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Electroforesis PDF
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Historia
El término electroforesis se refiere a una técnica separativa que emplea un campo eléctrico
aplicado que actúa sobre partículas cargadas causando su movimiento a través de una matriz.
El primer aparato sofisticado de electroforesis fue desarrollado por Tiselius en 1937. Su trabajo
le valió el premio Nóbel en 1948. Fue Tiselius quien desarrolló el concepto de frente móvil
(moving boundary), que más tarde se conoció como electroforesis de zona y se usó para
separar proteínas en solución (1).
Entre 1940 y 1960 sobrevino un desarrollo de la electroforesis, aplicándose a diversas
moléculas, desde proteínas grandes hasta aminoácidos e iones inorgánicos. A la electroforesis
de zona se sumaron además el isoelectroenfoque y la isotacoforesis, basadas en diferentes
propiedades físicas. Esto permitió realizar análisis separados en una misma muestra o bien
realizar combinaciones de métodos.
La distinción entre los tres métodos también se da a nivel de las matrices empleadas en cada
una, que brindan ventajas comparativas dependiendo de la técnica y de la muestra a separar.
Así, se han usado geles de polímeros, papel y capilares. El papel es fácil de usar dado que no
es necesaria una preparación previa, pero con el tiempo se ha privilegiado el uso de matrices
tipo gel. Smithies en 1955 introdujo el uso de geles de almidón (2), y dos años más tarde Kohn
usó acetato de celulosa (3). En 1959 Ornstein y Davis (4) y Raymond y Weintraub (5) usan un
gel de poliacrilamida. Los capilares fueron introducidos por Jorgenson y Lukacs (6,7) a
principios de los 80.
Las técnicas de detección han evolucionado con los años también. Algunas de estas técnicas
incluyen el teñido químico, técnicas inmunoelectroforéticas, análisis bidimensional y varias
técnicas de inmovilización en membranas.
Hoy la electroforesis se aplica principalmente al análisis de muestras biológicas. Es
ampliamente usada en análisis de DNA para química forense y en la investigación biológica.
1. Tiselius, A., A new apparatus for electrophoretic analysis of colloidal mixtures, Trans.
Faraday. Soc., 33, 524, 1937.
2. Smithies, O., Zone electrophoresis in starch gels: group variations in the serum proteins of
normal human adults, Biochem. J., 61, 629, 1955.
3. Kohn, J., A cellulose acetate supporting medium for zone electrophoresis, Clin. Chim. Acta,
2, 297, 1957.
4. Ornstein, L. and Davis, B. J., Disc Electrophoresis, Distillation Products Industries (Division of
Eastman Kodak Co.), 1959.
5. Raymond, S. and Weintraub, L., Acrylamide gel as a supporting medium for zone
electrophoresis, Science, 130, 711, 1959.
6. Jorgenson, J. W. and Lukacs, K. D. Anal. Chem., 53, 1928, 1981.
7. Jorgenson, J. W. and Lukacs, K. D., Science, 222, 266, 1983.
Principio general
La electroforesis separa partículas en base al movimiento inducido por un campo eléctrico. El
campo eléctrico resulta en la aplicación de una fuerza sobre las partículas que es proporcional
a su carga o potencial de superficie. La fuerza resultante induce una velocidad diferente en las
distintas macromoléculas. En otras palabras, si se aplica un campo eléctrico durante un
período de tiempo dado a través de una matriz que contiene una mezcla de macromoléculas
con diferentes potenciales de superficie, las moléculas estarán en diferentes lugares al detener
el campo.
El estudio del movimiento electroforético se enfoca en el potencial eléctrico en la superficie de
la macromolécula, y la relación de ese potencial con la velocidad del objeto en el campo
eléctrico. El potencial de superficie está causado por la interacción de la superficie de la
molécula con el medio que la rodea. Una separación de carga entre una capa delgada en la
superfice de la partícula y otra capa delgada en el medio alrededor de ella resulta de una
interfase entre las dos superficies. Esta separación de carga resulta a su vez en una cierta
Bioquímica - Electroforesis 2
densidad de carga en cada capa y en consecuencia en un potencial eléctrico entre capas. El
campo eléctrico aplicado a la matriz actúa sobre esta densidad de carga. Así, las moléculas de
la muestra y del solvente se moverán en direcciones opuestas debido a las cargas diferentes.
Las macromoléculas pueden separarse también en base a la carga. Esto es posible debido a
que cuanto más grande sea una molécula mayor será su superficie y también el potencial de
superficie (1,2,3).
Ambas capas delgadas, la de la macromolécula y la del solvente, son denominadas en
conjunto doble capa eléctrica. Usando esta terminología, al aplicar el campo eléctrico las
porciones negativa y positiva de la doble capa de separan.
Para poder modelar matemáticamente el fenómeno electroforético, es necesario tratar esta
doble capa eléctrica como un capacitor. Así, la ecuación para la diferencia de potencial a través
de dos placas o capas puede ser expresada como:
ζ = 4πed / D (1)
La diferencia de potencial entre dos capas es conocida como potencial zeta, de allí el símbolo.
d es la distancia entre las placas en cm, e es la carga por cm2, D es la constante dieléctrica del
medio entre los platos. La ecuación para la velocidad de una partícula en un campo eléctrico
toma en cuenta el balance entre las fuerzas aplicadas a una partícula por un campo eléctrico y
la fuerza de fricción que se opone al movimiento:
V=μE (2)
En esta ecuación V es la velocidad, E es igual al campo eléctrico en volts/cm, y μ se representa
por la ecuación (3).
1. Jacqueline Kroschwitz, ed., Encyclopedia of Chemical Technology, 4th ed., John Wiley &
Sons, 1994, p. 356.
2. Alan Townshend, ed., Encyclopedia of Analytical Science, vol. 2, Harcourt Brace and
Company, 1995, p. 1041.
3. Jorgenson, J. W. Analytical Chem, 1986, 58, 7, 743A.
Electroforesis de zona
Isoelectroenfoque
Bioquímica - Electroforesis 4
El isoelectroenfoque separa componentes usando un gradiente de pH. El gradiente va desde
un pH bajo en el ánodo hasta un pH alto en el cátodo. Cuando se aplica un campo eléctrico la
muestra migra según su carga hasta que encuentra un pH igual a su punto isoeléctrico, donde
la carga neta es 0 y en consecuencia se detiene. Cuando todos los componentes se detienen
se llega a un estado estacionario. Se usan geles como soporte, lo que minimiza la difusión una
vez que se llega al estado estacionario y el campo eléctrico es eliminado. La clave del método
es lograr un buen gradiente de pH. Se utilizan anfolitos cuyos pI rodean el rango de pH
deseado, p. ej. de 5 a 7. Se utilizan moléculas anfotéricas sintéticas en mezclas complejas.
Estas moléculas migran al aplicarse un campo eléctrico hasta su pI, creando un gradiente de
pH. Los anfolitos pueden ser inmovilizados en el gel dando aún mayor resolución al método. el
aparato es el mismo que se describiera para electroforesis de zona. el poder resolutivo del
método es muy elevado, permitiendo la separación de sustancias que difieran en su pI en
0,001 unidades de pH. Es un método que lleva bastante tiempo, dado que cuanto más se
acercan los componentes a su pI más lentamente migran (poseen menos carga). La aplicación
de voltajes elevados durante largo tiempo requiere refrigeración
Referencias
Alan Townshend, ed., Encyclopedia of Analytical Science, vol. 2, Harcourt Brace and Company,
1995, p. 1041.
Jacqueline Kroschwitz, ed., Encyclopedia of Chemical Technology, 4th ed., John Wiley & Sons,
1994, p. 356.
Jorgenson, J. W. Analytical Chem, 1986, 58, 7, 743A.
Bioquímica - Electroforesis 5
Soportes
Agarosa
Los geles de agarosa diluidos son bastante rígidos y fáciles de manejar. Su tamaño de malla
alto hacen que se empleen para separar macromoléculas grandes como proteínas o DNA. Los
geles de poliacrilamida sirven para separar ac. nucleicos de 25 a 2000 bp mientras que los
geles de agarosa pueden separar fragmentos hasta 10 veces más grandes. Así, se pueden
separar DNAs de tamaño desde 1 Kbp a 20 kbp.
enfriado
Generalmente se usa agarosa al 0.5% a 2% (p/v). La agarosa es muy fácil de trabajar porque
no necesita de un entrecruzante u otros agregados para formar la matriz y es barata. La
electroforesis en agarosa se puede combinar con la transferencia de Southern, PCR, y
fluorescencia.
La introducción de estándares de peso molecular en calles adjuntas a la muestra permite la
estimación del tamaño de los ácidos nucleicos separados.
Bioquímica - Electroforesis 6
ADN pequeño
Polo positivo
(cátodo)
-
Bioquímica - Electroforesis 7
Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE)
Estos geles separan la mayoría de proteínas y oligonucleótidos de peso menor a aprox. 200
kDa. Están formados por monómeros de acrilamida (CH2=CHCONH2) polimerizados en largas
cadenas por un reactivo entrecruzante (crosslinker) que mantiene la estructura estable. El más
común es la N,N'-metilenbisacrilamida[(CH2CHCONH)2CH2]. Otros reactivos útiles a este fin
son el etilendiacrilato y N,N'-dialiltartardiamida (DATD).
El entrecruzamiento del monómero de acrilamida con el comonómero es lo que determina el
tamaño de poro de la matriz, a través del ajuste del porcentaje de éste en el gel. La
composición del gel puede ser expresada de dos maneras: %T y %T,%C. %T es el porcentaje
en peso de monómero total, acrilamida más el entrecruzante. Un gel al 15% tendrá 15% p/v de
acrilamida más bisacrilamida. Cuanto mayor el porcentaje, menor el tamaño de poro. %T,%C
es una manera de expresar en porcentaje de entrecruzante en relación con el %T. 15%T,
5%Cbis significa que hay un 15% p/v acrilamida más bisacrilamida, y que la bisacrilamida es el
5% del peso total de acrilamida presente. Hay entonces dos maneras de controlar el tamaño de
poro, variando %T o %C. Para cualquier %T, un 5% de entrecruzamiento da el menor tamaño
de poro.
A diferencia de la agarosa, los geles de poliacrilamida requieren aditivos para ayudar a
polimerizar el gel. El persulfato de amonio es un iniciador, y el tetrametilendiamina (TEMED) es
el catalizador de la reacción. El TEMED causa que el persulfato de amonio produzca radicales
libres que a su vez causan la polimerización. La mezcla debería ser desgaseada dado que el
O2 interfiere con la reacción.
Cuanto mayor sea el tamaño de poro, menor resistencia al avance encontrarán las moléculas,
para un mismo tamaño de poro, entonces, migrarán más rápido aquellas moléculas más
pequeñas y/o las más cargadas. es decir, la velocidad de movimiento depende de la relación
carga/masa (q/m). El tipo de gel descripto en las figuras anteriores corresponde al tipo
discontinuo, en el que existen dos tipos de geles, el de concentración y el de separación. El gel
Bioquímica - Electroforesis 8
de concentración es un gel de malla
abierta, que tiene como finalidad
concentrar la muestra en una banda
angosta antes de que entre en el gel
de separación. Así, el ancho de cada
banda se mantiene en un mínimo y se
optimiza la separación.
Los geles de poliacrilamida pueden
realizarse en condiciones tales que se
conserve la estructura nativa de las
proteínas, denominados geles “nativos”
o no desnaturalizantes; o en
condiciones desnaturalizantes. en cuyo caso se conoce
como geles con SDS o SDS-PAGE, en alusión al detergente
usado como agente desnaturalizante, el dodecil sulfato de
sodio. Las diferencias son importantes. En un gel no
desnaturalizante se puede observar a una proteína migrando
con su forma nativa y es importante cuando luego se van a
hacer ensayos de actividad en el mismo gel o luego de eluir
a la proteína que se ha purificado del gel. En ocasiones este
método puede ser
usado con fines preparativos cuando no existen otros
recursos para purificar la proteína. también se puede
estimar la masa nativa de la proteína, pero es un proceso
largo y trabajoso que bien puede ser sustituido por
técnicas cromatográficas. Por otra parte, no puede
usarse a menos que todos las proteínas posean una
relación q/m más o menos parecida. En caso de ser
necesario usar PAGE, se debe correr la muestra junto a
patrones de masa conocida como referencia y esto debe
20
180 A B
18
Ferritina (pend = -18.6)
160 16
14
140
12
Log Rf
-Pendiente
Ovotransferrina (pend = -7.2) 10
120
8
100
6
80 4
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 0 100 200 300 400 500 600
Origen
PM estándar Rf
116 0.34
110
97.4 0.38 89
100
90
80
116 66 0.46 68 70
97,4 60
66 48.5 0.56 50
48,5 29 0.69 40
30
29
Bandas 20
desconocidas
a 0.40 10
0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8
Frente b 0.47
Electroforesis en papel
El papel fue uno de los primeros soportes usados en electroforesis. En contraste con los geles,
el papel (p. ej. Whatman 3MM (0.3mm) y Whatman No. 1 (0.17 mm) no requiere preparación. El
papel tampoco tiene cargas que interfieran con la separación de las muestras. La muestra se
aplica directamente al papel. En cada extremo hay una solución buffer a la que se aplica el
campo eléctrico. Se pueden aplicar además moléculas patrón y pigmentos marcadores para
controlar la migración de las muestras. Los mejores resultados se obtienen cuando la dirección
de movimiento de las muestras es paralela al eje de las fibras del papel. El voltaje aplicado es
mayor que en el caso de los geles de acrilamida dado que la resistencia del papel es mayor.
una desventaja es que el tamaño de poro no puede ser fácilmente controlado como en el caso
de los geles, y la técnica es poco sensible y difícil de reproducir.
Bioquímica - Electroforesis 10
Electroforesis capilar
Se emplean tubos capilares de vidrio rellenos con buffer o gel. Los capilares son un medio
apropiado ya que poseen una gran relación de superficie a volumen que permite el uso de
elevados voltajes sin tanto calentamiento como en el caso de las matrices de gel. Sin embargo,
debido al tamaño de los geles existen problemas con la cantidad de muestra a aplicar y los
límites de detección.
En un capilar de 1 mm de diámetro interno, la capacidad es de 0.03 ml/cm de largo de capilar,
y se carga aproximadamente entre 1/100 a 1/1000 de volumen de muestra. Se han diseñado
detectores en línea que detectan cantidades muy pequeñas a medida que la muestra va
corriendo en el gel. Estos detectores emplean conductividad, efectos de Doppler basados en
láser, o lásers que detectan absorbancia o fluorescencia.
La completa eliminación de la muestra luego de la corrida es un problema en esta
electroforesis. Algunos capilares están recubiertos en su superficie interna y otros están llenos
de gel. Debido a su costo, no son descartables y en consecuencia toda la muestra debe ser
eliminada del capilar luego de la corrida. Esto puede ser un problema severo en capilares que
a veces miden hasta 100 cm de longitud y en los que a veces la muestra puede resultar
adsorbida en la superficie interna. El recubrimiento de las superficie con películas especiales
ayuda a resolver este problema al aumentar la velocidad de electroosmosis a lo largo de las
paredes con lo que el tubo se limpia más fácilmente.
La electroforesis capilar se
está volviendo una técnica
ampliamente usada. Las
separaciones son rápidas,
se realizan a alto voltaje y
requieren una
automatización mínima.
Esta matriz es ventajosa
además porque evita los
efectos de calentamiento
que pueden ocurrir en geles
y porque los datos están en
forma de un registro, un
perfil en papel en vez de en
un gel teñido. En la figura adjunta se muestra esquemáticamente el diseño básico de la
electroforesis capilar. La muestra se aplica en un extremo del tubo y la aplicación de voltaje
causa la migración de las moléculas, que al ir pasando por un detector envían una señal que se
registra en un trazo luego de ser procesada.
Transferencia (Blotting)
En las transferencias, las proteínas o ác. nucleicos son transferidos a una membrana. La
transferencia puede ser realizada mediante la aplicación de un campo eléctrico o por difusión
con un buffer.
Estructura básica de una transferencia de Western
Western blotting. En el caso
de proteínas, se usan
membranas de nitrocelulosa
(NC) o poliviniliden
difluoruro (PVDF). La
transferencia se hace
poniendo en contacto el gel
con la membrana y
estableciendo luego un
campo eléctrico que haga
migrar la proteína hacia la
membrana. Las proteínas Soporte plástico
quedan así expuestas en la
superficie de la membrana, Panel de
a la que se adsorben muy fibr a Papel
de filtr o
fuertemente. De esta Papel Soporte plástico
manera se puede hacer uso Membr ana de de filtr o
de moléculas grandes para nitr ocelulosa Panel de
revelar su presencia, como Gel fibr a o esponja
rígida
anticuerpos. La membrana
Armado del sandwich de transferencia
se incuba con los anticuerpos y la
presencia de estos en lugares
específicos de la membrana se revela
por diversas técnicas. Por ejemplo, se nitrocelulosa
-P Pi
-P -P
Molécula conjugada
Anticuerpo 2rio
Anticuerpo 1rio
Membrana
Proteína
Western blotting
Membrana
transferida Autoradiografía
Membrana
Gel
Papel de filtro
Hibridización
Solución alcalina
PAGE
Sonda
marcada
DNA
transferido
Membrana
Enzima o
fluoróforo
Sonda
marcada
DNA
Hibridización
transferido
Membrana
Sustrato Producto
SEÑAL
Luz Fluorescencia
Sonda
marcada
DNA Revelado
transferido
Membrana