MATERIALES Y MÉTODOS

T. pseudokoningii (FCBP 0213) Se obtuvieron del cultivo de

T. harzianum (FCBP 1277) Banco de hongos de Pakistán.
T. reesei (FCBP 0271)

 Los hongos se subcultivaron en medio de agar con extracto de malta al 2% (MEA) para mantener
sus cultivos puros.
 El MEA esterilizado en autoclave se vertió en placas de Petri de 9 cm y se dejó solidificar.
 Tapones (5 mm) del hongo patógeno y tres especies de Trichoderma se colocaron en placas de
Petri de 9 cm a una distancia de 2 cm.
 Las placas de Petri se incubaron a 27 °C durante 5 días.
 Un tratamiento de monocultivo del patógeno fue incluido como control. Se hicieron cuatro
réplicas de cada tratamiento.
 Crecimiento radial del patógeno se registró en placas de cultivo mono y doble utilizando una
escala después de 5 días de incubación.
 El diámetro de la colonia fúngica en cada placa de Petri se midió en tres puntos y se promedió.
 El Porcentaje de inhibición en el crecimiento del hongo patógeno por Trichoderma spp. fue
calculado de acuerdo a la fórmula dada por Rini y Sulochana.
Experimento maceta:

 Se llevó a cabo una prueba en maceta para el control biológico de la podredumbre basal de la
cebolla mediante la modificación el suelo con T. harzianum y hojas secas de W. somnifera
siguiendo el procedimiento de Javaid y Rauf con algunas modificaciones.
 Para la preparación de inóculos de F. oxysporum f. sp. cepae y T. harzianum,
 las semillas de garbanzo se hierven y son tratadas en autoclave y fueron inoculadas con cultivo de
discos miceliales de estos hongos, seguido de incubación a 28 °C durante 10 días.
 El experimento se realizó en macetas de plástico que contenían cada una 450 g de suelo franco
arenoso. Todas las macetas a excepción del tratamiento negativo se inocularon con F. oxysporum
f. sp. cepae a fondo mezclar 10 g de inóculo basado en garbanzo en cada maceta.
 Después del riego con agua del grifo, las macetas se dejaron en condiciones ambientales naturales
durante una semana.
 A partir de entonces, hojas secas y trituradas de W. somnifera se mezclaron en el suelo al 1%, 2%
y 3% con o sin él inóculo de T. harzianum.
 La incidencia de la enfermedad se calculó después de 60 días de siembra calculando el porcentaje
de enfermos plantas de la cantidad total de plantas sembradas en las macetas.

Bioensayos de laboratorio

 Las hojas de W. somnifera secadas y completamente trituradas se extrajeron con metanol durante
14 días.
 Los materiales se filtraron y el disolvente se evaporó en un evaporador rotatorio. El restante el
material se mezcló en 200 ml de agua y se extrajo con n-hexano, cloroformo, acetato de etilo y n-
 butanol usando un embudo de separación. Después de la evaporación de solventes, 9.1 g, 24.3 g,
1.9 g y 6.2 g de n-hexano, se obtuvieron fracciones de cloroformo, acetato de etilo y n-butanol.
 Se disolvió una cantidad de 1,2 g de cada fracción de extracto metanólico en 1 ml de DMSO
(Dimetil Sulfóxido) y Se le añadieron 5 ml de caldo de extracto de malta.
 Esta solución madre (concentración de 200 mg mL-1) fue diluido doblemente en serie añadiendo
caldo de extracto de malta para preparar 100, 50, 25, 12.5, 6.25 y 3.125 mg mL-1 concentraciones.
 Se preparó una serie de tratamientos de control disolviendo 1 ml de DMSO en 5 ml de caldo de
extracto de malta seguido de doble dilución en serie.
 Se realizaron bioensayos en tubos de ensayo de vidrio (10 mL) que contienen cada uno 1 mL del
medio de crecimiento.
 Para la preparación de F. oxysporum f. sp. inóculo de cepae, colonia fúngica madura se suspendió
en agua destilada esterilizada agua y pasa a través de la tela de queso, de los cuales 15 L se
agregaron a cada tubo de ensayo.
 El experimento se realizó por triplicado utilizando un diseño completamente aleatorizado.
Después de 7 días de incubación a temperatura ambiente, la biomasa fúngica en cada tubo de
ensayo se filtró, secó y pesó.

Análisis estadístico

 Los datos de los bioensayos de laboratorio y el ensayo en maceta se analizaron mediante ANOVA
(Análisis de la varianza).Los tratamientos los medios se separaron mediante las pruebas de rango
múltiple de Duncan a P≤0.05.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Todas las tres especies de Trichoderma (T. harzianum, T. pseudokoningii y T. reesei) probadas in
vitro redujeron notablemente el crecimiento de F. oxysporum f. sp. Cepae.
Entre las tres especies de Trichoderma, el efecto inhibidor máximo (60%) sobre el crecimiento del
patógeno fúngico se debió a T. harzianum.
T. pseudokoningii fue el segundo mejor hongo antagonista que da como resultado una inhibición
del 56% en el crecimiento del patógeno fúngico.
La inhibición del 39% en el crecimiento del patógeno se debió a T. reesei
Factores importantes responsables para la actividad antagonista son la producción de metabolitos
antimicrobianos, tasas metabólicas más rápidas y conformación fisiológica por especies de
Trichoderma. Varios mecanismos involucrados en el antagonismo De Trichoderma con hongos
patógenos también incluyen competencia espacial y nutricional, micoparasitismo y antibiosis por
enzimas y metabolitos secundarios.
Prueba en maceta:
No se encontraron síntomas de enfermedad en las plantas de cebolla en el control negativo
En el control positivo donde se aplicó el inóculo del patógeno fúngico sin ninguna modificación del
suelo, bulbos de cebolla mostraron un 87% de incidencia de enfermedad.
La incidencia de la enfermedad disminuyó significativamente mediante la aplicación de material de
hoja de W. somnifera y hubo una incidencia de enfermedad del 41-66% en 1% para 3% de
aplicación de tratamientos de material foliar.
En los tratamientos donde el material de la hoja era usado en combinación con T. harzianum, el
efecto fue más pronunciado en comparación con el control positivo, así como los tratamientos en
los que T. harzianum no se utilizó. Incidencia de la enfermedad en estos tratamientos fue 20-53%.
La incidencia más baja de la enfermedad (20%) se registró en tratamiento donde se utilizó un 3% de
material de hoja seca en combinación con T. harzianum.