“Evaluación de la actividad antifúngica in vitro de los aceites esenciales

de molle (Schinus molle) y muña (Minthostachys mollis) sobre el hongo

Botrytis cinerea”

"Evaluation of the in vitro antifungal activity of the essential oils of molle

(Schinus molle) and muña (Minthostachys mollis) on the fungus Botrytis
cinerea"
Leny Yoselin Vega Barbaran
Escuela Profesional de Ingeniería Agroindustrial y Comercio Exterior-
Universidad Cesar Vallejo
yoselin_vb@outlook.com

Resumen
La actividad antifúngica de los aceites esenciales (AE) de Molle (Schinus molle) y Muña
(Minthostachys mollis) sobre el hongo Botrytis cinerea fue evaluada a diferentes
concentraciones (6.3, 3.2, 1.6, 0.8, 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.02, 0.01, 0.005, 0.002, y
0.001%), mediante el método de dilución en agar. La composición química de los
aceites se determinó por espectrofotometría. El hongo fue aislado de arándanos
infectados y luego sembrado en Agar Papa Dextrosa, realizándose repiques cada 7 días
en placas Petri que contenían el mismo medio de cultivo. Los ensayos se realizaron
determinando la Mínima Concentración Inhibitoria (MCI) y Mínima Concentración
Fungicida (MCF) de cada uno de los aceites esenciales, en su composición original, y
combinados en proporciones de 70:30, 80:20 y 90:10 (Muña: Molle). Los resultados
mostraron que el AE de Muña fue más eficaz para controlar el crecimiento micelial de
Botrytis cinerea en comparación con el AE de Molle, exhibiendo una MCI de 0.05% y
una MCF de 0.1%; mientras que, el AE de Molle no inhibió en un 100% el crecimiento
micelial del hongo en ninguna de las concentraciones trabajadas. Por otra parte, las
combinaciones de los AE mostraron una MCI de 0.05% en todas las proporciones; sin
embargo, se exhibió una marcada actividad antifúngica en la proporción de 90:20, con
una MCF de 1.6% en comparación a la MCF de la proporción 80:20, con un valor igual
a 3.2%, y de 70:30 que no mostró MCF a ninguna de las concentraciones evaluadas.
Palabras claves: Actividad antifúngica, aceite esencial, mínima concentración
inhibitoria, mínima concentración fungicida.
Abstract
The antimycotic activity of Molle (Schinus molle) and Muña (Minthostachys mollis)
essentials oils (EO) on the fungus Botrytis cinerea was evaluated in different
concentrations (6.3, 3.2, 1.6, 0.8, 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.02, 0, 01, 0.005, 0.002, and
0.001%) by the agar dilution method. The chemical composition of the oils was
determined by spectrophotometry. The fungus was isolated from infected blueberries
and then planted in Agar Dextrose Agar, being carried out transfers every 7 days in Petri
plates containing the same culture medium. The tests were performed by determining
the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Fungicidal Concentration
(MFC) of each essential oils, in their original composition, and combined, in proportions
of 70:30, 80:20 and 90:10 (Muña:Molle). The results show that Muña EO was more
effective in controlling the mycelial growth of Botrytis cinerea compared to Molle EO,
showing MIC of 0.05% and MFC of 0.1%; Whereas, Molle EO did not 100% inhibit
mycelial growth of the fungus in any of the concentrations worked. On the other hand,
the EO combinations showed an MIC of 0.05% in all proportions; However, a marked
antifungal activity was exhibited in the ratio of 90:20, with an MFC of 1.6% as compared
to the MFC of the 80:20 ratio, with a value equal to 3.2%, and of 70:30 that did not
showed MFC at any of the concentrations evaluated.
Key words: Antifungal activity, essential oil, minimum inhibitory concentration, minimal
fungicidal concentration.
capacidad de penetrar la membrana
1. Introducción
celular del microorganismo y mostrar
actividad inhibitoria sobre las
El control de las enfermedades de frutas
propiedades funcionales de la
y hortalizas en condiciones post
célula3,4,5,6,7.
cosecha, está estrechamente vinculada
al uso de fungicidas químicos. Sin Finalmente, teniendo en cuenta un sin
embargo, en todo el mundo estas número de factores que dan fe a la
acciones han desarrollado resistencia a problemática actual la seguridad
los fitopatógenos, han contaminado la alimentaria y la comunidad científica a
atmósfera y han afectado la salud de las nivel internacional han tomado
personas a través de compuestos importancia en temas relacionados con
tóxicos residuales presentes en el frutas y hortalizas frescas y su
alimento1. protección se ha asentado en productos
a partir de cultivos naturales como
El objetivo del presente estudio se basa
extractos de plantas y/o aceites
en la necesidad de desarrollar nuevas
esenciales como una alternativa a los
alternativas de control a través de la
fungicidas sintéticos o eliminando la
evaluación de las propiedades
necesidad de su uso con la finalidad de
antimicóticas de los aceites esenciales
cumplir con las preferencias del
de molle y muña para el manejo de un
consumidor, los requisitos ecológicos y
patógeno de importancia mundial y
la reducción de la contaminación
alimentaria como Botrytis cinerea,
ambiental8.
apoyándose en un estudio in vitro que
permita determinar su efectividad e 2. Método
impulsar su aplicación a favor de la
agroindustria; cumpliendo con el 2.1 Aislamiento del hongo
cuidado del medio ambiente, los
requisitos ecológicos y las preferencias Los aislamientos se hicieron a partir de
del consumidor. arándanos infectados mediante la
transferencia de una pequeña cantidad
Si bien es cierto los aceites esenciales de micelio y / o esporas de una baya
tienen un muy amplio espectro de infectada (es decir, una cepa por
acción, y podrían inhibir el crecimiento arándano) con una aguja estéril en
de bacterias, hongos y levaduras; sin placas Petri que contenían agar papa
embargo, la mayoría de los estudios dextrosa (PDA) mas 25% de ácido
relativos a la acción antimicrobiana de láctico. El cultivo fue incubado a
los componentes de aceites esenciales temperaturas de 20 a 22 °C hasta la
se han realizado sobre las bacterias, observación de colonias fungosas.
mientras que menos se sabe acerca de
su acción sobre las levaduras y mohos2. Se realizaron purificaciones del hongo
en crecimiento repicándolo
Por otro lado, su actividad constantemente en el mismo medio de
antimicrobiana aun no puede ser cultivo.
confirmada, puesto que, por su
diversidad de componentes, esta no
puede ser atribuida a la acción de un
solo compuesto3.
Varios investigadores han propuesto
que la acción antimicrobiana de los
aceites esenciales se puede atribuir a su
 2.2 Sensibilidad fungicida - MMO: Muña, Molle oils
La sensibilidad de B. cinerea aislado, a 3.2 Comportamiento del crecimiento
los fungicidas, se evaluó midiendo el micelial
crecimiento radial en placas de agar  Aceite esencial de molle
modificado con diferentes (Schinus molle)
concentraciones. Placas de medio no Los resultados muestran un crecimiento
modificadas sirvieron como controles. normal en todas las concentraciones
Tapones de micelio, cortados desde el trabajadas respecto al control. (Figura 1)
borde de un cultivo en crecimiento activo
en medios de agar, se colocaron en el 45.0 6.30%

Crecimiento micelial (mm)

centro de cada placa modificada con los 40.0 3.20%
aceites esenciales y en las placas 35.0 1.60%
30.0 0.80%
control. Los platos se incubaron de 20 a 0.40%
22 ° C. La medida del crecimiento 25.0
0.20%
micelial del patógeno se determinó 20.0
0.10%
midiendo el diámetro de la colonia en 15.0 0.05%
dos direcciones en ángulos rectos 10.0 0.02%
diariamente durante 7 días después de 5.0 0.01%
0.0 0.005%
su incubación. El % de inhibición del 0.002%
0 5 10
crecimiento micelial se hizo en relación 0.001%
con el tratamiento control mediante el Días de incubación CONTROL
uso de la fórmula:

Figura 1. Comportamiento del

[(𝒅𝒄 − 𝒅𝒕)]
% 𝑰𝒏𝒉𝒊𝒃𝒊𝒄𝒊ó𝒏 = ∗ 𝟏𝟎𝟎 crecimiento micelial del hongo Botrytis
𝒅𝒄 cinerea durante 7 días, cultivado en
*dc: diámetro del hongo control positivo PDA tratado con aceite esencial de
*dt: diámetro del hongo con los molle (Schinus molle) a diferentes
tratamientos concentraciones.
La naturaleza fungicida de los aceites  Aceite esencial de muña
esenciales se puso a prueba mediante (Minthostachys mollis)
la observación de recuperación del
micelio inhibido, después de su Los resultados muestran que del día 2 al
transferencia a medio de cultivo papa día 4 las concentraciones de aceite
dextrosa no tratado durante 5 días. esencial más bajas (0.001%, 0.002%,
0.05% y 0.01%), exhiben un crecimiento
3. Resultados extraño, dado que su diámetro promedio
3.1 Mínima Concentración Fungicida sobrepasa los límites máximos de
(MCF) crecimiento marcados por el control (sin
aceite esencial). (Figura 2)
Tabla 1. Mínima Concentración
Inhibitoria (MCI) y Mínima
Concentración Fungicida de todos los
tratamientos

MCI/MCF (%)
Botrytis MOO MUO 70:30 MMO 80:20 MMO 90:10 MMO
cinerea -a -b 0.05 a 0.1 b 0.05 a -b 0.05 a 3.2 b 0.05 a 1.6 b
*a: Mínima Concentración Inhibitoria
*b: Mínima Concentración Fungicida
- MOO: Molle oils
- MUO: Muña oils
  Aceites esenciales de muña
6.30%
(Minthostachys mollis) y molle
3.20%
50.0 (Schinus molle) en proporciones
1.60%
80:20
Crecimiento micelial (mm)

0.80%
40.0
0.40% Los resultados muestran un crecimiento
0.20% normal en todas las concentraciones
30.0
0.10% trabajadas respecto al control. (Figura 4)
0.05%
20.0
0.02% 6.30%
0.01% 50.0

Crecimiento micelial (mm)

3.20%
10.0
0.005% 1.60%
0.002% 40.0 0.80%
0.0 0.40%
0.001%
0 5 10 30.0 0.20%
Días de incubación CONTROL
0.10%
20.0 0.05%
Figura 2. Comportamiento del 0.02%
crecimiento micelial del hongo Botrytis 10.0 0.01%
cinerea durante 7 días, cultivado en 0.005%
PDA tratado con aceite esencial de 0.0 0.002%
0.001%
muña (Minthostachys mollis) a 0 5 10
CONTROL
diferentes concentraciones. Días de incubación
 Aceites esenciales de muña
(Minthostachys mollis) y molle Figura 4. Comportamiento del
(Schinus molle) en proporciones crecimiento micelial del hongo Botrytis
70:30 cinerea durante 7 días, cultivado en
PDA tratado con diferentes
Los resultados muestran un crecimiento concentraciones de la combinación de
normal en todas las concentraciones aceites esenciales de muña
trabajadas respecto al control. (Figura 3) (Minthostachys mollis) y molle (Schinus
molle) en proporciones de 80:20
 Aceites esenciales de muña
6.30%
Crecimiento micelial radial (mm)

50.0 3.20% (Minthostachys mollis) y molle

1.60% (Schinus molle) en proporciones
40.0 0.80% 90:10
0.40%
0.20% Los resultados muestran un crecimiento
30.0
0.10% normal en todas las concentraciones
0.05% trabajadas respecto al control. (Figura 5)
20.0 0.02%
0.01%
10.0 0.005% 6.30%
0.002% 3.20%
Crecimiento micelial radial (mm)

0.001% 50.0
0.0 1.60%
CONTROL 0.80%
0 5 10 40.0
Días de incubación 0.40%
0.20%
30.0 0.10%
Figura 3. Comportamiento del
0.05%
crecimiento micelial del hongo Botrytis 20.0 0.02%
cinerea durante 7 días, cultivado en 0.01%
PDA tratado con diferentes 10.0 0.005%
concentraciones de la combinación de 0.002%
aceites esenciales de muña 0.001%
0.0
(Minthostachys mollis) y molle (Schinus CONTROL
0 5 10
Días de incubación
molle) en proporciones de 70:30
Figura 5. Comportamiento del
crecimiento micelial del hongo Botrytis
cinerea durante 7 días, cultivado en
PDA tratado con diferentes
concentraciones de la combinación de
aceites esenciales de muña
(Minthostachys mollis) y molle (Schinus
molle) en proporciones de 90:10
4. Discusiones
Los resultados obtenidos en el proyecto,
muestran que, tras un análisis
comparativo entre los porcentajes de
inhibición de los aceites esenciales de
muña y molle a diferentes
concentraciones, se le puede atribuir al
aceite esencial (AE) de Minthostachys
mollis una mayor actividad antifúngica
sobre el hongo B. cinerea. Esto se debe
a que dicho aceite presentó inhibición
del crecimiento micelial del hongo en un
100% a una concentración
relativamente baja de 0.05%; mientras
que el AE de Schinus molle solo logró
inhibir el 83.1% a la concentración
máxima analizada (6.3%). Asimismo,
los resultados obtenidos referente a la
MCF del AE de muña (0.1%), respaldan
esta versión. Por otro lado, los
resultados obtenidos en relación a la
combinación de ambos aceites
esenciales comprueban lo descrito
anteriormente; dado que, a mayor
concentración del AE de muña existe
una disminución en cuanto a la MCF,
exhibiendo resultados de 3.2% para la
proporción 80:20 y 1.6% para la
proporción 90:10. Los diferentes
estudios realizados referente a la
actividad antifúngica de aceites
esenciales contra B. cinerea revelan
resultados interesantes que
comprueban la efectividad de estas
sustancias a diferentes
concentraciones. Sin embargo, cada
vez se busca encontrar cantidades más
pequeñas que cumplan la misma
función y que sean más rentables para
el consumidor. Un estudio realizado por
Aminifard et al; (2013), sobre la
actividad antifúngica de los aceites
esenciales de comino negro, hinojo y
menta, revela que los dos primeros
presentaron una inhibición al 100% del
crecimiento micelial del hongo B.
cinerea a concentraciones de 400 y 600
µL/L; mientras que, el AE de menta
inhibió el crecimiento del hongo en
menor porcentaje y a concentraciones
más altas. Estos resultados a
comparación con el % de inhibición al
100% que alcanzó el AE de muña a la
concentración de 0.05% (500µL/L)
resulta más atractivo respecto a los
aceites esenciales de menta e hinojo.
Sin embargo, la efectividad del AE de
comino negro supera a la del AE de
muña, mostrando una ventaja rentable
en cuanto a la MCI, pero tal vez una
desventaja organoléptica en su
aplicación.
Asimismo, Bouchra et al; (2003), evaluó
la actividad antifúngica de los aceites
esenciales de diferentes plantas
pertenecientes a la misma familia, como
Origanum compactum, Thymus
glandulosus y Mentha pulegium. Los
resultados mostraron una inhibición al
100% del crecimiento de B. cinerea de
los aceites esenciales de O.compactum,
T. glandulosus a la concentración de
100 ppm, mientras que el AE de M.
pulegium solo logró inhibir el 58.5% a
250 ppm. Estos resultados a
comparación de los del AE de muña
presentan un mejor efecto antimicótico
contra el patógeno en estudio; dado
que, a una concentración de 0.01%
(100ppm) solo se obtuvo una inhibición
alrededor del 25%. No obstante, su
menor efectividad se le puede atribuir a
sus componentes en comparación con
los de orégano y el tomillo, quienes
poseen mayor concentración de timol y
carvacol; los cuales han sido
determinados como los componentes
de mayor actividad antifúngica.
Por otro lado, estos resultados y
comparaciones ayudan a comprobar lo
descrito por Soylu et al; (2006), los
aceites esenciales extraídos de la
misma familia, no necesariamente
tienen el mismo efecto; esto lo atribuyó
al modo de comportamiento resistente
de los hongos contra diversas
sustancias presentes en los distintos
aceites esenciales. Además, Tripathi et
al; (2008), y Martins et al; (2013),
enriquecen lo descrito anteriormente;
dado que, comprueban que los efectos
de los mismos aceites esenciales
también pueden mostrar variación,
atribuyendo como causa a los factores
que influyen en la composición química
de estas sustancias, como: condición
climática, estacionalidad, geográfica,
periodo de cosecha y técnica de
destilación. Otros autores muestran la
efectividad de aceites esenciales,
comúnmente estudiados para inhibir el
crecimiento de B. cinerea, como
Vitoratos et al; (2013) quien determinó,
además, la MCI del AE de limón a una
concentración de 17µL/mL, el cual
resulta poco atractivo a comparación de
la MCI encontrada para el aceite
esencial de muña (5µL/ml),
encontrándose por debajo de la
concentración hallada por el autor.
Resultados referentes a la acción
antifúngica de aceites esenciales de
diferentes plantas contra B. cinerea
también se encontraron en romero
(Rattanapitigorn et al; 2006), tomillo,
dictanmus, mejorana y lavanda
(Daferera et al; 2003).
El AE de Schinus molle, por su parte, no
presentó MCI (%inhibición = 100%)
contra B. cinerea; sin embargo, a las
concentraciones más altas trabajadas
se logró obtener una inhibición del
crecimiento micelial del hongo hasta un
83%. Estos resultados comparados con
los anteriormente citados, ponen a
prueba la baja efectividad del AE contra
el patógeno en estudio. Sin embargo,
otros estudios revelan su actividad
antimicótica moderada al realizar un
estudio contra hongos de
almacenamiento; Dikshit et al; (1986),
quien puso a prueba la actividad
antimicótica del AE de molle, por
primera vez, encontró efectividad en
hongos tales como: Alternaria alternata,
Aspergillus flavus, Penicillium italicum,
con porcentajes de inhibición de 80 y
53.5%. Asimismo, un estudio más
reciente realizado por Martins et al;
(2013), mostraron resultados similares,
pues se presenció la una efectividad
moderada en diferentes hongos entre
los cuales se mencionan a Aspergillus
japonicus, Aspergillus niger, Aspergillus
oryzae, Fusarium oxysporum,
Rhizophus oryzae, y Rhizophus
stolonifer. Estos resultados nos ayudan
a deducir que tal vez a concentraciones
más altas se puede obtener una
inhibición al 100% del crecimiento
micelial de hongo B. cinerea. No
obstante, se debe tener en cuenta la
rentabilidad que se tendría a
concentraciones superiores.
En cuanto a la composición del AE de
muña, tras un análisis
espectrofotométrico; se encontró
componentes tales como: pulegona y
mentona a quienes se le puede atribuir
su efecto fungicida. Resultados
similares mostraron Cano et al; (2008),
quien al evaluar los componentes del AE
de muña a través de un análisis por
cromatografía de gases encontró
presencia de componentes tales como
pulegona, mentona, limoneno y
mirceno. Asimismo, Guedez et al;
(2014), reportó presencia de pulegona,
metona y timol. No obstante, Zegarra
(2010), reportó que el aceite esencial de
muña está compuesto principalmente
por pulegona (19.3%), mentona (18.4%)
y carvona (1.7%), no descartando la
presencia de limoneno, α-pineno, β-
pineno, ácido piperínico, mentol, entre
otros. Todos estos autores atribuyen la
actividad antifúngica del aceite esencial
a estos monoterpenos encontrados.
En cuanto a la composición del AE de
molle, tras un análisis
espectrofotométrico; se encontró
componentes tales como: α-felandreno
y mirceno. Resultados similares exhibió
Martins et al; (2013), al expresar que los
mayores componentes del aceite son β-
mirceno, α-felandreno y limoneno.
Asimismo, Zegarra (2010) manifestó
que el AE de molle está compuesto
principalmente por β-mirceno (30.1%),
α-felandreno (13.5%), α-pineno
(11.9%), limoneno (9.9%), β-felandreno
(5.7%), entre otros. Estos autores
atribuyen a los componentes una
actividad antifúngica moderada y una
mayor actividad en bacterias Gram
positivas y Gram negativas al
compararlo con otros autores.
En general, autores como Soylu et al; El aceite esencial de molle (Schinus
(2010) y Rattanapitigorn et al; (2006), molle), a todas las concentraciones
quienes evaluaron la efectividad de trabajadas, no presentó MCI ni MCF.
diferentes aceites esenciales contra B.
cinerea atribuyen su modo de acción Se determinó que la proporción óptima
principalmente en las hifas del hongo, lo de aceites esenciales fue la de 90:10,
que conlleva a la pérdida de formación pues presentó mayor actividad
de conidios y por lo tanto una reducción antifúngica sobre el hongo Botrytis
de la carga de esporas en la atmósfera cinerea; comprobando que el aceite
de almacén y superficie. Sus análisis esencial de muña presenta un mayor
muestran considerables efecto sobre el patógeno.
degeneraciones metabólicas en las La aplicación de los aceites esenciales
hifas tales como coagulación de molle y muña lograron tener actividad
citoplasmática, vacuolación, antifúngica sobre el hongo Botrytis
arrugamiento de las hifas, reducción de cinerea en la mayoría de los
su diámetro y lisis de sus paredes. tratamientos aplicados. Estos efectos
En relación a la actividad antifúngica de inhibidores son interesantes en relación
los aceites esenciales de muña y molle con la prevención de la podredumbre del
combinados en proporciones de 90:10, moho gris en muchos productos
80:20 y 70:30, se puede observar que agrícolas y se podrían utilizar en lugar
en cuanto a la MCI los resultados no de los fungicidas sintéticos.
varían en relación a las 3 proporciones 6. Referencias bibliográficas
comparados con el AE de muña; esto se
puede deber a que siguen
predominando los componentes del AE
en mayor proporción, que en
combinación con los componentes del
AE de molle siguen actuando de forma
sinérgica contra el crecimiento del
hongo B. cinerea. Estos resultados
resultan favorables si se le relaciona con
un tema de costos y rentabilidad. Por
otro lado, los resultados obtenidos
respecto a la MCF de las 3 proporciones
comparadas con la del AE de muña en
su composición original, no muestran los
mismos resultados que la característica
anterior; por lo que en este caso es
inevitable remplazar la concentración de
aceite de muña que elimina al hongo B.
cinerea por completo.
5. Conclusiones
Se aisló el hongo en estudió a partir de
arándanos infectados en etapa post
cosecha, provenientes de la empresa
agroindustrial TAL S.A.
Se determinó la MCI y MCF del aceite
esencial de muña (Minthostachys
mollis) exhibiendo valores de 0.05% y
0.1%, respectivamente; los cuales
representan una buena efectividad
sobre el patógeno.