SUBSECRETARÍA DE EDUCACIÓN SUPERIOR

TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO

Ingeniería Bioquímica

Genética y biología molecular

Aplicaciones de las mutaciones

Presenta: Delgadillo Rayas Aramara Korael

Catedrático: IBQ. Juan Enrique Cortés Valle

Villa de Álvarez, Col., a 10 de mayo del 2018

 1. APLICACIONES DE LA CLONACIÓN DE GENES

1.1 Mutación genética

Definida por De Vries en 1901 como cualquier cambio heredable en el material genético expresado
mediante segregación o recombinación, actualmente es definida como un cambio que se produce en la
información codificada del ácido nucleico, pudiendo ser espontánea o inducida, son requiriendo
participación humana y ocurriendo cada determinado número de generaciones durante la replicación del
DNA o durante las fases G1 y G2 del ciclo celular para el primer caso, mientras que la mutación inducida
se lleva a cabo por la acción de agentes físicos (luz ultravioleta, rayos X, etc.) y químicos (5-
bromodiuxiuridina, hidroxilamina, etc.), es decir, que se requiere de un agente mutagénico que
aumentarán la frecuencia de mutantes en la población.

Una clasificación más para definir los tipos de mutaciones estará dada por la magnitud de la misma, de la
forma:

• Mutación génica o puntual, la secuencia de pares de bases en una molécula de DNA es alterada.
o Mutaciones somáticas, afectarán solo al individuo mutado, apareciendo individuos
mosaicos que poseen dos líneas celulares diferentes con distintos genotipos, heredándose
esta información celular a las células que derivarán por divisiones mitóticas.
o Mutaciones germinales, que afectarán la línea germinal del organismo con reproducción
sexual, transmitiéndose a generaciones posteriores a través de los gametos, teniendo mayor
importancia desde el punto de vista evolutivo.

Son clasificadas a su vez por el mecanismo mutagénico en:

o Sustituciones de pares de bases, provocando la alteración de un único triplete y, a menos

que se trate de un triplete de parada o un aminoácido del centro activo de una enzima, no
resultan perjudiciales.
▪ Transiciones, como el cambio de un nucleótido de una base púrica por otra púrica o
de una pirimidina por otra pirimidina.
▪ Transversiones, cambio de una base púrica por una pirimidínica o viceversa.
o Perdida o inserción de nucleótidos, induciendo a un corrimiento en el orden de lectura, que,
de no compensarse entre sí, pueden alterar la secuencia de aminoácidos de la proteína
codificada, con consecuencias graves, la subclasificación de estas mutaciones resulta en:
▪ Adiciones, la inserción de nucleótidos en la secuencia del gen.
▪ Deleciones, pérdida de nucleótidos.
• Mutaciones cromosómicas estructurales, con cambios en la estructura interna de los cromosomas,
de la forma:
o Pérdida o duplicación de segmentos
▪ Deleción cromosómica, pérdida de un segmento en el cromosoma.
▪ Duplicación cromosómica, repetición de un segmento en el cromosoma.
o Variaciones de distribución de los segmentos de los cromosomas
▪ Inversiones, situándose el segmento cromosómico en posición invertida.
▪ Translocaciones, donde un segmento cromosómico se encuentra situado en otro
cromosoma.
• Mutaciones cromosómicas numéricas, con alteraciones en el número de los cromosomas propios
de la especie, con las distinciones:
 o Euploidía, afecta al número de juegos completos de cromosomas con relación al número
normal de cromosomas de la especie, clasificadas según el número de cromosomas que
tengan de la forma:
▪ Monoploidía o haploidía, células con un solo juego (n) de cromosomas.
▪ Poliploidía, con más de un juego, con prefijos según la cantidad, de la forma
triploides (3n), tetraploides (4n), etc.

Las euploidías también son clasificadas por la procedencia de los cromosomas implicados, resultando:

▪ Autopoliploidía, donde todos los juegos proceden de la misma especie.

▪ Alopoliploidía, con juegos que proceden de la hibridación de dos especies.
o Aneuploidias, sólo una parte del juego cromosómico y el zigoto presenta cromosomas de
más o menos, pudiéndose dar en autosomas, como en heterocrosomas o cromosomas
sexuales, denominándose a su vez:
▪ Monosomías, falta de uno de los cromosomas de la pareja de homólogos.
▪ Trisomías, tres cromosomas en lugar de los dos normales.
▪ Tetrasomías, etc.

1.2 Mutagénesis dirigida

La genética inversa depende de la capacidad de crear mutaciones en secuencias determinadas del DNA,
para luego estudiar los efectos de las mutaciones en el organismo, estas mutaciones se inducen en
ubicaciones específicas mediante un proceso llamado mutagénesis dirigida. Se han desarrollado varias
estrategias para la mutagénesis dirigida, especificándose a continuación las tres técnicas más utilizadas.

1.2.1 Mutaciones In vitro

A grandes rasgos la técnica se centra en preparar una amplia colección (o biblioteca) de fragmentos de
DNA y, posteriormente, identificar a aquellos miembros de la colección que contienen el gen que nos
interesa. Primeramente, una muestra que contiene muchas copias del DNA genómico total se somete a
fragmentación mecánica o es digerido parcialmente mediante enzimas de restricción para obtener
fragmentos de gran tamaño, generándose una población aleatoria de fragmentos de DNA que se solapan,
a continuación, estos fragmentos son separados mediante electroforesis en gel para aislar el conjunto de
todos los fragmentos que tienen una longitud de unas 15 kb.

Utilizando los mismos mecanismos usados por las células para la manipulación molecular, la DNA ligasa es
capaz de volver a sellar las mellas en el esqueleto de NDA originadas durante la replicación y reparación
del DNA, resultando una herramienta útil para unir cualquiera de dos fragmentos de DNA de cualquier
fuente, de este modo los fragmentos de DNA aislados son recombinados en el tubo de ensayo para
producir moléculas de DNA mutadas, que una vez unidos las células no pueden determinar cuál de los dos
DNA estaban separados originalmente, tratándolo como una sola molécula, por lo que dichas moléculas
son insertadas en un vector, que generalmente son DNA vírico, previamente preparado con extremos
cohesivos, una vez insertados en el vector, se infectan bacterias de E. coli, generalmente, con estos fagos
recombinantes, que se replicarán y acabaran provocando la lisis celular, el lisado contiene fragmentos de
DNA original alojados en un número de partículas víricas lo suficientemente elevado para asegurar que
prácticamente todo el genoma se encuentra representado, constituyendo estos fagos una biblioteca
genómica. Al poderse propagar estos fagos de una forma indefinida y, por tanto, la biblioteca se puede
utilizar repetidamente durante largos periodos de tiempo.
A continuación, se explora la biblioteca genómica para encontrar la pequeñísima fracción de fagos que
albergan el gen de interés, resultando esencial disponer de una técnica exploratoria muy rápida y eficiente,
un método usado es mediante la hibridación del DNA, sembrando una suspensión diluida de fagos
recombinantes sobre un césped bacteriano, para formar “calvas” en la placa en el lugar donde una
partícula vírica se encuentre con una bacteria y la infecte. Posteriormente se hace una réplica de esta placa
original colocando una hoja de nitrocelulosa. las bacterias infectadas y el DNA de los fagos procedentes de
las células lisadas se adhieren a la hoja formando un conjunto de manchas cuya posición se corresponde
con las calvas formadas en la caja Petri original. Las bacterias intactas depositadas sobre esta hoja se lisan
con NaOH que, de paso, desnaturaliza el DNA y crea condiciones parala hibridación con una sonda marcada
con 32P.

Figura 1. Inserción de DNA

recombinante en vectores Figura 2. Revelación de transformación por
autorradiografía

Utilizando como sonda una molécula de DNA o RNA completamente marcada radiactivamente se puede
detectar la presencia de una secuencia específica de DNA con una única mancha de la réplica.
Posteriormente la autorradiografía revela la posición de las manchas de la réplica que albergan el DNA
recombinante, las calvas correspondientes se extraen de la placa Petri original y se cultivan por separado.
Haciéndose posible aislar prácticamente cualquier gen, siempre que se disponga de una sonda adecuada,
una posibilidad de aumentar la especificidad de la sonda resulta de comenzar a partir del mRNA
correspondiente extraído de las células donde éste abunda, por ejemplo, células precursoras de los
eritrocitos y células plasmáticas. Otro método consiste en la preparación de la sonda al conocer la
secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el gen, usando secuencias peptídicas que
contengan triptófano o metionina para evitar el problema de que una secuencia peptídica pueda estar
codificada por distintos oligonucleótidos, ya que estos aminoácidos están especificados por un único
codón. Todas las secuencias de DNA que codifican la secuencia peptídica seleccionada (o sus secuencias
complementarias) se sintetizan en fase sólida y se marcan radiactivamente mediante la fosforilación de
sus extremos 5’ con 32P. la membrana de nitrocelulosa se coloca en presencia de una mezcla que contenga
todas estas sondas y se somete a autorradiografía para identificar los clones con una secuencia de DNA
complementaria para, a continuación, secuenciar los clones positivos para determinar cuáles contienen
una secuencia que coincida con la de las proteínas de interés.

1.2.2 Mutaciones dirigidas al sitio

1.2.2.1 Sustituciones: mutaciones dirigidas mediante oligonucleótidos

Basado en el cambio de la secuencia de DNA al utilizar un cebador que contiene un nucleótido mal
emparejado, más específicamente, se sintetiza un oligonucleótido que contiene la mutación puntual
deseada, cambiando un solo nucleótido, se separan las dos hebras del plásmido que contiene la secuencia
del gen objetivo y, a continuación, el cebador se empareja con la hebra complementaria, el
emparejamiento incorrecto de un par de bases de un total de 15 se tolera bien siempre que la hibridación
se realice a una temperatura adecuada, posterior al emparejamiento, el cebador se alarga por medio de
la DNA polimerasa y el círculo de doble hebra se cierra, añadiendo DNA ligasa. La doble cadena de DNA se
introduce en una célula, en la que se replica, dicha replicación de esta estructura de doble hebra da lugar
a dos tipos de progenie plasmídica, una mitad con la secuencia original y la otra mitad con la secuencia
mutada, la expresión del plásmido que contiene la nueva secuencia producirá una proteína con la
sustitución deseada, pudiéndose la progenie celular que contiene el gen mutado y cultivándose para
producir una población pura de células, realizándose así proteínas con características hechas a medida.

1.2.2.1.1 Inserciones: cassette de mutagénesis

El DNA plasmídico se corta con un par de enzimas de restricción para eliminar un segmento corto, a
continuación, se añade un oligonucleótido sintético de doble hebra (cassette) cuyos extremos cohesivos
son complementarios a los extremos del plásmido escindido y se liga a éste, conteniéndose en cada
plásmido la mutación deseada.

Útil para la inserción de secuencias cortas del péptido en una proteína de interés, cuando una región
específica de la proteína será sujeto de una mutagénesis extensa, repetida o de ambos tipos, y para la
generación de proteínas que contienen todas las secuencias posibles en un segmento corto.
 Figura 3. Mutagénesis dirigida por oligonucleótidos. Figura 4. Mutagénesis de cassette.

1.2.2.2 Mutagénesis dirigida por PCR

Se llevan a cabo dos reacciones con la PCR, cada una de las cuales utiliza un cebador oligonucleótido
portador de la mutación deseada y un cebador que hibrida a una secuencia que flanquea la secuencia del
gen de interés, los dos productos de estas reacciones con la PCR corresponden cada uno a alrededor de
50% de la secuencia del DNA objetivo original, éstos son luego desnaturalizados, mezclados juntos y
sometidos a otra reacción de PCR, la cual conduce a la síntesis de moléculas de longitud total que
contienen la fijación.

2. ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GENÉTICA

En muchos casos las claves para la función proteica pueden obtenerse al analizar cuándo y dónde se
expresa el gen en la célula o en el organismo como un todo, la determinación del patrón y del momento
de expresión de un gen puede llevarse a cabo mediante la unión de la región reguladora de un gen, en
estudio junto a un gen marcador (con actividad fácilmente observada), ya que la expresión génica es
controlada mediante secuencias de DNA reguladoras usualmente localizadas corriente arriba de la región
codificante, que no se trascriben por sí mismas. Estas secuencias reguladoras, que controlan qué células
expresarán un gen y en qué condiciones, también pueden obtenerse para controlar la expresión de un gen
marcador, por lo que el nivel, el momento y la especificidad celular de producción de una proteína
marcadora reflejarán la función del gen original así como la acción de las secuencias reguladoras que
pertenecen a éste, para la mayor parte de los casos la expresión de un gen marcador se observa mediante
el rastreo de fluorescencia o actividad enzimática de este producto proteico. La velocidad a la que se
expresa un gen estructural depende de sus secuencias de control en el extremo 5’. Por consiguiente, la
velocidad de expresión de un gen puede supervisarse mediante el reemplazo de la porción que codifica la
proteína o al fusionarla en el marco de un gen que expresa una proteína cuya presencia puede
determinarse con facilidad.

2.1 Microarreglos de DNA

Son dispositivos construidos usando microtécnicas de alta precisión capaces de sintetizar en superficies
muy pequeñas miles de copias de moléculas, para el caso de los microarrays para medir la expresión génica
lo que se sintetizan son oligonucleótidos de DNA; es decir, fragmentos cortos de DNA y determinando la
expresión genética completa de un tejido en un momento determinado. Esta foto genética transversal de
un tejido concreto de denomina transcriptoma, que al contrario del genoma (conjunto de todos los genes
existentes en una célula), cambia continuamente en respuesta a cambios

2.1.1 Diseño base de un microarray

La tecnología utilizada en el diseño de los microarrays se apoya en la propiedad biomolecular fundamental

del DNA de “complementariedad” de las bases nitrogenadas por unión específica de las bases
nitrogenadas por puentes de hidrógeno. Como es sabido, cada tipo de célula tiene activado un tipo de
genes del genoma, resultando de los “genes expresados”, que han sido transcritos por la maquinaria de
transcripción celular a mRNA, que son copias de una hebra del DNA génico. Los mRNA sale del núcleo y se
van a traducir en proteínas, por lo que se pueden determinar qué genes están expresados o activados en
una célula midiendo la cantidad de mRNA correspondiente a ese gen que hay en ella, sin embargo, el
mRNA es muy inestable, por lo que para poder manipularlo la biotecnología ha diseñado herramientas
para pasarlo de retro transcripción in vitro de mRNA a cDNA.

Basados en ese principio los microarrays son un tipo “chip” del tamaño aproximado de un sello donde,
sobre una matriz inerte, se depositan miles de “hebras simples” de DNA de secuencias génicas,
oligonucleótidos, de modo que sobre ellos pueden hibridar las secuencias complementarias que son las
que se obtienen del mRNA de las muestras biológicas que queremos analizar. El procedimiento básico para
trabajar con ellos es el siguiente:

1. Marcar la muestra del tejido a estudiar con un tinte fluorescente.

2. Aislar el mRNA de las células de interés y proceder a copiarlo mediante una síntesis in vitro
para pasarlo a cDNA.
3. Desnaturalizar ese cDNA para obtener hebras simples.
4. Poner el cDNA troceado sobre el microarray donde las hebras simples de cDNA son atraídas
por las hebras simples de oligonucleótidos del microarray uniéndose a ellas para volver a
conformar la estructura de doble-hélice similar a la del DNA (hibridación).
5. Lavar el microarray para quitar las hebras simples de la muestra que no se han hibridado.
6. Escanear el microarray con un láser para cuantificar la fluorescencia de cada gen.

Un alto nivel de fluorescencia indica que muchas copias del mRNA de ese gen han hibridado en el chip y,
por tanto, el gen tiene mucha actividad en la célula (o viceversa).
 Figura 5. Mutagénesis dirigida por PCR. Figura 6. Metodología para el uso de microarrays.

2.2 Proteómica

El proteoma representa un eslabón en la cadena de información entre el genotipo y el fenotipo, el término

fue acuñado en 1994 para definir a todas las proteínas que son expresadas por un genoma en un tejido de
la célula análogo al perfil de transcritos en una situación dada, con la diferencia de que una biblioteca
genómica es visto como una colección de genes que no cambia entre célula y célula, mientras que el
proteoma es una entidad cambiante que difiere de un individuo a otro, prediciéndose que el número de
proteínas expresadas en el humano van de 50 a 500 mil, además, a diferencia de los estudios de
transcriptómica en los que el RNA se extrae y manipula con facilidad, los estudios con proteínas presentan
múltiples desafíos, como la heterogeneidad fisicoquímica y complejidad estructural de las proteínas, lo
que complica la extracción, solubilización, manejo, separación e identificación.

El proteoma de un organismo es un elemento altamente dinámico, ya que sus componentes varían

dependiendo del tejido, célula o compartimiento celular que se estudie y estos, a su vez, pueden cambiar
debido a alteraciones en su ambiente, como situaciones de estrés, acción de fármacos, requerimientos
energéticos, o su estado fisiológico normal o patológico.

Las nuevas tecnologías a gran escala pueden dividirse en proteómica de expresión, que tiene como
objetivo la descripción del proteoma total de un tejido, fluido, tipo celular, u organelo y las mediciones
cuantitativas de los niveles de expresión y proteómica funcional, que se encarga del estudio de la función
de proteínas dentro del sistema biológicos (relaciona cambios de expresión con una función determinada)
y la regulación de su expresión, incluyendo las interacciones proteínas-proteínas, proteínas-DNA,
proteínas-RNA y las modificaciones post-traduccionales.

2.2.1 Herramientas de la proteómica

Dado que las mismas características que otorgan a las proteínas su papel fundamental como moléculas
efectoras de la función celular (diversidad química y estructural y abundancia relativa) también dificultan
su análisis experimental, por lo que la investigación proteómica es el resultado de la aplicación de un
conjunto de técnicas que permiten el estudio de proteínas, como pueden ser:

1. Separación de las proteínas. Una muestra proveniente de un sistema biológico es una mezcla
compleja de proteínas que deberán ser separadas principalmente por técnicas cromatográficas
y/o electroforéticas, siendo las más usadas la electroforesis unidimensional (SDS-PAGE) y
bidimensional (2-D PAGE), electroforesis capilar, cromatografía líquida de lata resolución (HPLC),
cromatografía de afinidad, de exclusión molecular y de intercambio iónico.
2. Procesamiento de la muestra. El primer paso es la reducción de los puentes de disulfuro y la
alquilación de las cisteínas que tiene como objetivo desnaturalizar las proteínas permitiendo que
se expongan los sitios específicos de corte enzimático y evitando la formación de dímeros.
3. Análisis por espectrometría de masas, involucrando la ionización de los componentes de la
muestra en fase gaseosa, la separación de las especies iónicas resultantes de acuerdo a la relación
de su masa con su carga eléctrica utilizando campos electromagnéticos en el vacío, mediante
sistemas de ionización como ESI y MALDI para análisis de macromoléculas.
4. Análisis de datos, mediante la interpretación de los espectros de masas, identificándose las
proteínas a través de mapas peptídicos, ya que la secuencia de una proteína es única y al ser
cortada con una endoproteasa origina un patrón peptídico específico, los valores exactos del
conjunto de las masas moleculares de los péptidos es la representación única de una determinada
proteína directamente relacionada con su estructura primaria.

Figura 7. Metodología para el análisis proteómico.

 3. REFERENCIAS

Alberts, B., & al., e. (2004). Introducción a la Biología Celular (Segunda ed.). España: panamericana.

Berg, M. J., Tymoczko, L. J., & Stryer, L. (2007). Bioquímica. España: Reverté.

Hames, D., & Hooper, N. (2014). Notas Instantáneas de Bioquímica. McGrawHill.

Pando Robles, V., & Ferreira Batista, C. (2008). Proteómica: hacia el entenidmiento del lenguaje de las
proteínas.

Rivas, L., Santos, S., & Rivas, D. l. (2009). Estructura y análisis de microarrays. Salamanca, España.

Voet, D., & Voet, G. J. (2004). Bioquímica. Bogotá: panamericana.