Año del Diálogo y Reconciliación Nacional

UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA

FACULTAD DE AGRONOMIA
DPTO DE AGRONOMIA Y FITOTECNIA

CURSO: Biotecnología Vegetal

TEMA: Cultivo in vitro de plantas y su relación con

la Biotecnología

DOCENTE: Ing. Cesar Puicon Añazco

ALUMNO: Gil Valdiviezo Miguel Absalom

 Cultivo in vitro de plantas y su relación con la
Biotecnología

Introducción
El cultivo in vitro (término que literalmente significa en vidrio), incluye muchas
técnicas destinadas a introducir, multiplicar y regenerar, entre otros recursos,
material vegetal o animal en condiciones controladas y asépticas. El cultivo in
vitro, constituye un paso fundamental en la obtención y regeneración de plantas
genéticamente modificadas, o transgénicas, mediante técnicas de ingeniería
genética. Es decir que existe una estrecha relación entre el cultivo de tejidos
vegetales y la biotecnología moderna. Normalmente se utilizan cultivos de
tejidos, seguido de la regeneración de la planta completa, y la subsiguiente
expresión de los genes introducidos, o transgenes
Marco Teórico:
La expresión cultivo in vitro de plantas, significa cultivar plantas dentro de un
frasco de vidrio en un ambiente artificial .Cultivo in Vitro de material vegetal
“Cultivo de tejidos vegetales” es una descripción genérica que involucra
diferentes técnicas de cultivo de material vegetal diverso, incluyendo las de
protoplastos (células desprovistas de su pared celular), células, tejidos,
órganos y plantas completas. Mediante éstas y otras técnicas de cultivo, es
posible obtener plantas libres de microbios en un medio nutritivo aséptico
(estéril) en condiciones ambientales controladas. Las primeras experiencias
relacionadas al cultivo de tejidos vegetales se remontan a 1902, pero recién en
1922 se logró el primer experimento exitoso: germinación in vitro de semillas de
orquídeas. Luego de la germinación, las plántulas obtenidas se transfirieron a
un medio de cultivo en condiciones asépticas, y así se mantuvieron protegidas
del ataque de patógenos (hongos, virus y bacterias). El avance alcanzado por
las ciencias biológicas ha permitido en los últimos años el estudio detallado de
las plantas tanto a nivel celular como molecular, y en condiciones de laboratorio
es posible actualmente reproducir todos los factores que puedan incidir en el
crecimiento y desarrollo de las plantas. Este principio general se aplica también
al cultivo in vitro de plantas.
Reproducir en condiciones de laboratorio todos los factores que conforman el
ambiente de la planta en la naturaleza es técnicamente muy complejo. Por esa
razón se realiza una simplificación de la realidad escogiendo aquellos factores
que se puedan mantener controlados. Cuando no se realiza el estudio con todo
el ser vivo sino con solamente una parte del mismo, se utiliza el término
explante para indicar la parte del órgano ó tejido vegetal que se cultiva in vitro.
A la dificultad de reproducir las condiciones naturales en condiciones de
laboratorio, se debe añadir en este caso la dificultad de suministrar al ex plante
todo aquello que antes obtenía del sistema completo. En resumen, el cultivo in
vitro de plantas es una técnica que exige un control específico del ambiente,
tanto físico como químico, en el que se sitúa al ex plante. Conviene, por tanto,
conocer cuáles son los principales factores que conforman dicho y que deberán
ser controlados. Plantas vegetales cultivadas in vitro son: meristemo, órganos
vegetales (embriones, yemas florales, yemas de semillas, carpelos, semillas,
polen, raíces, hojas, partes de tallos), callos (el que se puede inducir de cada
parte de la planta) y células
Esta técnica tiene numerosas aplicaciones:
Propagación masiva de plantas, especialmente beneficiosa para
especies de difícil propagación por otros métodos, o en vías de extinción
Clonación de individuos de características agronómicas muy deseables
durante todo el año
Obtención de plantas libres de virus
Producción de semillas sintéticas
Conservación de germoplasma: material de un conjunto de individuos
que representa la variabilidad genética de una población vegetal
 Obtención de metabolitos secundarios
Producción de nuevos híbridos
Mejora genética de plantas, incluyendo obtención de plantas
transgénicas
Germinación de semillas.
Producción de haploides.
Estudios fisiológicos diversos.

Bases biológicas del cultivo de tejidos:

La totipotencialidad celular
La reproducción asexual de plantas por cultivo de tejidos es posible gracias a
que, en general, las células de un individuo vegetal poseen la capacidad
necesaria para permitir el crecimiento y el desarrollo de un nuevo individuo, sin
que medie ningún tipo de fusión de células sexuales o gametos. Esta
capacidad se denomina totipotencialidad celular y es característica de un grupo
de células vegetales conocidas como células meristemáticas, presentes en
distintos órganos de la planta. Básicamente, la reproducción asexual se puede
realizar debido a que las células vegetales poseen un mecanismo de división
mitótico, al igual que las células animales, mediante el cual cumplen sucesivas
etapas de crecimiento y desarrollo. La división celular mitótica implica una
replicación de los cromosomas de las células hijas, por lo que las mismas
poseen un genotipo idéntico al de la célula madre. La potencialidad de una
célula diferenciada (una célula de conducción, epidérmica, etc.) para generar
tejidos nuevos y eventualmente un organismo completo, disminuye con el
grado de diferenciación alcanzado por esa célula, pero puede revertirse parcial
o completamente según las condiciones de cultivo a las que se la someta.
Así, las células vegetales crecidas en condiciones asépticas sobre medios de
cultivo adicionados con hormonas vegetales, pueden dividirse dando dos tipos
de respuesta:
i) una desdiferenciación celular acompañada de crecimiento tumoral, que da
lugar a una masa de células indiferenciadas denominada callo, la cual bajo las
condiciones adecuadas es capaz de generar órganos o embriones somáticos
(llamados así porque son estructuras similares a un embrión pero que no se
originaron por unión de gametos),
ii) una respuesta morfo genética por la cual se forman directamente órganos
(organogénesis) o embriones (embriones somáticos).
La primera respuesta se conoce como organogénesis o embriogénesis
indirecta mediada por un estado de callo) mientras que la segunda respuesta
se considera organogénesis o embriogénesis directa.
Como se comentó previamente, el cultivo in vitro consiste en tomar una porción
de una planta (a la que se denomina explanto, como por ej. el ápice, una hoja o
segmento de ella, segmento de tallo, meristemo, embrión, nudo, semilla,
antera, etc.) y colocarla en un medio nutritivo estéril (usualmente gelificado,
semisólido) donde se regenerará una o muchas plantas.
La formulación del medio cambia según se quiera obtener un tejido des
diferenciado
(callo), crecer yemas y raíces, u obtener embriones somáticos para producir
semillas artificiales.
El éxito en la propagación de una planta dependerá de lograr la expresión de la
potencialidad celular total, es decir, que algunas células recuperen su condición
meristemática. Para lograrlo, debe inducirse primero la desdiferenciación y
luego la re diferenciación celular. Un proceso de este carácter sucede durante
la formación de las raíces adventicias en el enraizamiento de estacas, la
formación de yemas.
En todo intento de propagación vegetal, ya sea in vitro o in vivo, el carácter del
proceso de diferenciación depende del genoma de la especie, y está regulado
por el balance hormonal propio y por el estado fisiológico del órgano, tejido o
célula puesta en cultivo.
Sin embargo, también se sabe que ese balance puede ser modificado por el
agregado de compuestos que imiten la acción de las hormonas vegetales. Esos
compuestos, denominados reguladores del crecimiento, son los que se
emplean en los medios de cultivo para conseguir la micro propagación de una
planta

Pasos para generar plantas a partir de explantos aislados

En los protocolos utilizados durante el cultivo in vitro, se pueden distinguir las
siguientes etapas:
1) Elección de la planta y/o tejido donante de explantos.
2) Establecimiento: desinfección de los explantos (generalmente con hipoclorito
de sodio) y su posterior adaptación al medio artificial de modo de inducir callo,
brote, raíz o embrión somático, según se desee.
3) Multiplicación: generar una masa vegetal suficiente para la regeneración del
número de plantas necesarias.
4) Enraizamiento: formación de raíces con el fin de convertir los brotes o
embriones somáticos en plántulas completas.
5) Rusticación: aclimatación de las plántulas obtenidas in vitro a las
condiciones medioambientales ex vitro (suelo o algún sustrato inerte)
El éxito de la técnica depende de muchos factores, entre ellos la edad de la
planta (a mayor edad, menor potencial de regeneración), el genotipo y las
condiciones medioambientales. Entre las ventajas del cultivo in vitro de material
vegetal, se pueden incluir los tiempos más cortos, y la posibilidad de ocupar un
espacio mucho más pequeño que si se desea propagar material in vivo

Algunos elementos necesarios para hacer cultivo de tejidos

vegetales
Para llevar adelante este trabajo, se necesitan equipamientos que generen las
condiciones necesarias de esterilidad, como los flujos laminares, que son
estaciones de trabajo que hacen circular aire filtrado y estéril, protegiendo así
que se desea trabajar.
Además, se necesita un soporte para el explanto, que puede ser sólido o
líquido, y que está conformado por algún agente gelificante inerte (agar, gelrite,
etc.), macro y micronutrientes esenciales para la supervivencia de la planta,
nutrientes (hidratos de carbono, vitaminas), agentes reguladores del
crecimiento y hormonas vegetales que ayudarán a obtener una planta o un
órgano en particular, a partir del explanto elegido. Algunos de los elementos
mencionados pueden ser reemplazados por mezclas poco definidas en su
composición (jugo de tomate, agua de coco, etc.), que pueden dar buenos
resultados y generalmente resultan más económicas. La acidez de los medios
de cultivo para plantas suele variar entre pH=5 y 6,5. Luego se regulan las
condiciones de temperatura y de fotoperiodo (relación de horas luz y horas
oscuridad). Según sea el balance hormonal y otras condiciones de cultivo, se
puede propiciar la regeneración de distintos órganos o formaciones vegetales.
Por ej., si el balance de cito quininas/auxinas es mayor que 1, se favorece la
generación de brotes; si es menor que 1, la generación de raíces; y si es igual
a 1, la formación de callos.
Composición de medios de cultivo para células vegetales:

El cultivo in vitro y la biotecnología:

El cultivo de meristemas
El cultivo de meristemas tiene numerosas aplicaciones. Una de las más
importantes es la obtención de plantas libres de virus, ya que esta pequeña
zona de tejido generalmente no es afectada por estos patógenos vegetales.
Otra muy importante es la multiplicación vegetal. La potencialidad de la técnica
se demuestra con un ejemplo: a partir de una yema apical, se pueden obtener
4.000.000 de claveles en un año. La técnica permite también multiplicar
especies de plantas con reproducción lenta o dificultosa (como las orquídeas),
o acelerar la producción de plantas bianuales.

Cultivo de meristemas. A partir de un meristema aislado se puede obtener una

planta completa .En la yema apical se encuentran un grupo de células que
conforman el meristema apical (tiene un tamaño entre 0,01 y 0,3 mm), tejido
embrionario que tiene la capacidad de formar todos los tejidos de la planta. A
partir de ellos se pueden regenerar plantas completas
Cultivo de células y órganos vegetales en biorreactores
Una vez obtenidos los callos a partir de algún explanto, los mismos pueden
disgregarse para obtener una suspensión de células. Esta suspensión puede
utilizarse para generar embriones somáticos (la base de las semillas sintéticas),
o puede directamente cultivarse para producir metabolitos secundarios, que son
compuestos químicos sintetizados por las células vegetales en determinadas
condiciones, con gran utilidad para las industrias farmacéutica y alimenticia,
entre otras. Por ejemplo, son metabolitos secundarios el mentol y las drogas
anticancerígenos vincristina y taxol, y algunos edulcorantes. Los cultivos
celulares se llevan a cabo en biorreactores, que son recipientes de distinta
capacidad (de unos pocos a miles de litros), diseñados para propiciar el
crecimiento y/o la multiplicación de distintos tipos de células y/o órganos .Las
raíces vegetales también pueden ser cultivadas en biorreactores, especialmente
aquellas transformadas por Agrobacterium rhizogenes, que produce un aumento
abrupto en el tamaño y ramificación de la raíz, aumentando así la biomasa, y por
ende la cantidad del producto deseado. Un ejemplo de compuesto farmacológico
producido por cultivo de raíces es el paclitaxel, o taxol, que es utilizado como
anticancerígeno.
Cultivo de células y órganos vegetales. A partir de un explanto se pueden establecer
cultivos de células para producir compuestos de interés, o para obtener embriones
somáticos y semillas artificiales, entre otras aplicaciones.

La micropropagación
La propagación de plantas in vitro es una técnica muy utilizada en cultivos de
importancia económica. Permite cultivar células, tejidos, órganos, semillas,
embriones y obtener individuos selectos en forma rápida. Los cultivos son
realizados por personal especializado en medios específicos (hormonas,
minerales, vitaminas, fuente de carbono, agente gelificante, agua, etc.) y
condiciones ambientales controladas (temperatura, humedad y luz).Una vez
ajustados los protocolos para la especie o cultivo de interés, es posible
automatizar el proceso de modo de llevarlo a mayor escala de producción. La
micropropagación (propagación clonal por cultivo in vitro) constituye uno de los
métodos biotecnológicos que mayores logros ha aportado al desarrollo de la
agricultura, ya que se la usa en la producción masiva de especies hortícolas,
aromáticas, medicinales, frutícolas, ornamentales y forestales.
Con finalidad puramente descriptiva se puede clasificar los principales factores
no biológicos que afectaran al desarrollo del cultivo in vitro, incluyendo:
Ambiente químico
• Composición del medio de cultivo
• pH
Ambiente físico
• temperatura
• luz y fotoperíodo
• humedad
La micropropagación generalmente comprende etapas:
Dentro del proceso de micropropagación diferenciamos varias fases o etapas:
0: Selección y Preparación de la planta madre
1: Desinfección de las yemas de la planta y/o desinfección de semillas
2: introducción del material seleccionado in vitro
3: Multiplicación de brotes
4: Enraizamiento
5: Aclimatación
Esta secuencia de etapas abarca el ciclo completo de la multiplicación de
plantas in vitro; puede ser aplicada a diferentes especies vegetales, en cada
caso se podrán incluir simplificaciones o cambios de acuerdo a las
características de las plantas, pero en términos generales son comunes al
proceso de propagación in vitro.

FASE 0:
PREPARACIÓN DE LA PLANTA MADRE
Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener
explantes con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado. Para
obtener estos explantes es recomendable mantener a las plantas madre, es
decir la planta donadora de yemas, durante un período de tiempo que puede
oscilar entre unas semanas ovarios meses en un invernadero bajo condiciones
controladas. En ese ambiente se cultiva la planta en condiciones sanitarias
óptimas y con un control de la nutrición y riego adecuados para permitir un
crecimiento vigoroso y libre de enfermedades.
FASE 1:
DESINFECCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL
Una vez elegida la planta madre, se extraerán los fragmentos a partir de los
cuales se obtendrán los explantes. Los explantes pueden ser yemas, trozos de
hojas, porciones de raíces, semillas, etc. Antes de extraer los explantes se hará
una desinfección de los fragmentos de planta madre para eliminar los
contaminantes externos. Los contaminantes más comunes son los hongos y las
bacterias que habitan en forma natural en el ambiente. Una vez desinfectado el
material vegetal, se debe mantener en condiciones de asepsia.
A efectos de obtener las condiciones de asepsia, se trabajará en cabinas de
flujo laminar para extraer los explantes a partir del material vegetal. Estos
explantes se
introducirán en un tubo de cultivo conteniendo medio de iniciación para poder
controlar la sanidad y la viabilidad, luego de realizar la desinfección del material
con hipoclorito de sodio (agua clorada comercial), pura o diluída durante un
período de 5 a 15 minutos, seguido por 3 a 4 enjuagues en agua esterilizada.

FASE 2:
INTRODUCCIÓN DEL MATERIAL IN VITRO
Luego de la desinfección superficial, las semillas o las yemas dependiendo del
material seleccionado, se ponen en medio de cultivo estéril. En un período de
una semana o quince días, comienza el proceso de germinación o
regeneración de nuevos tejidos vegetales, iniciando el ciclo de cultivo in vitro.
FASE 3:
MULTIPLICACIÓN DE LOS BROTES
Durante esta fase se espera que los explantes que sobrevivieron la FASE 1 y
2originen brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varias hojas. En la
base de cada hoja hay una yema que se desarrollará luego de ser puesta en
contacto con el medio de cultivo. Periódicamente estos nuevos brotes se deben
subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de
cultivo u otros recipientes adecuados. Estas operaciones se realizan en la
cámara de flujo laminar o en un lugar aislado que nos permita mantener las
condiciones de asepsia. De esta forma aumenta el número de plantas en cada
repique o división de las plantas.
El número de plantas que se obtiene dependerá de la especie vegetal y de las
condiciones del medio de cultivo. El número de plantas que se obtiene por la
vía de la micropropagación permite alcanzar incrementos exponenciales,
considerando que todos los factores que afectan el crecimiento hayan sido
optimizados.

FASE 4:
ELECCIÓN DE UN MEDIO DE ENRAIZAMIENTO DE LOS EXPLANTOS
Para enraizar los explantes se utilizan principalmente plantines individuales de
un tamaño aproximado de 2 centímetros. Los brotes obtenidos durante la fase
de multiplicación se transfieren a un medio libre de reguladores de crecimiento
o que solo contenga hormonas del tipo auxinas. Algunas especies de plantas
no necesitan pasar por esta etapa y emiten sus raíces en el mismo medio de
cultivo donde desarrollan yemas nuevas, por lo tanto el proceso de
multiplicación y enraizamiento transcurren en forma simultánea.
FASE 5:
ACLIMATACIÓN DE LOS EXPLANTOS ENRAIZADOS
Los explantes recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales,
de manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso depende de la
aclimatación. En esta etapa las plantas sufrirán cambios de diferente tipo que
permitirán la adaptación de las mismas a vivir en condiciones naturales. En el
momento en que se extraen los explantes o plantines enraizados de los
frascos, están poco adaptados a crecer en un invernadero, ya que estos
explantes han enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy
elevada y generalmente tienen estomas (estructuras responsables de regular la
transpiración y pérdida de agua en la planta) que no son completamente
funcionales frente a descensos de la humedad relativa, y por lo tanto
demasiado lentos para evitar la desecación del explante. Por otra parte, crecer
en ambientes tan húmedos también suele implicar la falta de una cutícula con
cera bien desarrollada, que representa la barrera física para evitar la pérdida de
agua a lo largo de toda la superficie de la planta.

Los plantines enraizados, deben ser aclimatados a las condiciones de

humedad del invernadero disminuyendo progresivamente la humedad relativa e
incrementando progresivamente la intensidad de luz. Estos plantines se
plantarán en contenedores (almacigueras) cubiertos por un plástico, para
mantener la humedad relativa elevada.
La elección de un sustrato con buenas características físicas, es clave para el
éxito de esta etapa. Para el trasplante, elegimos un sustrato suelto, poroso, con
mezcla de arena turba, cáscara de arroz quemado, para permitir un desarrollo y
crecimiento de raíces muy rápido. Las mezclas son diferentes y muy variadas
de acuerdo a la especie con la que estamos trabajando.
Luego de retirar cuidadosamente el agar de las raíces para evitar dañarlas, los
plantines se enjuagan y se colocan en almacigueras con la mezcla de sustratos
seleccionada y cubiertos con nylon. Todos los días se debe controlar el nivel de
humedad en las almacigueras. Si es necesario, se aplica un riego con una
pulverizadora manual, para mantener un ambiente húmedo a nivel del
sustrato. A los 15 días del trasplante, se puede comenzar a levantar la
cobertura de nylon en las horas de menor calor (temprano en la mañana o en la
última hora de la tarde). Al comienzo las plantas se dejan media hora por día
destapadas. A la semana siguiente se dejan destapadas durante una hora. Al
mes del trasplante, se dejan tapadas durante la noche y si hay crecimiento de
nuevas hojas, las plantas pueden permanecer destapadas. Las condiciones del
cultivo in vitro, generan cambios en algunos aspectos anatómicos y fisiológicos
de las plantas, por esta causa, durante la aclimatación, los cambios deben ser
muy graduales, para minimizar el estrés y tener mayor tasa de sobrevivencia.

La siguiente lista presenta una comparación de las características de una

planta en condiciones de laboratorio (in vitro) respecto a una planta en
condiciones naturales (in vivo):

In vitro
 No realiza fotosíntesis
 Crecimiento en condiciones controladas
 Crecimiento en condiciones de asepsia
 Alta humedad relativa
 Estomas no funcionales
 Ausencia de pelos radiculares
 Ausencia de cera en la cutícula
In vivo
 Realiza fotosíntesis
  Crecimiento en condiciones no controladas
 Exposición a los patógenos y gérmenes del ambiente
 Humedad relativa variable
 Estomas funcionales
 Presencia de pelos radiculares
 Presencia de cera en la cutícula
Costos de la Micropropagacion
 Capital para la instalación del laboratorio
 Costo de la mano de obra
 Costo de los materiales
 Características del comportamiento in vitro del material
 Facilidad de establecimiento, rejuvenecimiento, etc.
 Tasa de multiplicación
 Enraizamiento in vitro/ex vitro
Pérdidas que ocurren en cada etapa del proceso
 Contaminación
 Hiperhidricidad
 % plantas que no enraízan
 % plantas que no sobreviven la aclimatación