¿Qué

es el DNA recombinante?

Cualquier molécula de DNA creada

ar2ficialmente que pone juntas secuencias
que no se encuentran así usualmente en la
naturaleza
 Tecnología del DNA recombinante
Se requieren dos elementos clave para
o b t e n e r u n a m o l é c u l a d e D N A
recombinante:

1- Enzimas de restricción
2- Vectores de clonación

 Introducción a las técnicas de
manipulación del DNA: Las enzimas
Nucleasas
Enzimas de restricción
 Supongamos la secuencia reconocida por la endonucleasa
de restricción EcoRI, que es

5’-GAATTC-3’

En un DNA que contenga 30% de A, 30 % de T, 20 % de G y

20 % de C, la probabilidad de encontrar esta secuencia al azar
sería de

0.2 x 0.3 x 0.3 x 0.3 x 0.3 x 0.2 = 0.000324

O lo que es lo mismo, aproximadamente una cada 3086 nucleó2dos

DNA ligasa
 DNA ligasa: Condiciones de ligación
Una reacción de ligación requiere 3 ingredientes (además de agua):
1.  Dos o mas fragmentos de DNA con extremos compa2bles

2.  Un tampon conteniendo ATP. El tampón se prepara concentrado (10X) y

tras la dilución proporciona una concentración de 0,25 a 1 mM.

3.  T4 DNA ligasa. Una reacción 2pica para insertar un fragmento en un

plásmido puede necesitar entre 0,01 (protuberantes solapantes) a 1
(romos) unidades de ligasa

La temperatura óp2ma de incubación es de 16ºC y cuando se desea una

eficiencia alta se requiere esta temperatura. Sin embargo la ligasa es
ac2va en un amplio rango de temperaturas y puede usarse entre 4ºC y
temperatura ambiente, dependiendo del 2po de secuencia a ligar
Adaptadores Sinte2zados Químicamente
DNA Polimerasas: Fragmento Klenow
de la DNA polimerasa I
Fragmento grande : ac2vidad Polimerasa y exonucleasa
3´a 5´

Fragmento pequeño: exonucleasa 5´a 3´

Cataliza la síntesis de DNA doble hebra a par2r de DNA
hebra sencilla en la dirección 5´a 3´

DNA Polimerasas: Fragmento Klenow
 Tecnología del DNA recombinante
Se requieren dos elementos clave para
o b t e n e r u n a m o l é c u l a d e D N A
recombinante:

1- Enzimas de restricción
2- Vectores de clonación

Interconversión de dis2ntas formas
plasmídicas
 Carácterís2cas de los plásmidos

•  Plásmidos conjuga2vos

•  Rango de hospedador

•  Número de copias

•  Mantenimiento estable: regiones par

•  Incompa2bilidad entre plásmidos

Propiedades que un vector bacteriano
debe tener
•  1. Capaz de replicarse:
replicarse de manera autónoma (su propio origen de replicación)
extracromosómico al cromosoma del huésped

•  2. Marcadores de selección:
Normalmente resistencia a an2bió2co en E. coli
Ac2vidad β-galactosidasa

•  3. Si7os de restricción únicos:
Si2o presente sólo una vez en el plásmido
Al linearizar el fragmento puede ser clonado

•  4. Alto número de copias si es posible:
1-50 copias (cuantas más mejor)
pBR322
Visualización de transformantes con
selección blanca/azul

X-Gal
El fago λ
El fago λ: vectores con caracterís2cas
mejoradas
•  Incrementar la capacidad de aceptación DNA
(generalmente por el uso de endonucleasas de
restricción)
•  Métodos de selección posi2va de recombinantes
•  Permi2r preparación de sondas de RNA del
inserto para favorecer el screening de genotecas
•  Desarrollar vectores para la inserción de cDNA
eucarió2co en forma de un polipép2do de fusión
con B-galactosidasa y poder hacer screening con
an2cuerpos
El fago λ: Vectores de clonación de la
serie EMBL
Fásmidos
Cósmidos

•  Vectores híbridos entre plásmidos y el

fago lambda

•  Se puede replicar en la bacteria como

un plásmido y empaquetar como un
virus

•  Pueden insertarse fragmentos de DNA

de 35 y 45 kb
 BACs

Prepara7on
Purifica7on of intact nuclei
vector BAC

Lineariza7on
ADNapm in
Agarose blocks
Dephosphoryla7on

Bam HI
Eco RI Liga7on Par7al diges7on and
Hind III

Selec7on of fragments
ParC
pIndigoBAC536 repE
Par B 7400 pb
OriS Electropora7on
Par A
CM

Screening and
Clone arraying characteriza7on
 BAC library in cell pools
Suspensión de células E. coli DH10B transformadas
con ADNapm de P. pinastre clonado en el vector pIndigoBAC536

Plaques containing 4000 colonies

Fragmento genómico
P. pinaster
GUS

Clon BAC de control

Cell pools

Mini-prep / Stock – 80 ºC
Stock – 80ºC Stock – 80ºC Stock – 80ºC Stock – 80ºC Stock – 80ºC

DNA-pool

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E Screening by PCR
F
G
H
 Vectores en levaduras. YACs

•  Con7ene los componentes siguientes:

–  Un centrómero que permite la segregación del plásmido durante la
división celular
–  Un telómero al final del cromosoma de levadura que permite
replicación correcta y evita degradación
–  Una secuencia de replicación autónoma (ARS) que consiste en
secuencias de DNA específicas que permiten la replicación de la
molécula
–  Un gen que permite un modo para detectar el fragmento insertado

•  Ú7l para clonar fragmentos de DNA (entre 200 y 1500 kb)