12 Martinez y Otros Tolerancia

• Patricia Martínez-Nieto, uen •Bernal-Castillo,
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TOLERANCIA Y DEGRADACION DEL GLIFOSATO POR BACTERIAS AISLADAS DE SUELOS

CON APLICACIONES FRECUENTES DE ROUNDUP SL®
Por Patricia Martínez- Nieto, Jaime Bernal- Castillo,

Erika Agudelo-Fonseca y Sandra Bernier-López1
patingli@yahoo.com
Departamento de Química, Pontificia Universidad Javeriana - Bogotá, Colombia
RESUMEN
Esta investigación evaluó la degradación del glifosato, la resistencia bacteriana a diferentes
concentraciones de este compuesto y la afinidad por compuestos hidrofílicos o hidrofóbicos de
bacterias aisladas de suelos donde se emplea comúnmente el herbicida Roundup SL®. En las
muestras de suelos se aislaron catorce cepas bacterianas que crecieron en glifosato como única
fuente de carbono. De estas bacterias por turbidimetría se escogieron: Pseudomonas aeruginosa, P.
fluorescens, Burkolderia gladioli y Flavimonas oryzihabitans. Los resultados obtenidos por
cromatografía y espectrofotometría mostraron que P. fluorescens y los consorcios bacterianos, P.
fluorescens + P. aeruginosa y B. gladioli + P. fluorescens + F. oryzihabitans, presentaron los
mayores porcentajes de degradación (P=0,004) con diferencias en los porcentajes de tolerancia al
herbicida. Las mezclas bacterianas crecieron en medios de cultivo que contenían entre 20-30 % del
herbicida, mientras que P. fluorescens tolero hasta un 2 %. Ninguna de las bacterias escogidas
presentó adherencia a la superficie del poliestireno en la prueba de hidrofobicidad, mostrando su
preferencia por compuestos hidrofílicos, como el glifosato.
Palabras clave: Descomposición biótica; Glifosato; Consorcio microbiano; Hidrofobicidad celular;
Resistencia bacteriana a herbicidas.
TOLERANCE AND DEGRADATION TO GLYPHOSATE BY BACTERIA ISOLATED FROM

SOILS WITH ROUNDUP SL® FREQUENT APLICATIONS
ABSTRACT
The glyphosate degradation, bacterial resistance to different concentrations of this compound and
affinity for hydrophilic or hydrophobic substances by bacteria isolated from soil which is commonly
used herbicide Roundup SL®, were evaluated in this research. The soil samples were isolated
fourteen bacterial strains grown in glyphosate as the sole carbon source. From these bacteria,
Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, Burkholderia gladioli and Flavimonas oryzihabitans were
chosen by turbidimetry. The results obtained by chromatography and spectrophotometry showed
that P. fluorescens and bacterial consortia, P. fluorescens + P. aeruginosa and B. gladioli + P.
fluorescens + F. oryzihabitans, had the highest degradation capacity (P = 0.004) with differences in
the herbicide tolerance percentages. The bacterial mixtures grew in culture media containing 20-
30% of herbicide, while P. fluorescens tolerate up to 2%. None of the selected bacteria showed
adherence to polystyrene surface hydrophobicity test, showing a preference for hydrophilic
compounds such as glyphosate.
Key words: Biotic decomposition; Glyphosate; Bacterial consortium; Cell hydrophobicity; Herbicide
bacterial resistance.
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Agradecemos al Departamento de química de la Pontifica Universidad Javeriana (Bogotá-Colombia) por su excelente
asistencia y colaboración para la realización de esta investigación.
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Recibido: 08/05/12 • Aceptado: 24/08/12
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INTRODUCCIÓN
Los herbicidas a base de glifosato como el Round Up® son considerados como compuestos
organofosfanatos (esteres del acido fosfórico), de amplio espectro que actúan en post-emergencia.
Además, en Colombia son usados en el Programa de Erradicación de Cultivos Ilícitos (PECIG)
(Solomon et al., 2005; Mañas et al., 2009; Keshteli et al., 2011)
El mecanismo de acción de estos herbicidas se basa en la inhibición de la enzima 5-
enolpiruvilshikimato 3-fosfato sintetasa, responsable de la biosíntesis del corismato, un
intermediario en la vía del acido shikímico que guía a la síntesis de aminoácidos aromáticos
(Schönbrunn et al., 2001; Haney et al., 2002; Funke et al., 2006; Wiersema et al., 2011)
En el suelo, el glifosato es fuertemente adsorbido por los minerales de arcillas y materia
orgánica, compitiendo con el fósforo por sus sitios de unión. Este compuesto es degradado por
microorganismos edáficos en dependencia del tipo de suelo, concentración de nutrientes, pH,
temperatura y humedad (Haney et al., 2002; Rodríguez, 2005; Sørensen et al., 2006; Cuervo, 2007;
Santos et al., 2009; Keshteli et al., 2011)
Los microorganismos, principalmente las bacterias, son capaces de catabolizar compuestos
organofosfonados, los cuales utilizan como fuente de carbono, nitrógeno y fósforo (Cuervo, 2007;
Bazot y Lebeau, 2008; Krzysko-Lupicka y Sudol, 2008) Las bacterias degradan el glifosato por dos
vías, produciendo como intermediarios glicina o acido aminometilfosfónico (AMPA) (Obojska et al.,
2002; Zelenkova y Vinokurova, 2008; Zablotowicz et al., 2009; Wiersema et al., 2011)
En Colombia, aproximadamente el 10 % del glifosato vendido se emplea en el PECIG y el
resto en cultivos agrícolas (Solomon et al., 2005) Algunos investigadores de la Universidad Nacional
de Colombia afirman que mientras se cuestionan las fumigaciones aéreas de la Policía
Antinarcóticos con este herbicida; en cultivos agrícolas como el arroz, se puede estar presentando
una problemática más grande, pues se utilizan aplicaciones seguidas de este herbicida que no
permiten que se degrade en su totalidad la aplicación anterior (Cuervo, 2007; Melgarejo, 2008).
Cuervo (2007) encontró en suelos arroceros del departamento colombiano de Tolima, una
mineralización del 23 % del glifosato a los 106 días de experimentación. De acuerdo con este
investigador si en un año se hacen dos ciclos de cultivo de arroz y en cada ciclo se realizan dos
aplicaciones de glifosato (3,2 L ha-1), no se ha degradado totalmente el glifosato de una aplicación,
cuando ya se está agregando otra. En suelos dedicados al cultivo de sorgo en esta misma zona del
país, a los 120 días de experimentación se observo una tasa de mineralización del glifosato de 7%
(Melgarejo, 2008)
Al igual que en arroz, la presencia de malezas en praderas ganaderas reducen su
productividad, siendo herbicidas como el glifosato una alternativa conveniente por costo y eficacia.
Por la anterior esta investigación examino la capacidad degradadora in vitro del Roundup SL (cuyo
ingrediente activo es glifosato en sal de isopropilamina) en suelos destinados a ganadería semi-
intensiva y actividad agrícola en el municipio de Facatativa (Cundinamarca-Colombia)
MATERIALES Y MÉTODOS
Zona de muestreo
El estudio fue realizado al norte del Municipio de Facatativa (Cundinamarca, Colombia), en

la zona San Rafael bajo, en la finca Pensilvania con una extensión de ocho hectáreas (Figura 1) La
zona tiene una altitud de 2.900 m.s.n.m, con un clima frío húmedo y un relieve plano a
fuertemente inclinado, con pendientes de 25%. Presenta una distribución irregular de suelos,
destinados actualmente a ganadería semi- intensiva, cultivos de papa, avena y arveja.
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Figura 1. Ubicación de la zona de muestreo dentro del municipio de Facatativa y de este con
relación al departamento colombiano de Cundinamarca.
Toma de muestras
Se estableció una unidad de muestreo relativamente uniforme en cuanto a suelos (tipo y

uso) y topografía, a partir de un punto al azar, se siguió un recorrido en zig-zag, recolectando cinco
submuestras cada 200 m2 (Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC),
1994), para un total de 30 muestras compuestas. Las muestras fueron tomadas de 5 a 10 cm de
profundidad (Horizonte A), en bolsas de polietileno debidamente marcados para su posterior
procesamiento en el laboratorio.
Cultivo, aislamiento e identificación
Medios de cultivo. Para el pre-enriquecimiento se utilizaron tres medios líquidos con

glifosato al 1 %, como única fuente de carbono, llamados G1, G2 y G3. Los tres medios variaron en
su fuente de nitrógeno, nitrato de amonio, cloruro de amonio o extracto de levadura fueron
adicionados a los medios G1, G2 y G3 respectivamente. Los otros componentes de los tres medios
fueron cloruro de sodio, sulfato de magnesio y fosfato de potasio. Adicionalmente el medio G3
contenía biotina y piridoxina.
Métodos de Cultivo y aislamiento. Las muestras de suelo fueron llevadas a pre-
enriquecimiento en 45 mL de los medios líquidos G1, G2 y G3 y se incubaron por un periodo de 10
días a una temperatura de 17 º C. Luego se realizaron repiques a los medios sólidos
correspondientes para aislamiento de los microorganismos. De acuerdo con sus características
macroscópicas y microscópicas se sembraron en agar nutritivo, Mc Conkey, King B®, realizando
nuevamente coloración de Gram para asegurar la pureza de los aislamientos.
Identificación. Se utilizaron pruebas bioquímicas convencionales para bacterias Gram-
negativas fermentadoras y no fermentadoras (Brenner et al., 2005) Los resultados se confirmaron
mediante el sistema comercial de identificación microbiana BD BBL Crystal Enteric/Nonfermenter ID
(Becton Dickinson)
Métodos analíticos
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Prueba turbidimétrica y curva de crecimiento bacteriano. Las cepas puras fueron

sembradas en medio liquido G3 a partir de agar nutritivo. El desarrollo bacteriano fue medido por
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espectrofotómetro (Bausch & Lomb spectronic 2000) a 660 nm (Moneke et al., 2010) escogiendo las
cuatro mejores bacterias en cuanto a crecimiento. A las cepas escogidas se les realizo curvas de
crecimiento cada 24 h hasta 264 h.
Antagonismo. Esta prueba se realizó con el fin de evaluar si las cepas escogidas
presentaban o no inhibición de crecimiento, lo que determinó las diferentes mezclas para la
evaluación cromatográfica. La técnica utilizada fue la prueba de anillos de vidrio con un diámetro
de 0.5 cm y 0.7 cm de alto (Martínez et al., 2003)
Toxicidad. A partir de una concentración inicial de glifosato 48 % m/v (según instrucciones
del Roundup SL producido por Monsanto) se realizaron las siguientes concentraciones: 0,25, 0,48, 2,
10, 15, 20, 30 y 40 %. Las bacterias puras y en consorcios, según los resultados obtenidos por la
prueba de antagonismo, fueron inoculadas en estas concentraciones por un tiempo de 72 horas,
realizando recuentos en placa sobre agar nutritivo.
Medida de hidrofobicidad. Esta prueba determino el grado de afinidad de las bacterias por
compuestos hidrofílicos o hidrofóbicos; mediante el método de adherencia al poliestireno por
tinción con el colorante violeta de genciana (Carrillo et al., 1998)
Cromatografía. La biodegradación (descomposición biótica) del glifosato por las bacterias
escogidas y sus mezclas se analizaron por cromatografía de papel (Nakashita et al., 1992) con
dimensiones de 22 cm de largo x 3 cm de ancho y como solvente se utilizo agua/metanol 2:3 v/v.
Para ubicar el Rf (distancia recorrida por el compuesto/distancia recorrida por el disolvente) del
glifosato se utilizó como revelador la ninhidrina. Para el resto de las cromatografías se utilizó este
Rf, el cual sirvió para ubicar y cortar las manchas de las cromatografías realizadas a las bacterias;
las cuales fueron diluidas en 2 mL de agua por 1 hora y llevadas al espectrofotómetro (Bausch &
Lomb), en donde el mejor punto de absorción fue 270 nm.
Análisis estadístico
La evaluación de la biodegradación de glifosato por las bacterias escogidas y sus mezclas se

llevo a cabo mediante un diseño completamente al azar con seis tratamientos, tres repeticiones y
tres unidades experimentales por repetición para un total de 42 unidades experimentales. Esto
quiere decir que por cada bacteria y sus mezclas (Tratamientos) se realizaron nueve cromatografías.
Los promedios de los datos obtenidos se trataron estadísticamente mediante un análisis de varianza
(ANOVA) de una sola vía (P= 0,05) y con la prueba de Rango Múltiple de Duncan, para determinar las
diferencias significativas encontradas entre tratamientos.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Cultivo, aislamiento e identificación
Se aislaron cinco géneros bacterianos que utilizaron el glifosato como única fuente de
carbono, predominando Pseudomonas spp. con un 42, 9 %. Las especies aisladas de este género
fueron cercanas a P. cichorii, P. aeruginosa, P. fluorescens, P. stutzeri y P. vesicularis. También se
aislaron cepas cercanas a Burkholderia cepacia, B. gladioli, Alcaligenes sp., Flavimonas
oryzihabitans y Pantoea aglomerans.
Estos resultados concuerdan con varios estudios reportados a nivel mundial, los cuales han
encontrado degradación del glifosato y de otros compuestos organofosfonatos por diferentes
microorganismos del suelo, principalmente por varias especies del género Pseudomonas spp. (White
y Metcalf, 2004; Funke et al., 2006; Bazot y Lebeau, 2008; Moneke et al., 2010)
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Es importante resaltar que los anteriores estudios aislaron estas bacterias edáficas en
medios de cultivo donde el glifosato se uso como única fuente de fosforo y es así que para
Shushkova et al. (2009) y Moneke et al. (2010), la regla general es que los microorganismos del
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suelo lo utilicen como fuente de fosforo, debido a que estos investigadores comprobaron que el
glifosato es mejor fuente de fosforo que de carbono. Sin embargo, al igual que este estudio, en
plantaciones de soya (Glycine max L.) sobre suelos brasileños con historial de uso de herbicidas a
base de glifosato, se aislaron B. gladioli y Flavimonas (Antes Pseudomonas) oryzihabitans en medios
que contenían glifosato como única fuente de carbono (Kuklinsky-Sobral et al., 2005). En Colombia,
en suelos arroceros del departamento de Tolima, se identificaron como degradadores de glifosato al
actinomiceto Streptomyces sp, la bacteria Microccocus luteus y el hongo Memnoniella sp
(Rodríguez, 2005)
Métodos analíticos
Prueba turbidimétrica y curva de crecimiento bacteriano. Por medio

espectrofotométrico, se escogieron las bacterias P. aeruginosa, B. gladioli, P. fluorescens y F.
oryzihabitans que presentaron una mayor absorbancia con respecto al resto de bacterias analizadas
en los medios de cultivo que contenían glifosato como única fuente de carbono, indicando una
mejor utilización del herbicida por estas especies bacterianas (Moneke et al.,2010)
Todas las bacterias escogidas crecieron bien con glifosato como única fuente de carbono. La
fase de adaptación al herbicida fue más larga en F. oryzihabitans y B. gladioli con un promedio de
72 horas; mientras que en P. aeruginosa y P fluorescens, la duración fue de 48 y 12 h
respectivamente (Figura 2) Estos resultados sugieren que estas bacterias posiblemente se adaptaron
y utilizaron más fácilmente al glifosato como única fuente de carbono y concuerda con los
crecimientos celulares presentados por P. putida en un medio de cultivo similar con una fase de
adaptación (lag) de aproximadamente 8 horas y P. fluorescens con una fase lag de
aproximadamente 12 horas con 2,5% de glifosato (Sun et al., 2005; Moneke et al., 2010) En la
naturaleza la eficiencia en la degradación de glifosato está dada por la relación planta-
microorganismo, las especies vegetales y microbianas, el tipo de suelo, dosis aplicada y condiciones
experimentales (Dos Santos et al., 2006; Krzysko-Lupicka y Sudol, 2008; Santos et al., 2009)
Figura 2. Curvas de crecimiento de las bacterias escogidas en medio liquido con glifosato al 1% y
extracto de levadura como fuentes de carbono y nitrógeno (medio G3)
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Estudios realizados con diferentes bacterias como Acetobacter sp., Escherichia sp., P.
fluorescens, Azotobacter sp., Alcaligenes sp. y P. putida han observado que el crecimiento no es
verdaderamente logarítmico cuando se utiliza glifosato como fuente de fósforo o carbono (Sun et
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al., 2005; Moneke et al., 2010), lo cual se asemeja a las curvas de crecimiento presentadas por las
bacterias escogidas en esta investigación.
Antagonismo. Al enfrentar la bacteria P. aeruginosa con B. gladioli se presentó un halo de
inhibición de 0,4 cm y con F. oryzihabitans 0,45 cm. Al mismo tiempo, al enfrentar B. gladioli con
P. aeruginosa se observó la presencia de un halo de 0,3 cm. En el caso de la bacteria F.
oryzihabitans al enfrentarse con P. aeruginosa mostró un halo de inhibición de 0,4 cm. P.
fluorescens no presento antagonismo con ninguna de las bacterias ensayadas. Tomando como
referencia estos resultados se pudieron realizar las siguientes mezclas: F. oryzihabitans + P.
fluorescens + B. gladioli y P. fluorescens + P. aeruginosa. Esta prueba por lo tanto dio lugar a la
formación de dos consorcios para realizar las cromatografías y las pruebas de toxicidad.
Toxicidad. En la prueba de toxicidad todas las bacterias arrojaron patrones diferentes de
resistencia al compuesto con crecimientos en los medios que contenían hasta un 10 % de glifosato
en el caso de P. aeruginosa, 2 % para P. fluorescens y B. gladioli y 0.25 % en el caso de F.
oryzihabitans. Los consorcios mostraron una mejor resistencia con crecimientos hasta 20 o 30 % del
herbicida para B. gladioli + F. oryzihabitans + P. fluorescens y P. fluorescens + P. aeruginosa,
respectivamente. La importancia funcional de las asociaciones en consorcios se demuestra por la
capacidad de resistencia a altas dosis de sustancias químicas, donde los microorganismos que
conforman el consorcio actúan benéficamente entre sí para tolerar diferentes concentraciones de
los compuestos y metabolizarlos (Gao et al., 2006; Romero et al., 2006), lo cual podría ser la
explicación de la resistencia de los dos consorcios bacterianos evaluados en esta investigación. En
algunos suelos con aplicación frecuente de glifosato se observan cambios en la diversidad
microbiana con predominio de algunos grupos funcionales que interactúan entre sí para metabolizar
el herbicida (Krzysko-Lupicka y Sudol, 2008; Lupwayi et al., 2009)
La sensibilidad o tolerancia al glifosato está dada por la expresión de las enzimas Aro A clase
I o II respectivamente; sin embargo, en suelos contaminados con glifosato en China se encontró un
nueva enzima altamente tolerante a este herbicida que no pertenece ni a la clase I o II en
Pseudomonas putida que creció en 200 mM glifosato. Este hallazgo es altamente potencial por su
posible uso para la generación de cultivos transgénicos resistentes al herbicida (Sun et al., 2005).
Con base en esto se deberían seguir investigando algunas de las especies de Pseudomonas aisladas
en este estudio a nivel genético, como promisorias por su alta tolerancia al Roundup SL.
Medida de hidrofobicidad. En la prueba de hidrofobicidad, las bacterias P. aeruginosa, B.
gladioli, P. fluorescens y F. oryzihabitans presentaron una tenue coloración con el compuesto
violeta de genciana en la línea por la cual corrió la bacteria, no existiendo adherencia a la
superficie del polietileno (Figura 3) Esto demuestra que las bacterias estudiadas prefieren
compuestos hidrofílicos (Carrillo et al., 1998) como lo es el glifosato. El potencial de hidrofobicidad
esta correlacionado con la estructura de los microorganismos teniendo influencia sobre mecanismos
de adhesión a diferentes sustancias, aunque la adsorción diferencial no depende tan solo de un
factor, sino es un mecanismo complejo donde actúan otras variables que van a determinar esta
adsorción (Drozd y Schwartzbrod, 1996; Kaczorek et al., 2008)
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2 •
Figura 3. Prueba de adherencia al polietileno de P. fluorescens, utilizando como control positivo

albúmina bovina.
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2 •
Cromatografía. Los procedimientos de cromatografía realizados con el revelador

ninhidrina, dieron un valor Rf de 0,63 para el glifosato (Figura 4)
Figura 4. Mancha obtenida al correr el patrón de glifosato en cromatografía de papel

y revelar con ninhidrina.
A las 264 horas se observan diferencias significativas en los porcentajes de degradación (P=
0,004), siendo los mejores tratamientos de acuerdo a la prueba de Rango Múltiple de Duncan P.
fluorescens (59,2%), P. aeruginosa + P. fluorescens (56,7%) y P. fluorescens + Flavimonas
oryzihabitans + Burkholderia gladioli (51,9%) (Figura 5)
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Figura 5. Porcentajes de degradación de glifosato por P. aeruginosa, B. gladioli, P. fluorescens,

F. oryzihabitans y las mezclas.
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En estudios posteriores de biorremediación de este herbicida a altas concentraciones, sería

aconsejable ensayar los consorcios bacterianos ya que crecieron con concentraciones de glifosato de
20 y 30 %, mientras que P. fluorescens sólo tolero un 2 % del compuesto; demostrando la existencia
de sinergismo entre las bacterias para potenciar su acción degradadora. En biorremediación se
busca que el crecimiento bacteriano se obtenga en menor tiempo y que alcance un porcentaje de
degradación alto (Ron, 2006; Natarajan, 2008; Moneke et al., 2010)
Está bien documentado que bacterias del suelo degradan el glifosato; sin embargo, esta
capacidad se puede ver limitada por la baja permeabilidad de la célula bacteriana al glifosato, pH,
mecanismos de sorción y por la disponiblidad de fosforo inorgánico (Obojska et al., 2002; Sørensen
et al., 2006; Cuervo, 2007; Forlani et al., 2008; Zablotowicz et al., 2009; Wiersema et al., 2011) Un
ejemplo de la capacidad degradadora de los microorganismos del suelo fue la encontrada por
Shushkova et al. (2009), utilizando la bacteria Ochrobactum anthropi GPK3, la cual redujo la
concentración de glifosato en un 25,4%, en un suelo con un contenido del 1 % de carbono orgánico y
39 % de arcilla. En el 2010 se adiciono esta bacteria junto con Achromobacter sp. Kg 16 a un suelo
contaminado con glifosato a una concentración 10 veces mayor que la dosis recomendada para
erradicación de malezas, observando entre 1 a 2 semanas después de la introducción de las
bacterias una disminución del contenido de glifosato y de la toxicidad del suelo a valores de suelo
no contaminado (Ermakova et al., 2010) Esta propiedad también fue comprobada en ésta
investigación donde bacterias nativas aisladas de suelos dedicados a actividades agropecuarias en
Cundinamarca y mezclas entre ellas mostraron diferentes porcentajes de degradación del herbicida
evidenciando la utilización de glifosato como fuente de carbono durante el tiempo evaluado.
CONCLUSION
El papel de las bacterias edáficas en la degradación, tolerancia y afinidad al glifosato en

suelos con uso frecuente del herbicidad Roundup ® SL se comprobó en esta investigación donde los
microorganismos utilizaron el glifosato como única fuente de carbono y actuaron sinérgicamente
para resistir hasta un 30 % del herbicida resultando promisorio su uso en programas de
bioremediación.
http://www.revistapilquen.com.ar/Agronomia/Agro12/12_Martinez%20y%20otros_Tolerancia
.pdf
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