestras biológicas en un gel con gradiente de
acrilamida, todas las macromoléculas comienzan su migración a bajo porcentaje y en la
medida en que avanzan se encuentran con poros más pequeños que retardan su
movimiento. Las moléculas menores comienzan a tener alta fricción cuando los poros
son más pequeños, mientras que las grandes comienzan la fricción en los poros de
mayor tamaño.
17
parte delantera de la banda se frenan más (encuentran antes los poros más pequeños)
que las moléculas de la parte trasera, con lo que las bandas se estrechan,
concentrándose sobre su parte delantera, produciendo bandas muy finas y con una
gran resolución.
En la cubeta, el tampón del reservorio superior cubre el gel y los pocillos en los que
se ha de cargar la muestra. Con el fin de que ésta, disuelta en el mismo tampón, no
difunda al depositarla en los pocillos, se le puede añadir un compuesto que aumente
su densidad (normalmente, glicerol o sacarosa). El volumen de muestra que puede
aplicarse a cada pocillo depende del tamaño de la propia muestra y del pocillo, pero
oscila entre 10- 100µL con un máximo de 200µL. En el tampón de la muestra, también
se añade el marcador electroforético (el más utilizado es el azul de bromofenol) para
poder determinar el final del proceso.
Fig. 13 Preparación del gel para una electroforesis en placa. Elementos para ensamblar el molde. Los
espaciadores (sujetados con pinzas de presion) colocados sobre los cristales forman el molde. Adición de la
solución de monómeros. Colocación del peine en la parte superior. El gel formado presenta los pocillos
donde aplicar la muestra. Las dimensiones habituales de los geles son: 10-20 cm (L) x 10-15 cm (A) x 0.5-1.5
mm (E).
18
• Persulfato de amonio y 3-dimetilamino propio-nitrilo (DMAPN).
• Peróxido de hidrógeno, sulfato de hierro y ácido ascórbico.
(H 3O+) migran hacia el cátodo, esto provoca un movimiento relativo del solvente
respecto al soporte sólido y que las moléculas no cargadas sean transportadas hacia el
cátodo a pesar de no tener grupos ionizados.
La fuerza iónica del sistema tampón debe mantenerse a un nivel adecuado para
garantizar la solubilidad de la muestra y suficiente capacidad amortiguadora. Es usual
utilizar concentraciones de tampón en un rango entre 0,025 y 0,1 mol/L, pero pueden
emplearse concentraciones sobre 0,5 mol/L en sistemas fuertementes ácidos, pues a
bajos valores de pH muchos ácidos débiles (que son los más empleados) están
débilmente ionizados y es necesaria una alta concentración para obtener la adecuada
capacidad amortiguadora.
Los geles más finos son más económicos porque emplean menos reactivos y
pueden ser eficientemente refrigerados durante la corrida, por lo tanto pueden ser
corridos a mayor voltaje, lográndose así una alta resolución en corto tiempo. Los
19
tiempos de tinción y destinción son menores también porque la difusión es muy
rápida; sin embargo como el gel es tan fino es más propenso a perturbaciones y
problemas en la polimerización.
Este hecho es debido a que la zona de concentración tiene un tamaño de poro muy
grande (2.5-3.0%T), por lo que no es restrictiva frente al de la zona de resolución cuyo
tamaño de poro sí es restrictivo.
En algunas proteínas hay puentes disulfuro entre los residuos de Cys (para formar
cistinas) de una misma cadena polipeptídica (puentes intracatenarios) o de diferentes
cadenas (puentes intercatenarios) de algunas proteínas con estructura cuaternaria.
20
Estos puentes se pueden romper mediante tratamiento con determinados agentes
reductores, como por ejemplo, el ß-mercaptoetanol (ß-ME) o el ditiotreitol (DTT).
• Detergentes iónicos. Pueden tener carga positiva (catiónicos) que se usan para
la separación de proteínas muy ácidas o muy básicas; el más utilizado es el
cetiltrimetilamonio (CTAB). Otros poseen carga negativa y un fuerte carácter
desnaturalizante; el más empleado es el dodecilsulfato sódico o lauril sulfato
sódico (SDS).
3.5.2.8 PAGE-SDS
Permite el cálculo de parámetros moleculares (al contrario que el resto de los tipos
de electroforesis), pues los complejos SDSproteína se separan estrictamente según su
tamaño molecular. El SDS interacciona con las proteínas formando complejos de
características comunes independientemente de las de cada proteína.
Las proteínas unen una molécula de SDS por cada dos aminoácidos, lo que implica
que las cargas propias de las proteínas quedan enmascaradas o anuladas; asimismo, la
molécula de SDS proporciona una carga negativa, por lo que los complejos SDS-
proteína están cargados negativamente de forma uniforme (la carga por unidad de
masa es prácticamente constante para todos los complejos).
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complejos SDS-proteína (que, además, tienen la misma forma elipsoide), esta
movilidad es solamente función de la masa molecular, es decir, cuanto menor sea la
masa molecular de la proteína, mayor será la movilidad de la misma y viceversa.
En resumen, la SDS-PAGE es la electroforesis más utilizada para el análisis de
proteínas debido a:
• Todos los complejos SDS-proteína tienen carga negativa y migran, por lo tanto,
en el mismo sentido.
El SDS debe incluirse en el tampón de los reservorios, en los de los geles (de
concentración y de resolución) y en el de la muestra para mantener las condiciones
desnaturalizantes. La PAGE-SDS puede realizarse en condiciones reductoras o no
reductoras; la ausencia de reductores se traduce en que si las proteínas poseen puentes
disulfuro, el SDS sólo producirá una desorganización parcial de la estructura (Fig. 15).
Si son dos o más las cadenas unidas por puentes disulfuro intercatenarios, en presencia
de SDS, quedarán más o menos desplegados en función de la posición de los puentes
disulfuros (Fig. 16).
22
Fig. 15 Efecto del SDS y del DTT en la movilidad electroforética de proteínas monoméricas. En una
proteína nativa de 25 kDa, carente de puentes disulfuro, el tratamiento con SDS ( ) ó SDS+DTT ( )
producen idéntico resultado. La proteína con un puente disulfuro intracatenario, en presencia de SDS se
desnaturaliza parcialmente, manteniendo sin desplegar la zona que abarca el disulfuro. El tratamiento con
SDS+DTT rompe el puente disulfuro y permite el despliegue total de la proteína.
23
Fig. 16 Efecto del SDS y del DTT en la movilidad electroforética de proteínas oligoméricas.
Una vez finalizada la PAGE, se separa el gel de las placas de vidrio haciendo
palanca con una espátula y se visualiza con un colorante; el más utilizado es el azul de
Coomassie con el que se pueden visualizar 0.1-0.5 µg de proteína por banda. Otro
método de tinción es con sales de plata, que tiene como principal ventaja su elevada
sensibilidad (hasta 0.1ng de proteína por banda), aunque tiene como desventajas que es
muy laboriosa y cara, presenta elevado background, baja reproducibilidad, algunas
proteínas no se tiñen y, sobre todo, no es totalmente específico de proteínas, ya que
algunos lipopolisacáridos, ácidos nucleicos y polisacáridos también se tiñen.
24
número mínimo de componentes (bandas) de cada muestra. Cada banda se caracteriza
por su movilidad electroforética relativa (“Ur”).
Ur = Lmuestra/Lmarcador
donde:
Lmuestra = Longitud recorrida por la muestra
Lmarcador = Longitud recorrida por el marcador
Es importante señalar que la relación lineal entre logM y Ur se mantiene para una
concentración dada de poliacrilamida (%T) y sólo en un corto intervalo de peso
molecular. De forma general, en geles del 15%T la relación lineal es válida para
proteínas comprendidas entre 12 y 45 kDa; en geles del 10%T, el intervalo lineal va
entre 15 y 70 kDa, y en los del 5%T, entre 25 y 200 kDa.
Hay proteínas con un comportamiento anómalo en SDS-PAGE; en las
glicoproteínas y las lipoproteínas, que llevan unidos azúcares o lípidos, la parte no
proteica no une SDS y puede impedir el acceso del mismo a la proteína. Por ello, las
glicoproteínas y lipoproteínas unen menos SDS que la mayoría de las proteínas; esto
hace que la relación carga/tamaño sea menor y, por lo tanto, tengan menor movilidad
electroforética y se comporten como si tuvieran mayor tamaño.
25
bandas pues las concentra en regiones mas estrechas, además de incrementar el rango
de pesos moleculares que se pueden resolver en un mismo gel comparado con los de
una concentración fija.
La electroforesis capilar (Fig. 19) se basa en los mismos principios de las técnicas
electroforeticas convencionales, pero utiliza condiciones y tecnología distinta que nos
permiten obtener una serie de ventajas al respecto. Esta separación de péptidos
realizada sobre un capilar de silica fundida a potenciales elevados 20 a 30 Kv en un
campo de 400 a 500 v/cm refrigerados por aire.
La corriente electroendosmótica (FEO) generada por los grupos silanol de la
superficie interna del capilar da como resultado una corriente plana del frente del
líquido que contrasta con el frente parabólico de la cromatografía líquida de alta
resolución. La ventaja de esta técnica es que el capilar de silica fundida que
generalmente se cubre con una capa de polimina para darle mayor rigidez y
resistencia, tiene una ventaja a través de ella que permite el pasaje de la luz UV de tal
manera que la visualización es on-line.
Con esta técnica descrita es posible separar cationes, aniones, proteínas,
macromoléculas y sustancias no cargadas en forma simultánea.
26
Fig. 19 Electroforesis capilar
Fig. 20 Curva de titulación de una proteína. Representación de la carga neta (Q) de una proteína en
función del pH.
27
grupos ácidos y básicos, con un pI que abarca desde 2.5 hasta 11.0, con gran capacidad
de tamponación cerca de su pI y con una gran solubilidad y conductividad.
Una de las aplicaciones más importantes del EEF es el cálculo de pI (Fig. 21); en
el pocillo I se aplican los marcadores de pI, y en el II la muestra (X) cuyo pI se desea
conocer. El carril III (sombreado) se emplea para determinar el gradiente de pH. Una
28
vez corrido el gel, se trocea el carril III y cada segmento (de 1-2 mm) se introduce en
1mL de agua, determinándose su pH. Finalmente, se representa el pH de cada fracción,
frente a su posición en gel. La distancia migrada por la muestra (X) se interpola en la
recta obtenida, determinándose así su pH.
Hay que volver a destacar, una vez más, que el EEF es un criterio de pureza
negativo, es decir, varias bandas indican que la muestra es heterogénea, pero la
aparición de una única banda no permite afirmar que la muestra sea homogénea, ya
que pueden coexistir proteínas diferentes con igual pI; no obstante, cuanto menor sea
el gradiente de pH utilizado, mayor será la probabilidad de que al aparecer una banda,
la muestra sea homogénea.
29
Sin embargo, normalmente, la idea de electroforesis bidimensional suele referirse a
la combinación de los dos tipos de electroforesis más resolutivos: electroenfoque
(primera dimensión) y SDS-PAGE (segunda dimensión) (Fig. 22).
4.1.1 Proteólisis.
30
especificidad y eficiencia en el rompimiento de las proteínas, así como un mínimo de
reacciones laterales.
La enzima más utilizada para este fin es la tripsina, ya que produce péptidos
trípticos de tamaño adecuado (tamaño promedio de 9 aminoácidos) para su análisis
por MS. Al fragmentar proteínas básicas (con alto contenido de residuos de lisina y/o
arginina) con esta enzima se genera un alto número de fragmentos de tamaño pequeño
que no resultan adecuados para análisis de secuencia ya sea mediante el método de
Edman o MS. La acción de la tripsina se puede restringir sólo a los residuos de arginina
al modificar selectivamente los residuos de lisina (por succinilación y citraconilación),
propiciando así la producción de fragmentos de tamaño mayor que sean sujetos de
análisis de secuencia por los métodos anteriormente mencionados. En estudios sobre
modificaciones post-traduccionales, tales como fosforilación, resulta más conveniente
el empleo de otras enzimas. En la tabla 1 se indican otras enzimas utilizadas en
proteólisis.
31
azul de Coomassie de la muestra se afectará la eficiencia de digestión de la tripsina ya
que éste se une a los residuos básicos de las proteínas. La presencia de iones de plata,
de azul de Coomassie, y de detergentes como el SDS (que se ioniza fácilmente) puede
afectar también el análisis de MS.
32
4.2 Análisis de Secuencias Amino y Carboxilo terminal
33
Figura 23. Método de degradación de Edman.
Estimaciones empíricas sugieren que cerca del 40-50% de las proteínas que se
resuelven por electroforesis en 2-D están bloqueadas en el extremo N-terminal por
grupos formil, acetil y piroglutamil (por ciclización de residuos de glutamina en
condiciones ácidas). Si la proteína de interés no está bloqueada naturalmente aún
puede sufrir un bloqueo de su N-terminal durante la preparación de la muestra, en
especial durante la electroforesis. Para evitar el bloqueo del extremo N- terminal en las
proteínas de interés se han implementado algunas medidas tales como: adicionar
glicerol grado HPLC al buffer de muestra o correr la electroforesis con sólo el gel de
corrida y antes de colocar el gel empacador para evitar que los monómeros de
poliacrilamida reaccionen con los N- terminales de las proteínas. Existen también
diversos métodos para desbloquear proteínas, aunque no han probado ser muy
eficientes; es por ello que no se recomienda su empleo para proteínas poco abundantes.
34
4.2.2 Secuenciación del extremo carboxilo terminal.
5. ESPECTROMETRÍA DE MASAS
Para el análisis de muestras biológicas por MS es necesario que las moléculas estén
cargadas eléctricamente y secas. Este requisito se cumple convirtiendo las moléculas en
iones desolvatados. Han sido varias las técnicas que se han desarrollado con este fin,
las primeras de ellas se basaron en el impacto de electrones y en la ionización química.
Estas técnicas resultaron efectivas para ionizar moléculas pequeñas pero no para la
ionización de moléculas de alto peso molecular, como las biomoléculas. La
espectrometría de masas se revolucionó en 1981 gracias a la introducción del
bombardeo rápido de átomos (FAB, fast atom bombardment) por Barber. Esta técnica
posibilitó la ionización y detección de biomoléculas con relativamente buena
sensibilidad. Hoy en día, los métodos más comúnmente empleados para generar iones
desolvatados son el MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionization) y el ESI
(electrospray ionization), estos han reemplazado por completo al FAB. Tanto el MALDI
como el ESI son métodos de ionización suaves donde se mantiene relativamente la
integridad de la muestra.
35
5.2.1 MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionization)
Este método fue descrito en 1989 por Fenn. En el ESI, la muestra líquida fluye
desde un microcapilar hasta el orificio del espectrómetro de masas, donde una
diferencia de potencial entre el microcapillar y la entrada al espectrómetro de masas
genera una nube de finas gotas cargadas eléctricamente. Conforme se evapora el
solvente, disminuye el tamaño de las gotas mientras que la carga de las mismas
permanece constante, dando como resultado iones desolvatados. Las cargas eléctricas
se distribuyen estadísticamente en los sitios potenciales de carga de las moléculas de
36
analito, dando como resultado iones multivalentes. A cada ión multivalente se le
denomina un estado de carga, y es común obtener una distribución de estados de carga
al analizar macromoléculas por ESI. Las proteínas también generan iones
multivalentes, sin embrago generalmente la resolución de cada ión multivalente no es
suficiente para determinar el número de cargas que posee el ión, con el cual se podría
determinar su masa real. Por lo tanto se utilizan las masas de al menos 2 iones
multivalentes para calcular la masa real de la proteína mediante algoritmos de
deconvolución.
La técnica de electrospray genera flujos que van de 10 a 100 µL/min. Este flujo
resulta problemático para el análisis de proteínas, específicamente debido a que la
muestra se consume rápidamente y a que el tiempo de análisis es muy corto. Por ello,
una mejora importante a este método de ionización ha sido el desarrollo de la
ionización por nanospray, donde se utilizan microcapilares con diámetro interno de 1
a 2 µm y velocidades de flujo de 5 a 10 nL/min. Estos flujos permiten reducir la
cantidad de muestra consumida e incrementar el tiempo disponible para el análisis.
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Tabla 3. Ventajas y desventajas de los métodos de ionización MALDI y ESI
Ventajas Desventajas
MALDI
Límite de tamaño 300,000 Da Ruido de fondo generado por la matriz,
Sensibilidad en el orden de fentomoles a problemas en compuestos de menos de 1,000
picomoles. Da.
Ionización suave con baja o nula Imposible estudiar interacciones no
fragmentación de los péptidos. covalentes.
Apropiado para análisis de mezclas complejas. Capacidad mínima para secuenciación
Las muestras no requiren preparación previa. (MS/MS) y determinación de modificaciones
post-traduccionales a menos que se equipe con
un reflectrón (post-source decay).
ESI
Límite de tamaño 70,000 Da Baja tolerancia a sales. Necesario utilizar RP-
Sensibilidad en el orden de fentomoles a HPLC.
picomoles. Alta sensibilidad a contaminantes.
Ionización suave. Capaz de observar Baja tolerancia a mezclas. La pureza de la
interacciones no covalentes nativas. muestra es muy importante.
No hay interferencia de alguna matriz. Iones multivalentes. Puede ocasionar
Fácil de adaptar a análisis de tripe confusión especialmente al analizar mezclas.
cuadrupolo.
Formación de iones multivalentes: mayor
precisión en el cálculo de masas, análisis de
iones de alto peso con un relativamente bajo
rango m/z del instrumento.
Excelente para determinar modificaciones
post-traduccionales.
Capacidad para secuenciación de péptidos
excelente.
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Figura 26. Analizador de iones de cuadrupolo.
En precursor ion scan, el primer cuadrupolo permite que todos los componentes de
la mezcla pasen a la celda de colisión (segundo cuadrupolo). El tercer cuadrupolo, que
actúa como filtro de masas, está fijo en un valor de masa, de manera que sólo los
péptidos que hayan generado fragmentos con la masa especificada por el filtro podrán
ser detectados en el analizador de masas.
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Figura 28. Modos en que se emplea un cuadrupolo triple. 1) Product ion scan, 2) Precursor
ion scan, 3) Neutral loss scan.
Éste es uno de los analizadores más simples. Mide la relación m/z de un ión
determinando el tiempo requerido para recorrer la longitud de un tubo de vuelo desde
que el ión abandona la fuente de iones; el ión es impulsado con una velocidad inicial, la
cual depende directamente de su masa. El tiempo de vuelo del ión es proporcional a la
raíz cuadrada de su relación m/z dada una aceleración constante provocada por el
voltaje.
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Figura 29. Analizador de tiempo de vuelo.
Los analizadores híbridos se han convertido en una herramienta muy útil para la
secuenciación de proteínas. Combinando un cuadrupolo que actúe como filtro de masa
y una celda de colisión con un analizador ToF con reflectrón, es posible obtener
información con alta precisión, resolución y sensibilidad. Los analizadores híbridos
usualmente están acoplados a un sistema de HPLC.
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5.3.5 Analizadores ToF/ToF.
Este tipo de analizador, acoplado a una fuente de iones MALDI, se utiliza para
secuenciación de péptidos y huella de masa de péptidos. Dos analizadores ToF se
encuentran separados por una celda de colisión. El primer analizador ToF se emplea
como selector de iones. En la celda de colisión se producen choques de alta energía
entre los iones. Y el segundo analizador ToF resuelve los iones.
El FT-ICR, es una trampa de iones magnética. En este analizador los iones son
atrapados en una celda que está bajo un campo magnético fuerte. La celda está
compuesta por tres pares de placas (figura 31): placas de confinamiento
(perpendiculares al campo magnético), transmisoras y receptoras. Dentro de la trampa,
los iones se mueven en órbita circular, perpendicular al campo magnético. Los iones se
mantienen en la celda debido al potencial eléctrico aplicado a las placas de
confinamiento. Cuando se aplica un potencial eléctrico de radio-frecuencia en las
placas transmisoras los iones atrapados se excitan. Una frecuencia dada excita iones
con una relación m/z particular. La excitación de los iones provoca que giren en
órbitas mayores. Cuando los iones excitados pasan cerca de las placas receptoras se
detecta su frecuencia de rotación (que es inversamente proporcional a su masa) y se
induce una corriente en las placas. A esta corriente se le denomina corriente de imagen.
Mediante las transformadas de Fourier es posible medir simultáneamente todas las
frecuencias de rotación al mismo tiempo.
Figura 31. Analizador de masas FT-ICR. A) Placas de confinamiento, atropamiento de iones por campo
magnético. B) Placas transmisoras, excitación de los iones. C) Placas receptoras, generación de corriente de
imagen.
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5.3.7 Fragmentación de Iones.
Una vez que los iones son dirigidos a la cámara de colisión del espectrómetro de
masas, estos interactúan con el gas de colisión (N2 o Ar) y sufren una fragmentación
primaria.
Los fragmentos que se generan pueden ser muy variados (Figura 32). Si el después
de la fragmentación la carga se mantiene en el extremo N-terminal, el ión es designado
como “ión -b”; en cambio, si la carga se mantiene en el extremo C-terminal, el ión es
denominado un “ión -y”. La diferencia en masa entre un ión -b y un ión -y corresponde
a un aminoácido. Esta diferencia de masa entre los iones se utiliza para identificar los
aminoácidos, y con ello, la secuencia peptídica. Para distinguir entre los aminoácidos
leucina e isoleucina, que poseen la misma masa molecular, es necesario que la
fragmentación se lleve a cabo con energías de colisión muy altas, de manera que se
propicie la fragmentación de cadenas laterales de los aminoácidos.
Tanto los iones -b como los -y pueden perder NH3 (principalmente de los residuos
básicos como arginina y lisina), H2O (principalmente del alcohol contenido en residuos
de serina y treonina; y de los residuos que contienen grupos carboxilo libres como el
ácido glutámico y el aspártico) y CO. Cuando un ión –b pierde CO se forma un ión-a.
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Tabla 4. Bases de datos utilizadas para identificación de proteínas.
Esta técnica comprende los siguientes pasos: digestión de la proteína, análisis por
MALDI-ToF y empleo de algoritmos de búsqueda en bases de datos.
Para llevar a cabo el análisis de datos, cada proteína en la base de datos es digerida
teóricamente empleando el mismo agente utilizado para fragmentar la proteína
problema. Posteriormente se compara el espectro obtenido por MS (la huella de masa
del péptido) con los espectros teóricos generados en la base de datos; se calcula y
asigna una “puntuación”, la cual refleja la paridad entre los datos experimentales y los
teóricos obtenidos por la base de datos. La proteína identificada como la más probable
es aquella con la puntuación más alta.
Esta técnica posee la ventaja de ser bastante rápida, sin embargo no es buena
cuando se trabaja con mezclas de proteínas a pesar de que se han desarrollado algunos
programas para tal fin. La presencia de un alto número de modificaciones post-
traduccionales en la proteína problema puede generar un espectro de masa distinto a
los predichos por las bases de datos, lo que representa un problema para el análisis.
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6.2 Secuenciación utilizando datos generados con la técnica product ion scan en
MS/MS.
Es posible llevar a cabo un análisis manual del espectro de masa para determinar la
secuencia tomando como base los iones (de la serie b y y) generados.
Los datos también pueden interpretarse en bases de datos, a este tipo de búsqueda
se le denomina MS/MS no interpretado (uninterpreted MS/MS). Y generalmente basta
con obtener la secuencia de 2 péptidos para identificar una proteína de un genoma
conocido. Son muchas las bases de datos disponibles para realizar búsquedas de este
tipo, sin embargo presentan problemas en el análisis cuando existen modificaciones y
polimorfismo en las proteínas.
Cuando los péptidos son obtenidos por digestión con tripsina, el extremo C-
terminal de los mismos es arginina o lisina. En un espectro MS/MS, el residuo C-
terminal se puede observar en el fragmento correspondiente al ión-y1. Por tanto, el
punto de inicio de la serie y siempre será conocido. A la masa observada del ión-y1 hay
que añadir la masa de una molécula de agua y de un protón. Si la masa del ión– y1 es
de 175 Da, entonces el residuo es arginina; en cambio, si la masa es de 147 Da el
residuo es lisina. Una vez identificado el ión– y1 en el espectro, la secuencia de la serie
puede iniciarse a partir de ese punto.
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Figura 33. Identificación de proteínas por MS/MS. A) Resolución y digestión de la proteína. Análisis en
espectrómetro de cuadrupolo-ToF. B) Barrido del espectro y selección de ión precursor. C) Ampliación de
ión precursor. Identificación de la carga del ión. D) Ión precursor se somete a MS/MS. Espectro de iones
hijos. E) Identificación de la proteína mediante bases de datos.
• Debido a que la MPT representa una fracción muy baja del peso total de la
proteína, se requieren mayores cantidades de la muestra para el análisis.
• En algunos casos, los enlaces entre la MPT y el péptido se desestabilizan durante la
preparación de la muestra.
• Frecuentemente las MPT son transitorias, por lo que para el análisis resulta
complicado recuperar las proteínas en su estado modificado.
Las MPT que más comúnmente sufren las proteínas son la glicosilación y la
fosforilación. En este trabajo nos enfocaremos en esta última.
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7.1 Identificación de sitios de fosforilación.
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grupo fosfato (PO3- ) con una relación carga/masa de 79. La mezcla de péptidos se
rocía bajo condiciones básicas o neutras, y sólo se detectan los péptidos que al
fragmentarse generan un ión con m/z igual a 79. Una vez que se detecta un
fosfopéptido, la mezcla se rocía bajo condiciones ácidas y el análisis de la secuencia se
realiza por MS/MS convencional. Durante la fragmentación del péptido los residuos
modificados pueden ser identificados por la formación de productos específicos de la
β–eliminación del fosfoaminoácido. La fosfoserina produce deshidroalanina (69 Da),
mientras la fosfotreonina produce deshidroamino-2 ácido butírico.
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8. BIBLIOGRAFÍA
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