CRIBADO DE POSIBLES BACTERIAS PROBIÓTICAS DEL ÁCIDO LÁCTICO AISLADAS PARA LA PROPIEDAD DE

REDUCCIÓN DEL COLESTEROL Y LA ACTIVIDAD HIDROLASA DE LA SAL BILIAR

Resumen Se aisló un total de 142 aislados de bacterias del ácido láctico (LAB) de fuentes lácteas y no lácteas. Los
aislados de LAB se cribaron para la actividad antimicrobiana. De los 142 aislamientos, solo 68 aislamientos exhibieron
actividad antimicrobiana. Entre estos aislamientos, nueve mostraron actividad antimicrobiana de amplio espectro, así
como buena tolerancia a la sal biliar, al ácido y al fenol. Siete aislamientos de los últimos mostraron una reducción de
más del 20% y una actividad observada de sal hidrolasa de bilis (BSH). Los aislamientos prometedores se identificaron
utilizando métodos fenotípicos, bioquímicos y genéticos.

Introducción

En los últimos años, diferentes investigaciones respaldan la importancia de los probióticos como parte de la dieta
saludable para humanos y animales y como una forma de proporcionar una barrera natural, segura y efectiva contra
las infecciones microbianas (Angmo et al., 2016; Oh y Jung, 2015) . Según la definición de la Organización Mundial de
la Salud (OMS), los probióticos son "alimentos microbianos vivos que, cuando se administran en cantidades adecuadas,
conllevan un beneficio para la salud del huésped" (FAO / OMS, 2001). Entre los microorganismos habitualmente
utilizados, las bacterias del ácido láctico (LAB) se consideran un grupo principal de bacterias probióticas (Collins y
Gibson, 1999). Son no patógenos, tecnológicamente adecuados para procesos industriales, tolerancia ácida, tolerancia
biliar y producen sustancias antimicrobianas (Mojgani et al., 2015). Se clasifican como microorganismos generalmente
reconocidos como seguros (GRAS) debido a su uso prolongado y seguro como cultivos iniciadores en productos
fermentados.

Hoy en día, la mayoría de las bacterias probióticas pertenecen a los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium (Prasad
et al., 1998). Sin embargo, las especies que pertenecen a los géneros Lactococcus, Enterococcus y Saccharomyces
(Salminen y von Wright, 1998; Sanders y in't Veld, 1999) también se consideran microorganismos probióticos.

Según las directrices para la evaluación de los probióticos en los alimentos informadas por un grupo de trabajo
conjunto FAO / OMS (Vijaya et al., 2015), dos de las pruebas in vitro más utilizadas actualmente son la resistencia a la
acidez gástrica y las sales biliares, en estudios de supervivencia y crecimiento. Otras propiedades funcionales utilizadas
para caracterizar los probióticos es la producción de compuestos antimicrobianos y la eliminación del colesterol (Park
et al., 2007; Xie et al., 2015). El mecanismo a través del cual los probióticos pueden antagonizar a los patógenos implica
la producción de compuestos antimicrobianos tales como ácido láctico, ácido acético, peróxido de hidrógeno y
bacteriocinas.

Ciertos estudios mostraron que entre los otros efectos del probiótico, el consumo de bacterias del ácido láctico redujo
el transporte de microorganismos patógenos, disminuyó ciertos factores de riesgo de enfermedad arterial coronaria
y dio como resultado una reducción dependiente de la dosis en los síntomas del síndrome del intestino irritable (Vries
et al. , 2006). Parece que, en la investigación de cepas con potencial probiótico, los alimentos también podrían ser una
buena fuente de cepas adecuadas para encontrar nuevas cepas probióticas para productos alimenticios funcionales.
Se ha descubierto que varias bacterias probióticas producen hidrolasa de sal biliar (BSH) que ayuda a reducir el
colesterol sérico (Miremadi et al., 2014) y, por lo tanto, la actividad de BSH también se considera un criterio adicional
para la selección de probióticos. El objetivo del presente estudio fue aislar, identificar y detectar posibles bacterias
probióticas del ácido láctico con una alta capacidad de colesterol y la actividad hidrolasa de la sal biliar.

Análisis estadístico

Los datos se analizaron estadísticamente con el software CoStat (versión 6.303). El análisis de varianza de una vía se
utilizó para estudiar la diferencia significativa entre medias, con un nivel de significación en P = 0,05.

Resultados y discusiones

Detección de aislados de LAB para su actividad antimicrobiana

Ciento cuarenta y dos LAB se aislaron de diversas fuentes (Tabla 1). Todas las bacterias aisladas se ajustan a la
clasificación de LAB como Gram-positivo, catalasa negativa (Sharpe, 1979). La actividad antimicrobiana es uno de los
criterios de selección más importantes para probióticos. Los aislamientos de LAB se cribaron para la producción de
agentes antimicrobianos contra 10 patógenos (Tabla 2).

De 142 aislamientos de BAL solo 68 aislamientos exhibieron actividad antagónica en diversos grados. De las sesenta
cepas de LAB aisladas de muestras de zabady y queso, solo treinta y ocho cepas mostraron actividad inhibitoria contra
los patógenos probados. No se pudo observar actividad antagonista en las cepas de BAL aisladas de leche y heces de
bebés. Las cepas de LAB que mostraron actividad inhibidora contra más de seis de los patógenos probados se aislaron
a partir de muestras de leche de Boza y Rayeb. Por otro lado, los aislamientos de LAB obtenidos de zabady, queso Ras
y Karish exhibieron actividad antagonista solo contra tres o menos de los patógenos probados. Los patógenos
indicadores se pueden organizar en orden descendente de acuerdo con su sensibilidad a los aislados analizados de la
siguiente manera: Escherichia coli BA 12296 fue sensible a 41 aislados mientras que Staphylococcus epidermidis,
Salmonella senftenberg ATCC 8400, Staphylococcus aureus NCTC 10788, Streptococcus pyogenes, Klebsiella
pneumoniae ATCC12296, Candida albicans ATCC MYA-2876, Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis y Bacillus
subtilis DB 100 fueron sensibles a 28, 29, 23, 19, 15, 14, 10, 2 de los aislados de BAL, respectivamente.

Se seleccionaron todos los aislamientos con actividad antimicrobiana contra cualquiera de los patógenos probados
(68 aislamientos) para la determinación cuantitativa de sus actividades antimicrobianas (Tabla 3). Entre los 68
aislamientos, solo 9 aislamientos mostraron actividad de amplio espectro contra cuatro patógenos probados al menos.

Entre los nueve aislados de LAB, solo un aislado (RM39) mostró una fuerte actividad de 1600 UA / ml frente a Klebsiella
pneumoniae ATCC12296 mientras que cuatro aislamientos exhibieron actividad inhibidora de 800 AU / ml frente a
cada uno de Escherichia coli (BO51); Streptococcus pyogenes (RM28); Estafilococo aurífero NCTC 10788 (BO3, RM3),
Salmonella senftenberg ATCC 8400 (RM28). El crecimiento de patógenos es inhibido por la producción de compuestos
antimicrobianos tales como ácidos orgánicos, peróxido de hidrógeno, diacetilo y bacteriocinas por LAB, así como su
competencia por nutrientes (Bezkorvainy, 2001; Tambekar et al., 2009). Los nueve aislamientos de LAB prometedores
examinó otros criterios probióticos como la tolerancia a la bilis, el ácido y el fenol, así como sus capacidades de
eliminación del colesterol.

Supervivencia de aislados de bacterias del ácido láctico seleccionadas en condiciones simuladas de jugo gástrico a 37
° C.

Table 4 Supervivencia de aislados de bacterias del ácido láctico seleccionadas en condiciones simuladas de jugo gástrico a 37 ° C.
Código de aislamientos Media del recuento viable (log10 CFU ml-1) ± SD * Porcentaje de supervivencia (%)

Time of exposure (h)

0 1 2 3
Bo 3 8.29 ± 0.41a 7.80 ± 0.14bcd 7.04 ± 0.20cd 6.32 ± 0.25d 76.2
Bo 34 8.31 ± 0.29a 7.91 ± 0.03bc 7.21 ± 0.16bc 6.37 ± 0.08d 76.6
Bo 35 8.17 ± 0.317a 7.60 ± 0.23cde 7.36 ± 0.27bc 7.22 ± 0.28ab 88.3
Bo 37 8.55 ± 0.22a 7.86 ± 0.04bcd 7.51 ± 0.14ab 7.33 ± 0.13a 85.7
Bo 51 8.37 ± 0.25a 7.55 ± 0.07de 7.13 ± 0.10cd 6.45 ± 0.38cd 77
Bo 52 8.37 ± 0.44a 8.33 ± 0.45a 7.57 ± 0.17ab 6.59 ± 0.24cd 78.7
RM 3 8.35 ± 0.34a 7.28 ± 0.17e 6.81 ± 0.19de 6.81 ± 0.19bc 81.5
RM 28 8.41 ± 0.44a 7.58 ± 0.13cde 6.60 ± 0.41e 5.72 ± 0.27e 68
RM 39 8.37 ± 0.28a 8.03 ± 0.20ab 7.85 ± 0.09a 6.48 ± 0.30cd 77.4
abcde
Means in the same column followed by different superscript letters are significantly different (P < 0.05).
BO: – Boza & RM: – Rayeb Milk.
*
Results are expressed as mean ± SD, and each value is the average of three experiments and each was carried out in duplicate.
*Los resultados se expresan como media ± desviación estándar, y cada valor es el promedio de tres experimentos y
cada uno se llevó a cabo por duplicado.

Tolerancia al ácido y la bilis

Como los probióticos generalmente se administran por vía oral, deben tener la capacidad de sobrevivir al paso por el
estómago y el intestino delgado. Por lo tanto, la resistencia al bajo pH del jugo gástrico en el estómago y la sal biliar
en el intestino delgado es uno de los criterios de selección importantes para el probiótico (Olejnik et al., 2005). En el
presente estudio, todos los aislados de LAB seleccionados pudieron sobrevivir al jugo gástrico simulado a pH 2 después
de 3 h de incubación (Tabla 4). Conservaron diversos niveles (68-88.3%) de viabilidad. La mayor supervivencia fue para
el aislado BO35 mientras que se observó la menor supervivencia para el aislado RM28.

La tolerancia ácida a las bacterias es importante no solo para soportar las tensiones gástricas, sino también como un
requisito previo para su uso.

como adyuvantes dietéticos y permite que las cepas sobrevivan durante un período de tiempo más prolongado en
alimentos de alto contenido en ácido sin una mayor reducción en humanos (Conway et al., 1987; Prasad et al., 1998).

La tolerancia a las sales biliares es un requisito previo para la colonización y la actividad metabólica de las bacterias en
el intestino delgado del huésped (Havenaar et al., 1992). Esto ayudará a Lactobacillus spp. y Lactococcus spp. llegar al
intestino delgado y al colon y contribuir al equilibrio de la microflora intestinal (Tambekar y Bhutada, 2010). Todas las
cepas probadas exhibieron tolerancia biliar en diversos grados. Entre los LAB analizados aislados en el presente
estudio, el aislado BO34 demostró la tolerancia más alta a la sal biliar seguida por el aislado BO52 (Tabla 5).

Tolerancia fenol

Para que una cepa sea un probiótico, debe sobrevivir a la acción de metabolitos tóxicos, principalmente fenoles,
producidos durante el proceso de digestión (Hoier, 1992). Algunos aminoácidos aromáticos derivados de proteínas
dietéticas o producidas endógenamente pueden ser desaminados en el intestino por bacterias, lo que conduce a la
formación de fenoles que tienen propiedades bacteriostáticas (Suskovic et al., 1997).

Bacteriostáticas: no mata pero impide su crecimiento y reproducción.

La Fig. 1 ilustra el efecto de dos concentraciones diferentes de fenol (0.2% y 0.5%) sobre el crecimiento de nueve
aislamientos de LAB después de 24 h de incubación en medio MRS a 37 ° C. Los aislados de LAB examinados mostraron
diferentes grados de sensibilidad hacia diferentes concentraciones de fenol.

La tolerancia mas alta (95.89%) a la conecntracion de fenol del 0.2% fue demostrada para BO37 seguido de RM39
(94.1%), mientras que BO52 tuvo la tolerancia más baja. A una concentración de 0,5 de fenol, todos los aislados de
LAB analizados mostraron un porcentaje de crecimiento relativo variable entre 15,1% y 21,7%. Vizoso Pinto et al.
(2006) observaron grados variables de sensibilidad para cuatro cepas de Lactobacillus johnsonii y seis cepas de L.
plantarum para una concentración de fenol del 0.4%, mientras que las cepas de L. plantarum fueron menos sensibles.

Eliminación de colesterol por aislamientos LAB

La hipercolesterolemia (nivel elevado de colesterol en la sangre) se considera un factor de riesgo importante para el
desarrollo de enfermedad coronaria. Por lo tanto, reducir el nivel de colesterol sérico es importante para prevenir la
enfermedad. La eliminación del colesterol la capacidad de los aislados de LAB se evaluó in vitro en presencia de oxgall
después de 24 h de crecimiento anaeróbico a 37 ° C (Fig. 2). Los nueve aislamientos de LAB mostraron la capacidad de
eliminar el colesterol de los medios. Exhibieron grados variables de capacidad para reducir el colesterol, que oscilaron
entre el 8,4% y el 43,5%. El aislado BO37 manifestó una capacidad superior (43.75%) para eliminar el colesterol del
medio que era significativamente más alto que los de los otros aislados de BAL examinados. El valor más bajo de la
asimilación del colesterol se remonta en el aislado BO35. La capacidad de reducción del nivel de colesterol in vitro en
medios de cultivo modelo se ha demostrado para numerosas cepas de LAB (Pereira y Gibson, 2002, Lavanya, 2001,
Wang et al., 2012, Miremadi et al., 2014). Se requieren más estudios para determinar los mecanismos implicados en
la eliminación del colesterol por los aislados de LAB probióticos.

Selección de aislamientos de BAL para la actividad de BSH BSH (hidrolasa de las sales biliares)
Determinación cualitativa de la actividad hidrolasa de sales biliares

La capacidad de las cepas probióticas para destoxificar la sal biliar mediante la producción de la actividad de la enzima
BSH a menudo se ha incluido entre los criterios para la selección de cepas probióticas (Noriega et al., 2006). La sal
hidrolasa de bilis es una enzima que cataliza la desconjugación de la sal biliar para liberar ácidos biliares primarios
libres (Gilliland y Speck, 1977).

Cuando los aislados de LAB que producían hidrolasa de sal biliar se diseminaron sobre placas MRS que contenían TDCA,
el ácido biliar conjugado con taurina se desconjugaba produciendo ácido desoxicólico.

La actividad de desconjugación de los aislados de LAB se manifestó en la Fig. 3, y cantidades copiosas de ácido
desoxicólico se precipitaron alrededor de las colonias activas y se difundieron en el medio circundante.

De los nueve aislamientos LAB seleccionados previamente en función de su alta actividad antimicrobiana, ocho
aislamientos mostraron actividad BSH a diferentes niveles. Cuatro aislamientos (BO35, BO37, BO52, RM39) exhibieron
una alta actividad de BSH al proporcionar grandes zonas de precipitación (2.03, 2.45, 2.25 y 1.98 mm, respectivamente)
alrededor de las colonias en el ensayo de placa. No obstante, los otros cuatro aislamientos demostraron baja actividad
de BSH al expresar zonas de precipitación pequeñas (menos de 1,5 mm).

La presencia de hidrolasa de sal biliar (BSH) en los probióticos los hace más tolerantes a las sales biliares, lo que
también ayuda a reducir el nivel de colesterol en la sangre del huésped (Noriega et al., 2006).

Al contrario de los resultados del presente estudio, Begley et al. (2006) informaron que la actividad de BSH no se ha
detectado en bacterias aisladas de entornos en los que las sales biliares están ausentes. Vale la pena mencionar que
los ocho aislamientos de BAL positivos para BSH no están asociados con el entorno gastrointestinal.

Determinación cuantitativa de la actividad de hidrolasas de sales biliares

La mayor actividad de BSH total (3,09 u / ml) frente a la sal biliar mostró mediante aislado de LAB de RM39 en
comparación con otros aislados de LAB. Tabla 6. En contraste, se demostró la actividad de BSH total más baja (0,25 u
/ ml) para el aislado de RM3. La actividad específica de BSH no se correlacionó bien con la actividad total de BSH por
la mayoría de los aislados de LAB debido a la variación del contenido de proteína en los extractos celulares. Los aislados
RM39 y RM3 tenían una actividad de BSH total alta (3,09 u / ml) y baja (0,25 u / ml), respectivamente, y exhibían la
misma tendencia también con respecto a la actividad específica. Mientras tanto, el aislado BO37 que tenía una alta
actividad total de BSH (2,47 u / ml) mostró una actividad específica baja (0,85 u / mg). Resultados similares fueron
reportados por Liong y Shah (2005) para cepas de lactobacillus hacia diferentes sales biliares. Varios estudios han
indicado que el mecanismo para la eliminación in vitro del colesterol está relacionado con la actividad hidrolasa de la
sal biliar de las cepas probióticas. Además, la descomposición de las sales biliares por la enzima BSH interrumpiría la
formación de la micela de colesterol, que a su vez evita la absorción del colesterol.

A partir de los datos genéticos, era obvio que BSH es una enzima intracelular. Esto es consistente con la observación
de que no la actividad enzimática estaba presente en los sobrenadantes de cultivos nocturnos, mientras que la
actividad se liberaba mediante sonicación u otros métodos de disrupción celular o mediante lisis en ensayos realizados
con células completas debido a las propiedades líticas de las sales biliares (Lunden y Savage, 1990; Grill et al. al., 1995;
Tanaka et al., 2000).

Identificación de aislamientos prometedores de LAB

Caracterización fenotípica

Las siete cepas aisladas prometedoras (BO3, BO34, BO37, BO51, BO52, RM28, RM39) son Gram positivas, catalasas
negativas, que no forman esporas y que fermentan la glucosa. Todos los aislamientos tienen forma de varilla excepto
RM39 y BO37 que son celdas esféricas. Las características fisiológicas y bioquímicas de los aislados de BAL
seleccionados, Tabla 7, son similares a los descritos en el Manual de Determinantes de Bacteriología de Bergey (Logan
y De Vos, 2009) para los géneros Lactobacillus y Lactococcus. Además, la caracterización bioquímica utilizando API 50
CHL para Lactobacilli y API 20 para cocci mostró la similitud en las características con las correspondientes especies de
LAB identificadas (Tabla 8). Bill et al. (1992) y Klinger et al. (1992) indicaron que algunos sistemas de identificación
comercial a menudo arrojan buenos resultados con respecto a la identificación del género, pero que no eran
totalmente adecuados a nivel de especie.

Identificación molecular

Los métodos moleculares son importantes para la identificación bacteriana (Drancourt et al., 2000; Sghir et al., 2000;
Greetham et al., 2002; Heilig et al., 2002) y posiblemente más precisos para LAB que los métodos convencionales
fenotípicos. En el presente estudio, 16sr-DNA del ADN genómico total de aislamientos prometedores de LAB se
amplificó y se secuenció para su identificación. La amplificación usando cebador universal produjo un producto de PCR
de aproximadamente 600 pb (Fig. 4). Los datos de secuenciación de 16S r-DNA purificado de aislados se emplearon
para la identificación bacteriana. Las secuencias de los aislados seleccionados se alinearon con las secuencias 16S r-
DNA de la base de datos GenBank (sitio web) para identificar el microorganismo estudiado. Los datos de secuenciación
del ADNr 16S de los aislados seleccionados mostraron claramente (BO3) 90% de homología con Lactobacillus
rhamnosus y (BO34) 96% de homología con Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus y (BO 37) 99% de homología
con Lactococcus lactic subsp. lactis & (BO 51) 100% de homología con Lactobacillus paracasei & (BO 52) 100% de
homología con Lactobacillus paracasei & (RM 28) 100% de homología con Lactobacillus gasseri y (RM 39) 98% de
homología con Lactococcus lactic subsp. lactis.

Conclusión

En el presente estudio, se aislaron 142 cepas de LAB de diferentes fuentes y solo se seleccionaron nueve aislamientos
en función de su alta actividad antagonista. Los nueve aislamientos prometedores de LAB exhibieron una buena
resistencia a las condiciones gastrointestinales (pH, 2, sal biliar, 0.3%, fenol 0.2-0.5%), eliminación de colesterol alto y
actividad expresada de BSH. Entre los aislamientos de LAB prometedores, BO37 que se aisló de Boza e identificado
como Lactococcus lactic subsp. Lactis manifestó el más alto capacidad de eliminación de colesterol (43.7%) y buena
actividad de BSH (2.47 u / ml). En consecuencia, debido a sus buenas propiedades probióticas, esta cepa podría
utilizarse potencialmente en alimentos funcionales y productos para la salud, especialmente cuando la reducción del
colesterol en los alimentos es el objetivo principal. Es necesario un estudio in vivo adicional para probar el efecto
hipocolesterolémico de la Lactococcus lactic subsp aislada. lactis. Además, se requieren estudios in vitro para
determinar los mecanismos implicados en la reducción del colesterol mediante un aislado tan prometedor.