a.

¿Cómo descontaminaría un bisturí que se utilizó para cortar un fragmento de músculo de un cadáver de un día, si se requiere nuevamente
para procesar otra muestra?

1. Remoje los instrumentos: Los instrumentos usados se deben remojar por lo menos 20 minutos en una solución de cloro.
2. Lave los instrumentos: usando un cepillo para quitar la sangre o la mugre que haya en las bisagras o en las orillas ásperas de los
instrumentos.
3. Esterilización
Esterilización con llama: Tan sólo has de mantener el extremo del material que ponemos en contacto con el cultivo encima de la llama del
quemador y dejarlo hasta que se ponga al rojo vivo. Esperar a que utensilio recupere su temperatura normal antes de usarlo con partes de
plástico como un puerto de inyección o un vial de esporas.
Al vapor bajo presión: Las autoclaves esterilizan los instrumentos con vapor y presión. Las autoclaves tienen un medidor de la presión y se
alcanzan los 121 °C cuando éste marca 15 libras por pulgada cuadrada o 1,05 Kg por cm cuadrado. Bisturí envuelto en una bolsa de poli
papel.

b. ¿Cómo podría asegurarse de eliminar completamente toda forma de vida microbiana a un bajo costo?
El autoclave. Equipo diseñado para esterilizar material y
medios contaminados, con el fin de eliminar, de forma
confiable los microorganismos que de otra forma estarían
presentes en objetos que se utilizan en actividades de
diagnóstico, tratamiento o investigación en instituciones
de salud hospitales y laboratorios. Esta esterilización
suele efectuarse con calor húmedo en unos aparatos
denominados autoclaves. También es un equipo de
amplio uso en las industrias de alimentos y en la industria
farmacéutica.

c. ¿En qué se fundamenta el método(s) que utilizó en

el numeral anterior? El calor húmedo generado mediante la inyección de vapor destruye los microorganismos al producir la desnaturalización y
coagulación de las proteínas de los microorganismos.
Estos efectos se deben fundamentalmente a dos razones:
1. El agua es un elemento químico muy reactivo. En la mayoría de las reacciones biológicas interviene el agua.
2. El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho más elevado que el aire.

d. ¿Por qué los elementos a esterilizar deben estar limpios? La limpieza es un proceso esencial, para la reutilización del material, mediante el cual
se elimina la suciedad y materia orgánica que se deposita en un objeto o superficie, disminuyendo la carga microbiana contaminante por arrastre. Es
imprescindible para garantizar la máxima eficacia del proceso de esterilización. Los materiales deben estar limpios, ya que en presencia de grasa el
microorganismo es protegido de la acción del calor.

e. ¿De 2 ejemplos de controles biológicos para controlar la eficiencia del proceso de esterilización por autoclave en materiales y reactivos? Son
dispositivos inoculados con esporas de microorganismos sensibles a los determinados tipos de agente esterilizador que suponen la prueba más
dificultosa para el proceso de esterilización. Es el único control que nos asegura la destrucción total de los microorganismos. Existen diversos tipos de
controles biológicos con esporas bacterianas: A. Tiras de papel impregnado de esporas en envases individuales. B. Ampollas con tiras o discos de papel
inoculados de esporas y provistas de un medio de cultivo incorporado. C. Suspensiones de esporas dosificadas para inocular los productos a esterilizar
y D. Suspensiones de esporas en el propio caldo de cultivo. Las esporas utilizadas son de dos tipos:
■ Bacillus Subtilis (Las esporas utilizadas provienen de Bacillus subtilis variedad Níger como control biológico de la esterilización por calor seco y
óxido de etileno)
■ Bacillus Stearothermophilus (Bacillus stearothermophilus para la esterilización por vapor a presión, plasma de peróxido de hidrogeno y
formaldehído).

f. ¿Qué medidas se deben tener en cuenta en el manejo de cultivos de microorganismos, muestras de sangre y orina?

Microorganismos: Todos los paquetes que contengan cepas microbianas deben ser abiertos en un laboratorio equipado para trabajar con
microorganismos.
• Identificación del agente biológico.
• Medidas en caso de vertido o derrame del contenido del envase suministrado.
• Eliminación del material.

Sangre: En la preparación y manejo de los especímenes biológicos es importante recordar que los factores que deben de tomarse en cuenta para su
óptimo manejo y garantía de la estabilidad de la muestra son:
1. Tiempo y temperatura de conservación. 2. Exposición a la luz. 3. Metabolismo de las células presentes. 4. Difusión de gases. 5. Procesos osmóticos.
6. Interferencias alimenticias y medicamentosas. 7. Anticoagulantes idóneos en su caso. 8. Aplicación de fuerza centrífuga. 9. Transporte, y 10.
Descomposición por factores microbiológicos.

Orina: La muestra debe procesarse inmediatamente o congelarse a 4ºC, una vez en el laboratorio: siembre estéril en un medio de cultivo adecuado;
incubación en condiciones de crecimiento, pasado un tiempo se cuentan las colonias que han crecido.
Para la toma de la muestra:
Realizar higiene de genitales: en mujeres, es necesario lavar el vestí- bulo vaginal y la entrada de la uretra con agua jabonosa, enjuagar con abundante
agua. Secar y separar los labios e iniciar la micción. En el hombre se debe hacer retracción del prepucio y lavar el meato urinario con agua jabonosa,
enjuagar con abundante agua y secar. Con el prepucio retraído iniciar la recolección de la orina. En pacientes ambulatorios es ideal recoger la muestra
de la primera micción del día.

g. Cómo se maneja a nivel mundial un escape de un virus cono el H1N1 Para protegerse, aplique las medidas generales de prevención de la gripe:
• Evite el contacto directo con personas de aspecto enfermizo o que tengan fiebre y tos.
• Lávese las manos con agua y jabón a menudo y concienzudamente.
• Lleve una buena higiene de vida: duerma bien, coma alimentos nutritivos y manténgase físicamente activo.
Si hay algún enfermo en la casa:
• Procure que el enfermo ocupe una zona aparte en la casa. Si eso no es posible, mantenga una separación de 1 metro entre el paciente y las demás
personas.
• Tápese la boca y la nariz cuando cuide al enfermo. Encontrará máscaras en el comercio, o puede fabricarlas con los materiales que tenga a mano,
siembre que sean desechables o se puedan lavar convenientemente.
• Lávese las manos concienzudamente con agua y jabón después de cada contacto con el enfermo.
• Trate de mantener bien ventilada la zona donde se encuentra el enfermo. Utilice las ventanas y las puertas para crear corrientes de aire.
• Mantenga limpio el entorno utilizando productos domésticos de limpieza. Si vive en un país donde la gripe porcina ha causado la muerte de alguna
persona, aténgase a los consejos que dicten las autoridades locales de salud.

h. ¿Qué principio se da al descontaminar por segunda vez agua auto-clavada con rayos U.V? No es muy eficiente, ya que su penetración es muy
débil en líquidos. Además, el agua auto-clavada debe estar libre de microorganismos, por lo tanto usar UV, no tiene impacto sobre la composición
química o en el contenido de oxígeno disuelto en el agua. A este respecto se asegura el cumplimiento con la cada vez más estricta normativa de descarga
del efluente de agua residual.

i. ¿Cuáles condiciones utilizaría si tiene para esterilizar: un instrumento metálico, vidrio y plástico por calor seco?

• Aire caliente – vidrio: Este proceso se lleva a cabo en hornos especiales que permiten la distribución uniforme del calor en su interior, donde el
material se expone a temperaturas de aproximadamente 170ºC durante 2 horas. El tiempo de esterilización se debe determinar para cada tipo de material,
por ejemplo, en el caso de materiales muy resistentes al calor, se pueden usar temperaturas más altas por tiempos más cortos. Entre las ventajas de este
método de esterilización están que no deja residuos, y es un método rápido y económico. Además, permite la esterilización de materiales no miscibles
con el agua como es el caso de polvos, aceites y grasas. Su principal desventaja es que sólo debe emplearse para esterilizar materiales termoestables.
Para controlar este proceso de esterilización se utilizan indicadores físicos tales como los termómetros, los cuales permiten medir la uniformidad de la
temperatura de la cámara interna del horno, indicadores químicos como las cintas adhesivas e indicadores biológicos como las esporas de Bacillus
subtilis.
• Llama directa – instrumento metálico: Consiste en colocar el material directamente al fuego hasta que éste se ponga al rojo vivo. De esta forma se
queman los contaminantes hasta reducirlos a cenizas. Su eficacia depende de la calidad de la llama.
• Incineración – plástico: El material a esterilizar se coloca en cámaras especiales que alcanzan elevadas temperaturas. Con este método se queman
los contaminantes hasta reducirlos a cenizas. Es una forma efectiva de esterilizar el material contaminado a descartar.

j. ¿Cómo podría descontaminar una solución con bromuro de etidio?

El bromuro de etidio es una sustancia cancerígena. La descontaminación se da por:

1. Residuos líquidos:
• Recolectar la solución a descontaminarse en un envase especial para este fin.
• Adicionar 1 g de carbón activado por 1 g de solución.
• Agitar la mezcla anterior por una hora.
• Filtrar la mezcla anterior y descartar en el lavabo, seguido de un chorro abundante de agua.
2. Residuos sólidos:
• Sumergir tanto el filtro con el carbón activado como el gel coloreado con bromuro de etidio, en un recipiente plástico con tapa que contenga agua
destilada y 1 g de carbón activado por cada litro de solución y dejar actuar mínimo durante 1h.
• Colocar una bolsa plástica el filtro con el carbón activado y el gel coloreado con bromuro de etidio; sellar la bolsa y descartarla en el contenedor para
tal fin.

k. ¿Cómo podría eliminar parásitos, hongos y bacterias? Se usa una solución de una cucharada colmada de bicarbonato de sodio en un litro de agua,
sumergir los alimentos durante 20 minutos. En relación con la seguridad personal, se recomienda utilizar guantes, delantales y protección ocular cuando
se preparen diluciones de germicidas químicos. Normalmente no se necesita recurrir a germicidas químicos para la limpieza ordinaria de suelos,
paredes, equipo y mobiliario, pero su uso puede ser apropiado en ciertos casos para controlar brotes.

ANTISÉPTICO Sustancia aplicada en la piel u otro tejido vivo que previene o detiene el crecimiento o la acción de microorganismos por inhibición
de su actividad o por su destrucción. Sustancia química de aplicación tópica sobre tejidos vivos (Piel intacta, mucosas, heridas, etc.), que destruye o
inhibe los microorganismos sin afectar sensiblemente a los tejidos d d on e se aplica. Biocidas o sustancias químicas que se aplican sobre los tejidos
tejidos vi os v , con la finalidad finalidad de dest i ru r o inhibir el crecimiento de microorganismos patógenos.
DESINFECTANTE Sustancia que destruye los gérmenes o microorganismos presentes, a excepción de las esporas bacterianas. Se utiliza este término
término en sustancias aplicadas sobre objetos inanimados. Sustancia química que destruye los microorganismos y que se aplica sobre material inerte
sin alterarlo de forma sensible. Es una solución que destruye o inactiva microorganismos pero no necesariamente los Es una solución que destruye o
inactiva microorganismos, pero no necesariamente los esporos. Agente químico que se aplica sobre superficies o materiales inertes o inanimados,
inanimados, para destruir los microorganismos y prevenir las infecciones.

l. ¿Cuáles son los niveles de bioseguridad en los laboratorios?

 Grupo de
Tipo de laboratorio Prácticas de laboratorio Equipo de trabajo
riesgo

Enseñanza básica, Ninguno, trabajo en mesa de trabajo al

1 TMA
investigación. descubierto.

Servicios de atención
2 primaria, diagnostico,
investigación.
Trabajo en mesa al descubierto y CSB para
TMA y ropa protectora, señal de riesgo biológico.
posibles aerosoles.

Diagnóstico especial, Practica de nivel 2, más ropa especial, acceso

3 CSB y otros medios de contención.
investigación. controlado y flujo direccional del aire.

Practicas del nivel 3, más cámara de entrada con CSB de clase III o trajes pasteurizados junto
Unidad de patógenos
4 cierre hermético, salida con ducha y eliminación con CSB clase II, autoclave de doble puerta
peligrosos.
especial de residuos. más aire filtrado.

TMA: técnicas microbiológicas apropiadas. CSB: cámara de seguridad biológica.

m. ¿Qué condiciones de bioseguridad necesitaría para trabajar con el material genético de los virus: Ébola, dengue hemorrágico y HIV?
 Evitar contacto de piel o mucosas con sangre y otros líquidos de precaución universal
 Lavado de manos por remoción mecánica de microorganismos
 Lavado de manos por remoción química de microorganismos
 Uso de guantes
 Uso de mascarilla
 Uso de delantales protectores
 Uso de boquillas o bolsas de resucitación

1. Se lleva a cabo la manipulación de los patógenos exclusivamente dentro de campanas de flujo laminar nivel 2 para evitar la exposición a salpicaduras
o aerosoles.
2. No se manejan objetos punzocortantes (agujas, navajas ni material de vidrio). En caso de hacerlo, desecharlos en contenedores rígidos rojos de
polipropileno.
3. El material utilizado deber ser desechable.
4. El área de trabajo debe ser desinfectada antes y después del uso.
5. Se manipulan de forma adecuada los desechos biológicos al colocarlos en contenedores y bolsas rojas que posteriormente son descontaminados.
6. El equipo de protección personal involucra: batas desechables que cubran la parte frontal del cuerpo y cierren por detrás, guantes y lentes.
7. Se debe contar con barreras secundarias de protección como acceso controlado del personal, doble puerta, flujo controlado de aire y presión negativa
para evitar la entrada o salida de contaminación
8. Las instalaciones se encuentran aisladas del resto de los laboratorios.

a. ¿Cómo descontaminaría un bisturí que se utilizó para

cortar un fragmento de músculo de un cadáver de un día, si
se requiere nuevamente para procesar otra muestra?

Frecuentemente para los materiales metálicos se utiliza al

flameo como método de descontaminación, el cual consiste en
exponer directamente la pieza metálica a la llama producida por
un mechero de alcohol.

b. ¿Cómo podría asegurarse de eliminar completamente

toda forma de vida microbiana a un bajo costo?

Se podría asegurar mediante la esterilización, debido a que

existen procesos químicos y físicos para que se de este proceso,
se puede optar por realizar autoclave como proceso físico o con
formaldehído y peróxido de hidrógeno como proceso químico,
este último se le considera procedimiento de costo. (Sanitaria,
2013 )

c. ¿En qué se fundamenta el método(s) que utilizó en el numeral anterior?

La autoclave se fundamenta en la inactivación de los virus y bacterias mediante el uso de altas temperaturas y altas presiones, este procedimiento inicia
con el paso del agua osmotizada desde el depósito hacia el generador de vapor, el agua osmotizada entra en el generador de vapor y una resistencia
calentará esa agua y se generará el vapor libre de impurezas que se usará en la esterilización, este vapor pasa desde el generador a la recámara, se trata
de un mecanismo neumático, es decir, que se necesita aire comprimido para la apertura de la llave de paso. (Sanitaria, 2013 )

d. ¿Por qué los elementos a esterilizar deben estar limpios?

Los materiales deben estar limpios ya que en presencia de grasa el microorganismo es protegido de la acción del calor, además de ello, la materia
orgánica (por ej., sangre, saliva) puede evitar la penetración en hendiduras o articulaciones. El agua residual ocasiona dilución química. (Sanitaria,
2013 )

e. ¿Cómo se podría monitorear la eficiencia del proceso de esterilización por autoclave en materiales y reactivos?

La eficiencia de la esterilización con vapor está relacionada con la rapidez y la eficacia con que se remueve el aire de la cámara. Con el fin de detectar
fallos en la remoción del aire dentro de la cámara se conoce el test de Bowie-Dick, La prueba original constaba de 29 a 36 toallas plegadas en cuyo
centro colocaron una hoja de papel con cinta indicador químico. Esta prueba, correctamente realizada, demuestra el correcto funcionamiento de la etapa
de extracción de aire de la cámara y consecuentemente la buena penetración del vapor.

TEST CORRECTO:
La hoja cambia de color de forma uniforme en toda su extensión. De amarillo a negro.

Cuando se muestra de esta manera se comprende que estuvo suficiente tiempo, adecuada temperatura y una buena calidad de penetración de vapor.

TEST INCORRECTO:
El cambio de color no es uniforme, se repite la prueba una vez más.

Insuficiente extracción de aire y penetración de vapor.

Efecto de la temperatura pero no ha existido ni extracción de aire ni penetración de vapor.

(Sanitaria, 2013 )

f. ¿Qué medidas se deben tener en cuenta en el manejo de cultivos de microorganismos, muestras de sangre y orina?

Manejo de microorganismos.

Se debe identificar el agente biológico, con el nombre científico de la cepa, el número de catálogo de la colección y la forma de presentación (liófilo,
cultivo activo u otras), también se debe identificar la peligrosidad, donde cada microorganismo debe estar clasificado de acuerdo a lo establecido en el
país además de conocer los primeros auxilios, siendo así tener presente que en caso de contacto se debe lavar bien la piel contaminada con jabón
antiséptico y agua abundante. Si se sospecha la contaminación de heridas, o se ha producido una ingestión o inhalación, se deberá buscar
inmediatamente atención médica, y se informará al médico del nombre del microorganismo, en caso donde ocurra un derrame o vertido se debe
descontaminar/esterilizar/autoclavar todo el material de manera inmediata. Finalmente se debe conocer el manejo adecuado para la eliminación del
material, donde todos los recipientes que contienen cultivos deben esterilizarse una vez utilizados. La esterilización se llevará a cabo mediante
tratamiento por calor húmedo en autoclave a 121°C durante 20 minutos. Esto es aplicable también a las batas de laboratorio u otros materiales resistentes
al calor. El material inerte (vidrio, metal) puede ser esterilizado también en estufa de calor seco a 170-180ºC durante 2 horas.

((CECT), 2017)

Manejo de muestras de sangre.

Se debe tener en cuenta la fuente de muestra, donde la zona más idónea para las venopunciones es la fosa antecubital, en la parte anterior del brazo,
frente y bajo el codo, donde se localiza un gran número de venas, relativamente próximas a la superficie de la piel. Por ello para el manejo de muestras
en aspectos generales, se tiene presente: los cuidados y recomendaciones de la toma de muestra, la técnica de recolección, los equipos a usar y el
transporte de dicha muestra, siendo así, para los cuidados y recomendaciones de la toma de muestra, se debe realizar el lavado de manos, el área de
trabajo debe ser estéril para evitar riesgo de contaminación, en pacientes que están recibiendo tratamiento antibiótico recolectar las muestras en botellas
con resina, colocar la muestra en la botella con rótulo específico para cultivo, si se buscan micobacterias es necesario tomar la muestra y colocarla en
heparina, con respecto a la técnica de recolección, generalmente se realiza mediante la extracción de sangre venosa con jeringa y aguja, sin embargo
esta técnica puede ocasionar errores pre-analíticos a pesar de eso es ampliamente usada, por ello al momento de realizar la recolección se debe considerar
en qué tipo de contenedor colocar la sangre ya sea en tubos plásticos o en tubos de vidrio, para los adultos obtener entre 8 a 10 cm3. En cuanto a los
equipos a usar se debe tener la bata, gorro, guantes y jeringas estériles, los frascos para hemocultivos con rótulo específico para hongos. En cuanto al
transporte se recomienda que en los primeros 15 minutos de la recolección deban estar a temperatura ambiente, de 15 días a dos meses hongos
miceliales. (Bogotá, 2008)

Manejo de muestras de orina.

Al igual que con el manejo de muestras de sangre, en las muestras de orina se debe tener en cuenta la fuente de esta, para este cuestionario se manejará
una fuente de micción espontánea. Por ello para esta fuente se tienen las siguientes medidas:

Cuidados y recomendaciones: Realizar higiene de genitales: en mujeres, es necesario lavar el vestí- bulo vaginal y la entrada de la uretra con una
solución jabonosa, enjuagar con abundante agua. Secar y separar los labios e iniciar la micción. En el hombre se debe hacer retracción del prepucio y
lavar el meato urinario con una solución jabonosa, enjuagar con abundante agua y secar. Con el prepucio retraído iniciar la recolección de la orina. En
pacientes ambulatorios es ideal recoger la muestra de la primera micción del día. Para búsqueda de Mycobacterias se realiza la recolección de la misma
manera, se realiza cultivo pero no se realiza baciloscopia por la baja especificidad.

Técnica de recolección: Se debe instruir al paciente para que inicie la micción, desechar la primera parte de la orina, introducir el frasco colector,
recoger la parte media de la orina sin detener el flujo urinario (5-10 cm3) y terminar de eliminar en el sanitario. Tapar el frasco sin contaminar la
muestra.

Equipo: Frasco recolector estéril de boca ancha de tapa rosca y equipo de higiene: jabón, gasas.

Transporte: Se recomienda en los primeros 15 minutos de la recolección, no exceder de dos horas y a temperatura ambiente.

(Bogotá, 2008)

g. ¿Cuáles estrategias puede utilizar con los materiales existentes en la Universidad Distrital si tiene superficies, material e instrumentos
contaminados?

La Universidad Distrital Francisco José de Caldas, cuenta con dos autoclaves lo cual y por un lado permite la esterilización del material mediante calor
húmedo, también se podría realizar mediante agentes químicos para desinfectar el material contaminado y por ello la universidad cuenta con diversos
reactivos que permiten que se dé, en la siguiente tabla se encuentran los reactivos que son usados como antisépticos, desinfectantes y/o preservativos.

REACTIVOS DESCRIPCIÓN USOS PRESERVATIVOS

Compuestos Activos contra bacterias vegetativas pero inactivos
fenólicos contra esporas. Son fungicidas y también virucidas.
Actúan por desnaturalización de las proteínas y dañan
las membranas celulares. El. Fenol, cresol,
hexaclorofeno, etc.
Alcoholes Desnaturalizan las proteínas, actúan también
disolviendo los lípidos por lo que pueden dañar las
membranas celulares. Activos contra bacterias
vegetativas pero no sobre esporas. Ej.: Alcohol etílico,
alcohol isopropílico.
Halógenos Yodo: Altamente efectivo como agente bactericida y
es el único que es efectivo contra todos los tipos de
bacterias.También posee cierta actividad esporocida.
Es un agente oxidante débil, su acción antimicrobiana
parece ser debida a la combinación del yodo molecular
con proteínas celulares.
Cloro: Mata a la mayoría de las células vegetativas,
algunos virus y hongos. Actúa por oxidación de los
componentes celulares.
Desinfectantes, los menos irritantes se Fenol al 0,5%
usan como antisépticos. Cresol al 0,3%
Antiséptico de la piel, desinfectantes. Se Clorobutanol al 0,5%
usan en solución al 70-80% en agua. Alcohol bencílico al 2%
Yodo: Se usa como antiséptico en solución
hidroalcohólica al 2% (tintura de yodo).
También se usa en forma de yodóforos,
que son mezclas de yodo con agentes
tensoactivos que liberan el yodo cuando se
diluyen en agua.
Cloro: Desinfección de agua. Las
soluciones de hipoclorito se usan para
desinfectar objetos y superficies.

h. ¿Qué principio se da al descontaminar por segunda vez agua autoclavada con rayos U.V?

A diferencia de los métodos químicos de desinfección de aguas, la radiación UV proporciona una inactivación rápida y eficiente de los microorganismos
mediante un proceso físico. Cuando las bacterias, los virus y los protozoos se exponen a las longitudes de onda germicidas de la luz UV, se vuelven
incapaces de reproducirse e infectar. Se ha demostrado que la luz UV es eficaz frente a microorganismos patógenos, como los causantes del cólera,
polio, fiebre tifoidea, la hepatitis y otras enfermedades bacterianas, víricas y parasitarias.

Los microorganismos se desactivan por medio de la luz UV como resultado del daño a los ácidos nucleicos. El ADN y el ARN celular absorben la
energía alta asociada con la energía UV de longitud de onda corta, principalmente a 254 nm. Esta absorción de energía UV forma nuevos enlaces entre
nucleótidos adyacentes creando dobles enlaces o dímeros.

La dimerización de las moléculas adyacentes, especialmente de las timinas, constituye el daño fotoquímico más frecuente. La formación de numerosos
dímeros de timina en el ADN de bacterias y virus impide la replicación y la capacidad de infectar.

i. ¿Cuáles condiciones utilizaría si tiene para esterilizar: un instrumento metálico, vidrio y plástico por calor seco?

La esterilización por calor seco produce la destrucción de los microorganismos por oxidación de sus componentes celulares. Éste es un proceso menos
eficiente que la esterilización por calor húmedo, porque los microorganismos mueren con mayor rapidez cuando se encuentran en presencia de agua,
ya que éste permite que se altere con mayor facilidad la configuración de sus proteínas y proporciona un medio para distribuir el calor uniformemente
en toda la cámara interna del equipo de esterilización. Por esta razón, para lograr la esterilización del material empleando el calor seco, se deben aplicar
temperaturas más altas durante mayor tiempo.
La esterilización por calor seco se puede realizar por varios métodos, como aire caliente, llama directa, incineración, siendo así para instrumentos de
vidrio y metal (acero inoxidable, niquelados, cromados), se usa el aire caliente, donde el material se expone a temperaturas de aproximadamente 170°C
durante 2 horas. El tiempo de esterilización se debe determinar para cada tipo de material, por ejemplo en el caso de materiales muy resistentes al calor,
se pueden usar temperaturas más altas por tiempos más cortos. Los materias de plástico no pueden esterilizarse por calor seco, estos deben realizarse
por calor húmedo o vapor de agua.

j. ¿Cómo podría descontaminar una solución con bromuro de etidio?

El bromuro de etidio es un sólido rojo, un potente mutagénico de efecto acumulativo, es nocivo por ingestión, tóxico por inhalación e irritante para los
ojos, la piel y las vías respiratorias; debe ser manipulado única y exclusivamente por personal capacitado.

Preparación de la disolución de descontaminación antes de su uso:

Reactivos: Nitrito de sodio (NaNO2), Ácido hipofosforoso (H3PO2).

Procedimiento: Disolver en un frasco de vidrio 4,2 g de NaNO2 en 20 mL de H3PO2 al 50% y enrazarlo con 300 mL de agua destilada. Verificar el pH
el cual debe ser de 1,8. El volumen a preparar depende del tamaño de la superficie a descontaminar.

Lavar cinco veces las superficies con paños humedecidos con la solución de descontaminación. Utilizar un paño diferente cada vez que se realice el
lavado.

Remojar por aproximadamente una hora cada uno de los paños utilizados en un recipiente conteniendo solución de descontaminación. Exprimir los
trapos para extraer la solución sobrante.

Comprobar que no quedan restos de la presencia de EtBr en los paños y en las superficies afectadas utilizando una lámpara de luz ultra violeta. Repita
el procedimiento de descontaminación cuanto sea necesario.

k. ¿Cómo podría eliminar parásitos, hongos y bacterias? Existen diferentes métodos de esterilización acorde a los diversos patógenos tales como
parásitos, hongos, bacterias y otros contaminantes, de igual forma responden a un catálogo de materiales objetivo, sin embargo no todos pueden ser
usados discriminadamente para cualquier material sea de vidrio, plástico u otro. Para la eliminación general de alguna de estos microorganismos se
puede realizar mediante esterilizaciones por calor seco o por vapor de agua, sin embargo para situaciones específicas se puede realizar la esterilización
con sustancias químicas. A continuación se describirán los métodos con sus características correspondientes al patógeno objetivo y el catálogo de
materiales y a situaciones específicas.

La esterilización por calor seco se realiza a alta temperatura y con tiempos de exposición prolongados en estufas metálicas denominadas Poupinelle.
Este tipo de esterilización es útil para diversos tipos de microorganismos dado el uso de calor provoca la desnaturalización de proteínas, fusión y
desorganización de las membranas conjunto a ello procesos oxidantes irreversibles que concluyen en su muerte. Sin embargo no es apto para materiales
termosensibles tales como gomas, plásticos, o materiales textiles. (Bascaran & Fernandez, 2004)

La esterilización por vapor de agua se realiza mediante autoclaves que genera vapor de agua a través de resistencias, el cual genera calor húmedo que
produce la desnaturalización y coagulación de las proteínas de microorganismos. Lo anterior generado por la alta reactividad de las moléculas de agua
y el elevado coeficiente de transferencia de calor.

Entre los medios de esterilización a través de sustancias químicas, se pueden encontrar el uso de óxido de etileno el cual actúa por medio de la
alquilación de proteínas y enzimas de virus, esporas o bacterias, sin embargo tiene un tiempo de espera para el uso de materiales bastante largo y no es
apto para líquidos o textiles; el uso de peróxido de hidrogeno apto para materiales termosensibles, el cual actúa mediante la oxidación de proteínas
celulares de los organismos, sin embargo se inactiva en presencia de humedad y no elimina priones; y finalmente entre diversos métodos se encuentra
el uso de autoclaves con formaldehido que actúa por alquilación el cual permite la destrucción de bacterias, hongos microscópicos y virus. (Eulufi &
Veliz, 2014)

l. ¿Cuáles son los niveles de bioseguridad en los laboratorios? Se entiende por nivel de seguridad (Biosafety Level, BSL) las condiciones bajo las
cuales los agentes biológicos pueden comúnmente manipularse de forma segura. Se describen cuatro niveles de bioseguridad según las combinaciones
de prácticas y técnicas de laboratorio, equipos de seguridad e instalaciones. Cada combinación es específicamente apropiada para las operaciones
llevadas a cabo, las vías de transmisión documentadas o sospechadas de los agentes infecciosos, y la función o la actividad de la instalación.

Cada nivel de bioseguridad tiene barreras establecidas para ofrecer protección contra los microorganismos. Las barreras primarias son barreras físicas
o equipos de protección personal entre el trabajador del laboratorio y el patógeno, como por ejemplo guantes, máscaras o aparatos respiratorios
especiales. Los laboratoristas usan estos tipos de equipos de seguridad para protegerse directamente al trabajar con organismos. Las barreras secundarias
son aspectos estructurales del laboratorio que hacen que el ambiente de trabajo sea más seguro frente al riesgo de infección. Estas incluyen lavamanos,
áreas de contención especiales para trabajar directamente con los organismos, y patrones especiales de ventilación diseñados para prevenir la
contaminación de otras salas y otros trabajadores en el edificio.

Nivel de Bioseguridad 1 (BSL-1): Los agentes del nivel de Bioseguridad 1 no representan una amenaza para la salud humana; esto quiere decir que
aparentemente no causan enfermedad en adultos saludables.

Para este nivel sólo se requieren prácticas estandarizadas de trabajo en laboratorio. Estas prácticas estandarizadas incluyen:

 Lavado frecuente de manos, especialmente después de quitarse los guantes y antes de salir del laboratorio.
 No fumar, comer, beber, o almacenar alimentos en el laboratorio.
  Cuidado para minimizar salpicaduras y acciones que pudieran crear aerosoles (gotas minúsculas).
 Descontaminación de superficies de trabajo después de cada uso y después de cualquier derrame.
 Descontaminación de desechos del laboratorio.
 Uso de pipetas mecánicas (no usar la pipeta por medio de succión oral).
 Tener precauciones al usar objetos punzantes, lo que incluye el uso de contenedores especiales para desecho de agujas y otros objetos
punzantes.
 Mantenimiento de un programa de control de insectos y roedores.

Uso de equipo de protección personal (tales como batas de laboratorio, guantes de látex, y protección para los ojos o máscaras para el rostro, según sea
necesario dependiendo del tipo de trabajo que se realice).

Nivel de Bioseguridad 2 (BSL-2): Los agente asociados con enfermedades humanas se estudian en laboratorios BSL-2. Un laboratorio BSL-2 se
requiere generalmente para trabajar con cualquier derivado de sangre humana, otros fluidos corporales (especialmente cuando estén visiblemente
contaminados con sangre) o tejidos en los cuales la presencia de un agente infeccioso puede ser desconocida. Al trabajar con agentes BSL-2, los
principales peligros para el personal son pinchaduras accidentales con agujas, infección potencial mediante exposición a los ojos y nariz (membranas
mucosas) e ingestión de materiales infecciosos.

Los agentes BSL-2 no causan infecciones mortales y no son transmitidos por el aire. Esto significa que no causan infección si gotas minúsculas del
material se transmiten por aire y son inhaladas, lo que podría ocurrir si el material genera salpicaduras. Además, los agentes estudiados en un laboratorio
BSL-2 son patógenos para los cuales hay inmunización o tratamiento antibiótico disponible. Sin embargo, se debe tener extremo cuidado con las agujas
e instrumentos punzantes cuando éstos están contaminados con estos agentes.

Algunas barreras primarias en laboratorios BSL-2 son gabinetes de bioseguridad u otros aparatos de almacenamiento aprobados. Estas áreas minimizan
una contaminación potencial mientras se trabaja con un agente, especialmente si hay derramamiento o aerosolización de materiales infecciosos. El
equipo protector para el personal incluye batas de laboratorio, guantes y protección para la cara según se necesite al trabajar con agentes infecciosos.
El personal debe despojarse de la ropa protectora cuando abandona el área del laboratorio.

Nivel de Bioseguridad 3 (BSL-3): Un laboratorio BSL-3 debe utilizarse cuando el trabajo de laboratorio se realiza con agentes nativos o exóticos que
tienen potencial de ser transmitidos por vía respiratoria (aerosol) y que pueden causar infecciones serias y potencialmente letales. Los materiales
potencialmente infectados con estos agentes pueden ser estudiados a nivel de BSL-2 sólo para efectos de diagnóstico, pero la manipulación y
experimentación posteriores requieren de condiciones BSL-3.

Las prácticas de laboratorio establecidas que deben llevarse a cabo en laboratorios BSL-3 incluyen todas las prácticas BSL-2, más:

 Acceso al laboratorio estrictamente controlado.

 Entrenamiento específico para el personal de laboratorio, en el manejo de agentes potencialmente letales.
 Descontaminación de todos los desechos.
 Cambio de ropas de protección de laboratorio y descontaminación de toda la ropa de laboratorio antes de su lavado.

Las barreras protectoras primarias y secundarias en el laboratorio BSL-3 hacen énfasis en la protección del personal de laboratorio, así como también
de personal en áreas cercanas, la comunidad y el medio ambiente, frente a aerosoles potencialmente infecciosos. Las barreras primarias son similares
al equipamiento protector personal de BSL-2, pero pueden también incluir equipo respiratorio si existe riesgo de infección a través de inhalación. Las
barreras secundarias en laboratorios BSL-3 incluyen las barreras de BSL-2 además de algunas otras barreras un poco más sofisticadas. Los corredores
deben estar separados del acceso directo al laboratorio. El acceso debe ser a través de puertas dobles que se cierren solas. Los sistemas de aire deben
estar diseñados para asegurar que el flujo de aire negativo, para que el aire alrededor de puertas y ventanas fluya hacia el laboratorio en lugar de hacia
fuera del laboratorio. El aire bombeado hacia el interior del laboratorio no recircula al interior del edificio. Esta medida evita que se lleven aerosoles
infecciosos fuera del laboratorio a través del aire.

Nivel de Bioseguridad 4 (BSL-4): Agentes peligrosos y exóticos que poseen un alto riesgo de infección y riesgosos para la vida, y agentes infecciosos
de transmisión por vía aérea se encuentran en laboratorios BSL-4. También se estudian en estos laboratorios agentes relacionados con riesgo de
transmisión desconocido. Estos agentes suponen un alto riesgo de enfermedad mortal, pueden ser transmitidas por vía aerosol (respiratoria) y no tienen
vacuna o terapia disponible.

El personal que trabaja con agentes BSL-4 puede estar en riesgo de exposición a aerosoles infecciosos, exposición de membranas mucosas a gotas
infecciosas, y pinchazos accidentales con agujas u otros objetos punzantes contaminados con material infeccioso. Debido a estos riesgos, todo el
personal del laboratorio debe recibir entrenamiento especializado para el manejo de agentes infecciosos extremadamente peligrosos y en el
funcionamiento de los equipos de contención. Además, el acceso al laboratorio está restringido. Las personas con compromiso inmunológico
(incluyendo niños y mujeres embarazadas) jamás son admitidas al interior del laboratorio. Las prácticas de laboratorio para el BSL-4 incluyen todas
las prácticas de BSL-3, más:

 Acceso estrictamente controlado al laboratorio.

 Cambio de ropa antes de entrar y salir del laboratorio (se recomienda ducharse al salir del laboratorio).
 Descontaminar todo el material al salir del lugar.

Las barreras primarias incluyen la realización de procedimientos en gabinetes de bioseguridad usados en los otros niveles de bioseguridad en
combinación con un traje que cubre todo el cuerpo, con oxígeno y presión positiva. Así, los trabajadores de laboratorios de BSL-4 no entran al
laboratorio a menos que estén usando un “traje espacial.”
m. ¿Qué condiciones de bioseguridad necesitaría para trabajar con el material genético de los virus Ébola, dengue hemorrágico y HIV? El
virus del ébola está clasificado como un patógeno de riesgo grupo 4 de tal forma que las acciones en el manejo del material genético se realizan
mediante un protocolo de bioseguridad equivalente (BSL-4), el cual advierte que es necesario el entrenamiento en el uso de equipo de protección
(guantes dobles, bata larga impermeable de manga larga con elástico, gafas protectoras y mascarilla) para la toma y manipulación de la muestra
conjunto a experiencia previa en el manejo de patógenos humanos y cultivos celulares.
El lugar donde se hace la extracción de la muestra debe cumplir con ser una infraestructura bien ventilada, posterior a la toma de la muestra se debe
desinfectar las superficies externas del recipiente y del mobiliario, por otro lado en la manipulación de la muestra se debe evitar técnicas que generen
vapores o aerosoles de la misma tales como el pipetear y centrifugar.

Una vez realizada la manipulación de la muestra y terminado el diagnostico todo implemento y el material requerido en el área debe entregarse a través
de un autoclave de doble puerta, cámara de fumigación o cámara bajo presión y cerrar muy bien todas las puertas una vez se ha retirado el material,
finalmente el operador debe retirarse la ropa la cual debe ser autoclavada antes de ser enviada a la lavandería. (Johnson, 2007)

El dengue hemorrágico está clasificado como un patógeno de riesgo grupo 3 dado que puede transmitirse mediante aerosoles, por lo tanto la
manipulación de este en cualquier forma responde al protocolo de bioseguridad tipo 3 (BSL-3) el cual especifica que es necesario llevar ropa protectora
apropiada (bata sin abertura delantera, gorros, protección para el calzado o calzado especial).

En relación a la infraestructura las puertas de acceso al laboratorio deben ser de cierre automático, las superficies de las paredes, suelos y techos deben
ser impermeables y fáciles de limpiar, los sistemas de conducción de aire han de estar construidos de modo que sea factible la descontaminación con
gases.

En relación a los materiales de laboratorio se debe tener en cuenta que si se utilizan aparatos como centrifugadoras, estas necesitarán accesorios de
contención suplementarios como rotores de contención de igual forma alguna de ellas necesitaran sistemas suplementarios de ventilación. Finalmente
una vez concluido las acciones en el laboratorio se debe realizar la esterilización del material y el equipo de protección de la misma forma que en BSL-
4. (OMS, 2005)

EL VIH corresponde a una enfermedad profesional de bajo riesgo sin embargo se debe realizar y llevar un manual de bioseguridad bastante estricto,
iniciando por el uso del equipo de protección (guantes, bata, mascarilla) a lo largo de todo el procesamiento de las muestras. Al finalizarse la
manipulación los materiales descartables tales como las agujas y jeringas utilizadas se descartaran colocándolas en un envase de plástico rígido que
deberá contener cloro al 10% hasta un tercio de su altura. Se dejara en contacto de 18 a 24 horas para luego descartar la solución de cloro y se descarta
el material en un envase cerrado rígido y etiquetado como “MATERIAL CONTAMINADO” y el operador deberá higienizarse las manos con agua y
jabón antes de abandonar el laboratorio.

En caso de contaminación accidental de un área expuesta de la piel se deberá lavar primero con un detergente antimicrobiano la zona afectada, enjuagar
abundantemente con agua y aplicar una solución de cloro 1/10 dejando en contacto por lo menos un minuto. Posteriormente se realiza el lavado con
detergente y agua. (Valle & Martínez, 2007)
INTRODUCCION deformarse para atravesar sangre depende del
espacios estrechos. equilibrio entre formación
La sangre es un vehículo líquido encargado de la comunicación entre y destrucción.
los tejidos del organismo. Está compuesta por dos partes Su principal función es Son las unidades móviles
fundamentales: el plasma y el suero. Estas dos partes tienen transportar la del sistema de protección
composiciones diferentes, el plasma, es la parte liquida de la sangre, hemoglobina, por lo tanto, (o sistema inmune) del
en la cual se encuentras las células sanguíneas suspendidas, llevan oxígeno y recogen cuerpo humano.
generalmente es un líquido amarillento que está constituido por un dióxido de carbono.
95% de agua y el porcentaje restante por diversas sustancias como La hemoglobina (Hb) es Hay dos tipos
iones, pequeñas moléculas orgánicas y proteínas plasmáticas la responsable del color principales de glóbulos
(Fibrinógeno). El suero, es la parte no coagulada o el líquido rojo de la sangre y es la blancos: células que
sobrenadante que queda en la sangre total cuando esta se coagula. principal proteína de los ingieren gérmenes
(Reiriz Palacios, 2013) eritrocitos. (neutrófilos y
Al hacer referencia a las células sanguíneas, se evidencian dos tipos: Monocitos) y linfocitos
Células blancas y células rojas. En la tabla 1, se muestra la diferencia que combaten las
entre este tipo de células que componen la sangre. infecciones.
Tabla 1. Diferencias entre células rojas y células blancas (lls, 2014; Conteo de glóbulos rojos Conteo de glóbulos
Reiriz Palacios, 2013): (RBC, por sus siglas en blancos (WBC, por sus
Células Rojas Células Blancas inglés) siglas en inglés)
Los glóbulos rojos o Los glóbulos blancos o Hombres: de 4.5 a 6
eritrocitos o hematíes son leucocitos. son un millones de glóbulos rojos De 4,500 a 11,000
el tipo de célula más conjunto heterogéneo de por microlitro glóbulos blancos por
numerosa de la sangre ya células de color blanco de sangre microlitro de sangre
que constituyen el 99% de Mujeres: de 4 a 5 millones
los elementos formes de la de glóbulos rojos por
sangre. microlitro
Como tal no son células Los leucocitos son células de sangre
ya que no poseen Núcleo. sanguíneas verdaderas,
puesto que tienen núcleo Para el uso de la técnica PCR (por sus siglas en inglés Polymerase
Tienen forma de discos La formación y Chain Reaction o Reacción en Cadena de la Polimerasa) es necesario
bicóncavos, son finos y destrucción de los realizar una previa extracción del ADN, al cual se le realiza una serie
sensibles y pueden leucocitos es continua y de procedimientos para finalmente sintetizar muchas veces un pedazo
su concentración en la o fragmento de ADN utilizando una polimerasa que puede trabajar a
temperaturas muy elevadas. Para su tratamiento o extracción se deben
utilizar una serie de reactivos capaces de anti coagular la sangre para
lo cual se puede hacer uso de la heparina o el EDTA (Espinosa Asuar,
2003). La heparina actúa formando un complejo con la antitrombina
III en la sangre que inhibe este proceso en la sangre. (Ramos Sevillano,
2009). Esto produce un cambio conformacional que aumenta la
capacidad inhibitoria de la enzima sobre los factores de coagulación;
para que la inactivación de la Trombina sea acelerada se necesita un
complejo terciario de ATIII+ heparina + trombina. (Trejo, 2004).
El EDTA funciona como anticoagulante extrayendo el calcio de la
sangre. Evita la agregación plaquetaria y se utiliza para el recuento
plaquetario. No afecta la morfología de las células hemáticas y
tampoco modifica la velocidad de sedimentación globular. Se utiliza a
una concentración 1 mg por 1 .c. de sangre o 0.5 ml de solución al 1 %
para 5 ml de sangre. ( Laboratorios Albeitar, 2011). Sin embargo, en
exceso el EDTA puede generar dificultades en el análisis de la muestra
por PCR, teniendo en cuenta que este utiliza magnesio un cofactor del
ADN el cual se atraería con el reactivo por su efecto quelatante
produciendo así una disminución de magnesio libre, y reduciendo a su
vez la actividad enzimática de la PCR. (Microbial SL, 2015)
Siguiendo con el procedimiento de extracción se utilizan distintos
reactivos para el tratamiento de la muestra con el fin de obtener el ADN
puro, para lo cual se utiliza una lisis de glóbulos rojos y una lisis de
glóbulos blancos. En el caso de la lisis de glóbulos rojos y glóbulos
blancos se encuentran compuestas por un tris de HCl con un pH 7.6 el
cual se encarga de mantener el pH sin importar las condiciones, debido
a que este es uno de los factores que se debe controlar, además este
genera una interacción con el liposacarido (LPS) de la membrana,
logrando desestabilizar aún más la membrana para su lisis. Las sales
de MgCl2 y NaCl se utilizan como aumentadoras de la presión
osmótica para que la célula sufra una lisis (rompimiento) en su
membrana. En el lisis de blancos se utiliza el EDTA como un agente
quelatante del Ca y Mg como se había mencionado anteriormente. Por
último el SDS (Dodecilsulfato sódico) el cual funciona como un
tensioactivo anionico, el cual permite eliminar por completo la
membrana de las células. (WORLD HEALTH ORGANIZATION,
2003)
La proteinasa K es una proteína desnaturalizante utilizada para inhibir
la degradación enzimática de los ácidos nucleicos durante el
aislamiento. Esta rompe enlaces de péptidos en los lados carboxílicos
de aminoácidos alifáticos, aromáticos o hidrofóbicos. La proteinasa K
se clasifica como proteasa de la Serina. Presenta una actividad óptima
en 50-55 °C, y es estimulada por SDS, urea o algún agente quelante
como el EDTA. Este procedimiento de rompimiento es necesario
realizarlo antes de la extracción del ADN, ya que esta digiere las
proteínas e inactiva rápidamente las nucleasas que de otro modo
podrían degradar el ADN o ARN durante la purificación de una
muestra. Esta proteinasa K también es utilizada para la destrucción de
las proteínas en los lisados celulares como tejidos celulares y para la
liberación de ácidos nucleicos, ya que inactiva DNAsas y RNAsas. En
la extracción de ADN se separan los leucocitos (glóbulos blancos) y se
lisan con una solución que contiene el detergente dodecisulfato de
sodio (SDS) y la proteinasa K, y esta proteasa libera el DNA nuclear
al medio y digiere las proteínas. (Hilz H., 1975).
La incubación del ADN se realiza a temperaturas altas (42°C), para
evitar la formación de dímeros de cebadores, estas incubaciones
facilitan la ruptura de lípidos en la membrana celular, permitiendo la
liberación del ADN de la estructura celular. La temperatura de
incubación no puede ser mayor a los 80°C, ya que a esta temperatura
se comienza a degradar el ADN. (Falcón Luisa, 2004).
El Chelex es una resina copolímero de estireno-divinilbenceno que
contiene iones iminodiacetato, que actúan como grupos quelantes en
la unión de iones metálicos polivalentes, presenta altas selectividades
para iones metálicos. El efecto de esta sustancia es prevenir a través de
su acción quelante la ruptura del ADN a altas temperaturas catalizada
por los iones involucrados en las muestras de trabajo. El Chelex
protege la muestra desde DNAasas que no hayan quedado activas
después de la ebullición y evitar la destrucción del ADN. Estas
DNAasas son enzimas que se producen de forma natural en todos los
tejidos del cuerpo y cortan el ADN en pequeños fragmentos, lo que
hace que sea inadecuado para PCR. Los iones de magnesio son
cofactores escenciales para DNAasas, por esto la resina se une con
estos iones, haciendo inoperables las DNAsas y protegiendo el ADN
de su acción. (Armas Yaxsier, 2006)
El método Chelex, usa una resina quelante del mismo nombre, chelex-
100, para obtención de ADN, donde este se extrae en ADN quelante
en bloques de parafina, esto último para reducir la posibilidad de
inserciones de contaminantes dando como resultado una extracción
rápida. Se da paso a una interacción divalente de los iones magnesio,
que provoca una carga parcial negativa de los iones fosfatos y a su vez
generando la repulsión y por tanto las cadenas sencillas de ADN
(Jove.com).
La desnaturalización del ADN se da por el rompimiento de puentes
hidrogeno de las bases nitrogenadas, de las cuales, dependiendo el
número de enlaces existentes requerirá un aumento o disminución de
la energía, esto se ve evidenciado en el aumento de la temperatura de
la muestras de sangre total, en donde se obtiene el ADN ds (double
strand). Por el contrario al usar el método de Chelex en las muestras
de mancha y sangre total, se obtendrá la ADN ss (single strand). Cabe
resaltar que al disminuir la temperatura, las interacciones entre las
bases nitrogenadas se generaran de nuevo, formando los puentes de
hidrogeno, y por tanto la cadena doble, lo que no se puede en el caso
de aplicar el método Chelex. Por consecuente el procedimiento de
muestra total de sangre generara el ADN de cadena doble y las
muestras tratadas por Chelex, darán como resultado un ADN de cadena
sencilla.
Para diferenciar si la sangre procede de un ser humano, se usa la prueba
de la preciptina, inyectando un animal de laboratorio (comúnmente es
el conejo) con sangre humana, creando anticuerpos en la sangre del
animal en reacción a la infección. Posteriormente, se extraer los
anticuerpos del animal y se aplican a la mancha de sangre. En caso de
que se forme el coagulo, la mancha es de origen humano.
Un alto número de casos que atienden los laboratorios forenses incluye
componentes relacionados con delito sexual. La identificación de
espermatozoides se hace por medio de métodos de extracción y
coloración de contraste. Para la extracción se corta un fragmento de la
evidencia, previamente observado que contenga el fluido y, se
mantiene en agua destilada para que el material biológico sea extraído,
posteriormente se centrifuga para concentrar el material celular de esta
mezcla y se realizan las láminas que posteriormente van a ser
coloreadas y observadas en el microscopio. Por su parte, la coloración
que se realiza se llama Árbol de Navidad, es una tinción de contraste
que utiliza dos colorantes que, por sus propiedades químicas y afinidad
por las células, permite colorear las cabezas de los espermatozoides de
un color rojo brillante no uniforme y el resto de la célula de color verde,
logrando con esto, bajo observación al microscopio, identificar los
espermatozoides por su color y su forma. (sinca.mma.gob.cl)
Al colocar los glóbulos blancos y rojos en una solución hipotónica
(lisis de rojos), los segundos se lisan mientras los primeros permanecen
intactos (Contreras, 2017).
La proteinasa K es una proteasa endolítica, de amplio espectro
ampliamente utilizada para la digestión de proteínas en preparaciones
de ácidos nucleicos. Degrada proteínas incluso en presencia de
detergentes. La proteinasa K separa los enlaces peptídicos en los lados
carboxílicos de los aminoácidos alifáticos, aromáticos o hidrófobos.
La proteinasa K se clasifica como serina proteasa. El péptido más
pequeño a ser hidrolizado por esta enzima es un tetrapéptido
(Thermofischer, 2017).
METODOLOGIA
Para la extracción de ADN se siguieron las guías de Extracción de
ADN sangre total y manchas (Ayala, 2015).
RESULTADOS
En la tabla 2 se muestran los datos tomados para la concentración de
ADN por mililitro de sangre, y realizar el conteo de glóbulos blancos.
Tabla 2. Volumen total de sangre para cuantificación por número de
leucocitos y rango de leucocitos para conteo.
 Volumen de Sangre 4,5ml  Peso de células blancas en ADN ds
Leucocitos por ml de 11 ∗ 106
sangre 12 𝑝𝑔
4,95 𝑥 107 𝑐𝑒𝑙 ( )
𝑐𝑒𝑙

Se toma como valor referencial 11*106globulos blancos por mililitro 1𝑚𝑔

de sangre para realizar el conteo, esto teniendo en cuenta que el rango = 5,94 𝑥108 𝑝𝑔 ( )
va desde 4,5*106 hasta 11*106 glóbulos blancos por mililitro de sangre. 1 𝑥109 𝑝𝑔
Y se toma como valor 12 pg para una célula 2n. A partir de esto se
realizaron los siguientes cálculos. = 0,594 𝑚𝑔 𝐴𝐷𝑁
Cálculos  Concentración de células blancas en ADN ds por mililitro de
Concentración de ADN, cuantificación por cantidad de leucocitos sangre
 Cantidad de células por ml de sangre 0.594 𝑚𝑔 𝐴𝐷𝑁
𝐶=
11𝑥106 𝑐𝑒𝑙 4,5 𝑚𝑙
4,5𝑚𝑙 𝑆𝑎𝑛𝑔𝑟𝑒 =𝑋
1𝑚𝑙 𝑆𝑎𝑛𝑔𝑟𝑒 𝑚𝑔 𝐴𝐷𝑁
7
𝑋 = 4,95 𝑥10 𝑐𝑒𝑙 𝐶 = 0,00132
𝑚𝑙
𝜇𝑔
= 0,00132
µ𝐿
RESULTADOS

En la tabla 1 se presenta la cuantificación de ADN y Oligonucleótidos en Sangre total y mancha.

DNA μg/µL
cuantificaci
extracción

Tipo ADN

% Pureza
Protocolo
Fecha de

Fecha de

Relación

Proteína
Dilución
Muestra

mg/mL
230nm

260nm

280nm

330nm

Factor
Grupo

Tipo

ón

Sangre Saltin
1 15/08/2017 22/08/17 ds 2,339 2,963 2,257 0,894 1,518 0,31 - - 84,3 1,621
Total Out

4
2 Mancha 15/08/2017 22/08/17 Chelex ss 1,829 0,952 1,007 0,817 0,711 0,00 - - 39,5 0,295

3 Hisopo 15/08/2017 22/08/17 Chelex ss 3,104 1,456 1,536 1,143 0,796 0,01 - - 44,2 0,371

Cálculos Relación
𝐴260 0,135
= = 0,71
 Sangre Total ADN ds 𝐴280 0,19
𝐴260 = 2,963 − 0.894 = 2,069
𝐴280 = 2,257 − 0.894 = 1,363 Pureza
0,71
Relación (ratio) 𝑃𝑢𝑟𝑒𝑧𝑎 = ∗ 100 = 39,44
1.8
𝐴260 2,069
= = 1,518
𝐴280 1,363 Concentración
Pureza 𝜇𝑔
𝐴𝐷𝑁𝑑𝑠 = 0,135 ∗ 0.033
𝜇𝐿
1,518 𝜇𝑔
𝑃𝑢𝑟𝑒𝑧𝑎 = ∗ 100% = 84,331% 𝐴𝐷𝑁𝑑𝑠 = 0,0179
1,8 𝜇𝐿

Concentración Concentración de Proteína

𝜇𝑔 𝐶. 𝑃. = 1.0[1.55(0,19) − 0.76(0,135)]
𝐴𝐷𝑁𝑑𝑠 = 2,069 ∗ 0.05 𝐶. 𝑃. = 0,1919
𝜇𝐿
𝜇𝑔 𝑛𝑔 𝑚𝑔
𝐴𝐷𝑁𝑑𝑠 = 0,10345 = 103,45 = 0,10345
𝜇𝐿 µ𝐿 𝑚𝑙  Hisopo ADN ss
Concentración de Proteína 𝐴260 = 1,456 − 1,143 = 0,313
𝐴280 = 1,536 − 1,143 = 0,393
𝐶. 𝑃. = 1.0[1.55(1,363) − 0.76(2,069)]
𝐶. 𝑃. =0,540 Relación
 Mancha ADN ss 𝐴260 0,313
= = 0,7964
𝐴260 = 0,952 − 0.817 = 0,135 𝐴280 0,393
𝐴280 1,007 − 0,817 = 0,19
Pureza
 0,7964 cuál arroja un resultado de 0,72ng/ 𝜇𝐿, razón por la cual
𝑃𝑢𝑟𝑒𝑧𝑎 = ∗ 100 = 44,24
1.8 el resultado no es el esperado si nos basamos en las
investigaciones realizadas.
Concentración
𝜇𝑔 La eficiencia y ventajas de los métodos de extracción
𝐴𝐷𝑁𝑑𝑠 = 0,313 ∗ 0.033
𝜇𝐿 Saltin out y Chelex, se especifican a continuación:
𝜇𝑔
𝐴𝐷𝑁𝑑𝑠 = 9,484
𝜇𝐿  Saltin out:

Concentración de Proteína El método consiste en separar las moléculas,

𝐶. 𝑃. = 1.0[1.55(0,393) − 0.76(0,313)] proteínas y otros contaminantes a partir de un lisado
𝐶. 𝑃. = 0,371 celular. Éste lisado consiste en la adición de alta
concentraciones de sal, las cuales disminuyen la
solubilidad de las moléculas orgánicas en la fase
 Volumen para obtener 1µg de ADN ds de Sangre acuosa. También es utilizada la proteinasa K, el
Total TRIS HCl para regular el pH con el fin de asegurar
4,5 𝑚𝑙
1𝜇𝑔 = 9,6𝑥10-3ml =9,6 𝜇𝑙 la total inactivación de las enzimas que puedan
465,525𝜇𝑔
interferir sobre el ADN. El precipitado resultante se
separa por centrifugación para luego extraer el
 Volumen para obtener 200ng/µL de ADN ds de ADN de la disolución acuosa mediante la adición
Sangre Total de alcohol por precipitación.
𝑛𝑔 4,5 𝑚𝑙
200 ∗ = 8,7 𝑚𝑙
𝜇𝐿 103,45 𝑛𝑔 Él método es sencillo, pero no eficaz ya que el ADN
𝜇𝑙
obtenido debe ser purificado antes de ser usado en
posteriores aplicaciones. La ventaja del método es
 ADN esperado vs ADN obtenido:
la eliminación del uso de solventes
orgánicos(WAKO, 2017).
En la cuantificación de ADN realizada en el laboratorio
se obtuvo la siguiente concentración de ADN:

Concentración  Chelex: La extracción de ADN por medio del

𝜇𝑔 método chelex, permitió la obtención rápida del
𝐴𝐷𝑁𝑑𝑠 = 2,069 ∗ 0.05 ADN con una mínima manipulación y por lo tanto
𝜇𝐿
𝜇𝑔 𝑛𝑔 𝑚𝑔 evita las posibilidades de introducción de
𝐴𝐷𝑁𝑑𝑠 = 0,10345 = 103,45 = 0,10345 contaminantes en el proceso de purificación.
𝜇𝐿 µ𝐿 𝑚𝑙
Ésta concentración evidentemente no concuerda con la Además, es una metodología menos costosa en
investigación teórica, pues en el artículo: Cuantificación comparación con métodos que emplean reactivos
de ADN libre en plasma sanguíneo de voluntarios sanos caros como proteinasa K y los sistemas
en una población bogotana(Salazar, 2009), se observa comerciales. De igual forma, es una segura pues no
una concentración de ADN libre (ADN ds) en un rango afecta la salud de quien lo realiza, como si lo hace
de 0,464 a 0,72 ng/ 𝜇𝐿 dependiendo del sexo, edad y el método que emplea fenol. Su simplicidad permite
posibles patologías. Se halla una diferencia bastante obtener ADN con la calidad adecuada para
significativa ya que si se realiza la comparación en las amplificación en PCR. Este método brinda una
mismas unidades se observa una concentración opción rápida y menos costosa para obtener ADN,
experimental de 103ng/ 𝜇𝐿 comparado con la teoría la para amplificar fragmentos diana de bajo peso
molecular. Constituyen una opción ventajosa.

1. INTRODUCCIÓN
La proteinasa K es una proteasa (enzima de ruptura de proteínas) altamente activa, aislada del hongo Tritirachium album. La enzima muestra amplia
especificidad de corte en proteínas nativas y desnaturalizadas, esta es capaz de liberar el ADN nuclear al medio y digerir las proteínas presentes [1]. La
resina Chelex 100 es un copolímero de estireno divinilbenceno que contiene iones iminodiacetálicos emparejados, que actúan como grupos quelantes
en la unión de iones metálicos polivalentes. Los grupos de ácido carboxílico de la resina Chelex 100 la clasifican como una resina de intercambio
catiónico débil, pero difiere de otros intercambiadores en esta clase por tener selectividades excepcionalmente altas para iones metálicos y fuerzas de
unión mucho más altas. La resina puede usarse para ultra-purificar tampones y reactivos iónicos: eliminará contaminantes metálicos sin alterar la
concentración de iones no metálicos [2].
1La sangre se encuentra constituida por distintas sustancias dentro de las que se encuentra el plasma siendo este el componente líquido de la sangre que

contiene el suero junto con elementos coagulantes, cuando estos últimos son eliminados, el líquido restante es el suero [3], a continuación, en la tabla
1 se presentan las diferencias y semejanzas entre las células rojas y blancas.
Tabla 1. Cuadro comparativo entre las células sanguíneas [4].
Células rojas Células blancas las células más abundantes en blancos son menos
nuestra sangre representan un 40- abundantes, representan un
También llamados Eritrocitos, son Los leucocitos o glóbulos 45 % del volumen de la sangre 1% del volumen de sangre
 Son más pequeños bicóncava
No poseen Núcleo ni otros
orgánulos
Pueden pasar por los pequeños
vasos capilares. Llevan oxígeno a
los tejidos a cambio del dióxido de
carbono del mismo.
Los glóbulos rojos se desprenden
de la médula ósea
Presentan mayor tamaño Su vida útil es de Su vida útil es de 4 a 30
aproximadamente 120 días. días
Células con núcleo
El recuento bajo de glóbulos rojos El número bajo de glóbulos
Se encargan de producir es sinónimo de anemia blancos (leucopenia) puede
anticuerpos para luchar comprometer las funciones
contra cualquier elemento inmunitarias.
extraño.
Generalmente se mueven en el Andan en el sistema
Se producen en la médula sistema cardiovascular. cardiovascular linfático.
ósea. Sin embargo, pueden
producirse en el bazo, timo
y ganglios linfáticos.

2La extracción de ADN en sangre es un proceso que requiere de distintos pasos y sustancias con diferentes funciones y características, uno de los
compuestos es el EDTA, este funciona como anticoagulante. y a su vez ofrece una protección completa para células de la sangre, especialmente para
la protección de las plaquetas, de modo que puede efectivamente detener la colección de plaquetas en la sangre, El EDTA según su concentración
inhibe la PCR, puede ser completamente o a concentraciones más bajas se presentan diversos grados de inhibición [5], [6]. Por otro lado, La Heparina
es una molécula compuesta por una cadena muy larga de azúcares, que se caracteriza por estar muy sulfatada, es decir, que tiene muchas cargas
negativas, y que contienen una secuencia o fragmento de cinco azúcares capaz de interactuar con las proteínas del sistema de coagulación de la sangre.
Se trata de una sustancia endógena, que significa que se sintetiza por el propio organismo, aunque la función biológica que tiene dentro del organismo
no se conoce. En cambio, cuando se suministra a nivel exógeno, cuando te la inyectan en la sangre, actúa como un anticoagulante [7]. En cuanto la
inhibición del PCR se puede mencionar que la heparina por ser un oligosacárido complejo puede generar una potencial inhibición en el PCR [8]. Para
la extracción de ADN en sangre se hace necesario lisar las células sanguíneas y de esta manera liberar el material genético contenido en algunas de
ellas, para esto se utilizan diversos reactivos como son; 3los buffer de lisis, estos permiten romper las membranas celulares, a través de la extracción de
proteínas solubles [9], liberando así el material intracelular, para el caso de los eritrocitos se utiliza la lisis de rojos, la cual permite liberar la hemoglobina
que es su principal constituyente y para el caso de los leucocitos se utiliza la lisis de blancos la que cual permite liberar los diferentes constituyentes
dentro de los que se encuentra el núcleo y el material genético que allí se contiene, siendo este el de interés en la práctica de extracción de ADN, para
el caso del dodecilsulfato sódico (SDS) actúa rompiendo enlaces no covalentes en las proteínas (desnaturalizándolas) y solubilizando lípidos, manera
en la cual rompe las membranas celulares tanto en eritrocitos como en leucocitos y nucleares es los leucocitos [10]. Para lograr extraer el ADN con
una alta eficiencia, de una muestra de sangre es importante la eliminación de las proteínas que se encuentran en el medio junto con el material genético,
es por ello que es importante el uso de una proteasa, 4la proteinasa K es una proteasa muy activa que tiene como función liberar el ADN nuclear al
medio, digiriendo las proteínas presentes que pueden bajar el nivel de pureza de ADN durante la cuantificación del mismo [11]. La temperatura óptima
para la actividad de esta proteinasa K es de 37°C a una concentración de 0,5 mg/mL [12], pero en general esta proteasa puede trabajar bien a una
temperatura de 50 a 55°C [13] 5sin embargo se propone realizar la incubación del ADN a una temperatura de 42°C, siendo esta la temperatura adecuada
para inhibir ADNasas, las cuales pueden llegar a romper las cadenas de ADN.
Además de las ADNasas también existen otras moléculas capaces de generar rupturas en la doble hélice del ADN, ejemplo de estos son los iones
metálicos polivalentes por lo que el uso de 6Chelex 100, una resina intercambiadora de iones que funciona realizando una limpieza de los iones metálicos
polivalentes, los cuales actúan como catalizadores en la ruptura de ADN a altas temperaturas, inhibiendo con esto el proceso de amplificación en la
PCR. El chelex funciona removiendo cualquier catión presente en una solución atrayéndolos y pegándose a la superficie de los gránulos del chelex.
Este enlaza los iones de Mg, los cuales las nucleasas necesitan para digerir el ADN, protegiendo así que el ADN no sea digerido por la contaminación
de las nucleasas en las células [14]
7En cuanto a las diferentes técnicas o protocolos para la extracción de ADN, se deben tener en cuenta algunos factores como lo son; La cantidad de

muestra de la cual se hará la extracción, el tipo de muestra o fuente de la que se quiere obtener el ADN, la pureza con la que se quiere obtener, el
tiempo que consume cada método, su costo y el rendimiento esperado. Luego de tener en cuenta estos aspectos se puede seleccionar el protocolo
adecuado, dentro de los que se pueden encontrar los siguientes:

Incubación del lisado para su uso; en esta técnica incuba el lisado crudo a temperaturas entre 90 – 100 ºC y luego se usar directamente. Este método
permite obtener un ADN de muy baja pureza y con aplicaciones muy reducidas.
Lisis por ruptura mecánica y extracción con disolventes orgánicos; Este método puede ser usado para extraer ADN de material crudo, liofilizado o
congelado, que puede romperse con un mortero, por congelación-descongelación o usando ultrasonidos. El lisado de células se puede extraer con
cloroformo, alcohol isoamílico o fenol, siendo las proteínas y otros componentes de la célula solubles en el disolvente orgánico.. Este método se puede
usar para moléculas de ADN de alto peso molecular, obteniendo buenos rendimientos de moléculas relativamente puras.
Lisado y purificación con detergente iónico (método de CTAB); Este método es usado para extraer ADN de vegetales, donde un detergente aniónico
puede romper la pared celular y así se produce la lisis de las células.
Método de Salting-out; para este método se usan altas concentraciones de sal lo que hace que disminuya la solubilidad de las moléculas orgánicas en
la fase acuosa. En este método se utiliza frecuentemente la proteinasa K, el TRIS-HCl para regular el pH y otros compuestos que aseguren la total
inactivación de las enzimas que pueden actuar sobre las moléculas de ADN. Para la extracción se utilizan sales inorgánicas como el perclorato de sodio
y el cloruro de sodio en concentraciones muy altas que hacen precipitar a las moléculas orgánicas.
Extracción usando proteinasa K y dodecilsulfato de sodio; esta es una de las técnicas más usadas para la extracción de ADN ya que la digestión de la
muestra se puede realizar con proteinasa K que es activada por el dodecilsulfato de sodio. La proteinasa K inactiva las DNAsas presentes en el lisado
celular usando detergente aniónico el SDS.
Extracción de ADN con yoduro de sodio; se usa el yoduro de sodio como agente caotrópico y este además de provocar la lisis celular rompe la capa de
hidratación que rodea el ADN y logra que las cargas negativas de los grupos fosfatos del ADN queden más expuestas y luego se adicionan detergentes
aniónicos como es el caso del N-lauril sarcosinato de sodio, proteinasa K y/o otros reactivos que permiten separar las proteínas y lípidos contenidos.
8ADN de cadena doble (ADNds) el cual presenta una estructura de doble hélice fue extraído por el método de acetato potasio modificado, y ADN

monocatenario (ADNss) el cual presenta una estructura de cadena sencilla y fue extraído por el método de chelex.

¿Cómo se puede diferenciar entre ADN humano y otra especie animal? El ser humano tiene un genoma compuesto por 2900 millones de pares de bases.
Dentro de ese genoma, contamos con aproximadamente entre 25.000 y 30.000 genes. Los genes son el primer nivel de lo que nos hace ser humanos,
una diferencia no muy grande en el genoma implica una enorme diferencia en cuanto a forma final del organismo

¿Qué se puede cuantificar a una absorbancia de 230nm? a la absorbancia de 230 nm se puede cuantificar la cantidad de contaminantes que pueden
estar presentes durante la extracción del ADN y que pueden tener propiedades de hidratos de carbono, péptidos, fenoles y algunos compuestos
aromáticos

Extracción de ADN

Para estudios de niveles de expresión génica se extraerá ARN, mientras que para la búsqueda de modificaciones o alteraciones
génicas, ADN. Es una técnica minuciosa, que involucra lisis de la célula, separación, purificación, precipitación, lavado y disolución.
debe considerarse el uso de material nuevo, estéril, libre de ADNsas y ARNsas, y el uso de guantes para impedir la degradación de la
muestra con nucleasas provenientes del ambiente (pelo, sudor, saliva, polvo), así como para impedir cualquier contaminación con
ácidos nucleicos exógenos.

Lisis de la célula y liberación de ADN:

 SDS: es un detergente que rompe la membrana celular y nuclear y liberara el ácido nucleico de las células de donde se liberara.
 Cuando la extracción se lleva a cabo a partir de células de sangre periférica, se recomienda el empleo de tubos con ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA) como anticoagulante (EDTA 0.1 M al 0.02% V/V), ya que la heparina interfiere con
enzimas como las polimerasas o las enzimas de restricción, que se emplearán en pasos subsiguientes.
 La lisis de eritrocitos suele realizarse por adición de una solución hipotónica a base de cloruro de amonio.
 El EDTA, secuestra cationes divalentes y, por lo tanto, inactiva las ADNasas.

 El ADN disuelto en la solución acuosa se precipita añadiendo alcohol absoluto (isopropanol o etílico), ya que los ácidos
nucleicos son insolubles en soluciones alcohólicas.
 El botón de ADN obtenido en la precipitación se lava con etanol al 70% por, al menos, dos ocasiones. El contenido de alcohol
de esta solución (70%) mantiene al ADN precipitado, y el H2O (30%) permite la disolución de las sales presentes. Después de
los lavados, se seca el botón, lo que permite la evaporación del alcohol (espontánea o acelerada en un desecador).
 Inmediatamente después de la evaporación del alcohol, el botón de ADN se disuelve en soluciones que aseguren su
preservación, como agua estéril y libre de ADNsas, o bien soluciones amortiguadoras, como el buff er Tris EDTA (TE).

Espectrofotometría – cuantificación del ADN: Los nucleótidos de ADN y ARN presentan la absorción máxima a una longitud de onda de
260 nm (luz ultravioleta, UV); por lo tanto, los espectrofotómetros son los aparatos más utilizados para determinar la concentración
de ácidos nucleicos en solución.

Pureza del ácido nucleico: es prácticamente imposible eliminar la totalidad de las proteínas celulares que acompañan al ADN, así como
solventes u otros componentes orgánicos empleados en la extracción, los cuales se presentan como contaminantes de la solución de
ácido nucleico. Debido a que el espectro de absorción de estas moléculas es característico, la absorción en otras longitudes de onda
de la muestra de ácidos nucleicos se compara con la absorción a 260 nm.

Contaminación por proteínas: La presencia de proteínas hará disminuir este cociente, por lo que si la relación 260÷280 es menor que
1.8 la cantidad de proteína en la muestra es alta y es conveniente realizar un nuevo proceso de extracción. Sin embargo, este índice
no es infalible y puede modificarse si el pH del medio se modifica; la acidez puede hacer disminuir hasta 0.2 a 0.3 unidades el índice,
mientras que la basicidad puede aumentarlo.

PCR
ADN POLIMERASA: la Taq ADN polimerasa. la técnica pudo hacerse más eficiente, pues dicha enzima soporta los 95°C, y la cantidad
inicial de enzima añadida a la reacción es suficiente como para suplementar los 25 a 40 ciclos de amplificación. Esta enzima es capaz
de polimerizar un promedio de 1000 nt/minuto.

ADN MOLDE: Si se quiere amplifi car ARN, antes de la PCR se requiere realizar una reacción previa: la retrotranscripción, que permite
convertir el ARN en ADNc, menos lábil que una cadena de ARN (cabe recordar que la inestabilidad molecular del ARN es elevada por
la presencia del grupo OH en el carbono 2’ de la ribosa).