Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Métodos de Análisis

Práctica

Verificación del funcionamiento de un espectrofotómetro

Profesor: Francisco C. Fernández López

Sección 1
Grupo: 4IM1
Alumno: Erick Barron Gasca

Fecha 03/06/15
Objetivos

El alumno:

 Evaluará el rendimiento instrumental de un espectrofotómetro

 Verificará la exactitud de la escala de longitud de onda, la presencia de radiación dispersa, el ancho de
banda, la exactitud fotométrica, la proporcionalidad de respuesta y el rendimiento global del instrumento.

Introducción

La obtención de resultados confiables empleando métodos espectrofotométricos, requiere en primer lugar,

verificar que el instrumento de medición está funcionando correctamente.

La revisión del rendimiento de los espectrofotómetros UV – VIS es indispensable en el control de calidad. Para
llevar a cabo este tipo de comprobaciones es común el empleo de substancias estándar, cuyas propiedades
espectrales han sido estudiadas cuidadosamente, Posteriormente, se evalúa el funcionamiento del instrumento
en función de los resultados obtenidos del análisis de estos estándares. Aunque no se han definido claramente
cuáles son los parámetros que deben valorarse para asegurar un funcionamiento optimo, algunos fabricantes y
usuarios han acordado evaluar los criterios que se describen a continuación:

Exactitud en la escala de la longitud de onda.

• En condiciones normales de operación, la mayoría de los instrumentos mantendrá por un tiempo

indefinido una correspondencia entre la radiación que atraviesa una muestra y el valor de longitud de
onda señalado en el indicador respectivo, sin embargo hay situaciones que es necesario verificarlo.

• La absorbancia de un cromóforo es medida a la longitud de onda de máxima absortividad. Si la longitud

de onda de calibración de un instrumento cambia, la absorbancia cambia. La magnitud del error depende
de la localización relativa del punto en el espectro y además del tipo de espectro si es ancho o estrecho.

Luz dispersa

• Luz dispersa, luz parásita, luz espuria hace referencia a toda la radiación no contemplada en el control
del monocromador, que cruza por la rendija de salida sin haber pasado a través de la muestra,
produciéndose así una alteración en las estimaciones de absorbancia.

• La radiación parásita se suma al haz transmitido que es captado por el detector. Con altas
concentraciones el error es significativo ya que se producirán desviaciones negativas a la Ley de Beer.

• La radiación parásita puede originarse de múltiples maneras: reflexiones dentro del instrumento, polvo
acumulado sobre las lentes, espejos sucios o corroídos o rallados, grietas o una abertura en el gabinete.

• Dispersión por partículas de polvo.

Puede aumentar por el uso de lámparas y/o detectores inapropiados por tener mejor respuesta a un rango
distinto al de interés

• Métodos para detectar radiación parásita:

1. Filtros de corte rápido

2. Soluciones

Estos materiales tienen una alta transmisión en una parte del espectro pero súbitamente se vuelven opacos
(absorben la mayor parte de la radiación) a partir de una longitud de onda límite.
Si la cantidad de luz transmitida en presencia de estos filtros se incrementa más allá del 1% se considera la
presencia de luz dispersa.

Exactitud fotométrica

Se define como la exactitud en la medida de Absorbancia, o del % de Transmitancia en la escala de un

espectrofotómetro.

La exactitud en los valores de absorbancia es fundamental cuando no se trabajan estándares.

Un estándar de absorbancia debe tener una absorbancia constante y estable a una determinada longitud de
onda, ser insensible al ancho de banda.

Métodos empleados:

 Filtro de vidrio neutro que proporciona transmitancias o absorbancias constantes en un intervalo de

longitud de onda.
 Soluciones

Dicromato de potasio

Sulfato de cobalto amónico

Ancho de banda

Denota la fracción de longitudes de onda que cruzan la rendija de salida y producen una lectura del 50% T
alrededor de la longitud de onda de máxima transmitancia.

Algunos espectrofotómetros permiten modificar el ancho de banda, otros lo tienen fijo, sin embargo es
conveniente verificarlo ya que la acumulación de polvo en las ranuras del monocromador puede provocar su
reducción

Muchas desviaciones negativas de la ley de Beer puede deberse al uso de instrumentos con un ancho de
banda muy amplio.

Proporcionalidad o linealidad fotométrica

Es la capacidad de un sistema fotométrico para dar una relación lineal entre la potencia radiante incidente a su
detector y la lectura. Es deseable una relación lineal entre ambas magnitudes.

La linealidad instrumental es un prerrequisito para la exactitud fotométrica, así como para la exactitud analítica.

Se pueden utilizar soluciones que sigan la ley de Beer.

 Oxihemoglobina
 Sulfato de cobalto amónico
 Sulfato de cobre.

Una respuesta no lineal entre absorbancia y concentración indica:

-Falla en la fuente de radiación o en el monocromador.

 -Falla en el detector

-Radiación dispersa

Tablas y Gráficas

Tabla1. Elaboración de la curva de calibración de sulfato de níquel

Tubo NiSO4 6H2O HCl al 1% Concentración A400

Serie a Serie a’ 0.19 M (mL) (mL) de NiSO4 6H2O Serie a Serie a’
0.19 M (mL)
1 1’ 0 4 0 - -
2 2’ 0.2 3.8 0.0095 0.05 0.045
3 3’ 0.6 3.4 0.0285 0.150 0.140
4 4’ 1.4 2.6 0.0665 0.370 0.430
5 5’ 2.2 1.8 0.1045 0.550 0.500
6 6’ 3 1 0.1425 0.670 0.620
7 7’ 3.2 0.8 0.152 0.700 0.700
8 8’ 3.6 0.4 0.171 0.770 0.770
9 9’ 3.8 0.2 0.1805 0.800 0.800
10 10’ 4 0 0.19 0.850 0.850

Para calcular la concentración de NiSO4 • 6H2O utilizamos la siguiente fórmula:

V1 M1 = V2 M2

Despejar M2
𝑽𝟏𝑴𝟏
M2 = 𝑽𝟐

Ejemplo tubo 2:
(𝟎.𝟐𝒎𝑳)(𝟎.𝟏𝟗𝑴)
M2 = = 𝟎. 𝟎𝟎𝟗𝟓 𝑴
(𝟒𝒎𝑳)

Intervalo Dinámico lineal de la concentración

 y = 4.2774x + 0.0458
Curva de Calibración de NiSO4 •6H2O R² = 0.9841
1
0.9
0.8
0.7
Absorbancia

0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.18 0.2
Concentración Molar

Coeficiente de correlación r = 0.9920

Tabla 2. Espectro de transmisión del filtro de didimio

Longitud de onda %T
(nm)
400 43
410 53
420 56
430 50.5
440 45.8
450 47
460 47
470 44
480 48
490 57
500 55
510 42.8
520 30
530 30
540 48
550 65
560 61
570 34
580 11
590 6

Espectro de Transmisión del Filtro de Didimio

 Espectro de transmisión del filtro de didimio
70

60

50
Absorbancia

40

30

20

10

0
350 400 450 500 550 600 650
Longitud de onda (nm)

Tabla 3. Espectro de transmisión de la solución de NiSO4 • 6H2O al 20%

Longitud de onda %T
(nm)
380 5.5
390 4.5
400 4.9
410 7.1
420 28.5
430 26.5
440 32.8
450 63.5
460 43
470 75
480 84.1
490 92
500 92
510 93
520 90
530 87.5
540 84
550 80.9
560 79
570 73
580 63
590 54

Espectro de Transmisión de la solución de NiSO4 • H2O

 Espectro de transmisión de la solución de NiSO4 • H2O
100
90
80
70
60
Axis Title

50
40
30
20
10
0
350 400 450 500 550 600 650
Axis Title

Tabla 4. Proporcionalidad entre A y λ para el NiSO4 al 20%

Longitud de onda Absorbancia

(nm)
530 0.0579
540 0.0757
550 0.092
560 0.1023
570 0.1366

Gráfico de Absorbancias vs. Longitud de onda para el NiSO4 • H2O

y = 0.0018x - 0.9191
Proporcionalidad entre A y λ para el NiSO4 al 20% R² = 0.9619
0.16
0.14
0.12
Absorbancias

0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
525 530 535 540 545 550 555 560 565 570 575
Longitud de onda (nm)

Tabla 5. Resumen de resultados de evaluación del funcionamiento del espectrofotómetro.

 Valores de Valores
Parámetro estudiado Conclusión
referencia experimentales
Exactitud de la escala de longitud
de onda
1. Filtro de didimio
400 nm No cumple el máximo, el
490 nm
mínimo si. La parte
Máximos (λ, nm) 490 nm 550 nm
involucrada es el
550 nm 560 nm
monocromador.
470 nm 470 nm
Mínimos (λ, nm)
520 nm 520 nm
2. Solución de NiSO4·6H2O al 20%
El máximo no cumple, el
Máximos (λ, nm) 500 nm 510 nm
mínimo sí. Parte del
Mínimos (λ, nm) 400 nm 400 nm espectrofotómetro: El
monocromador

Proporcionalidad Fotométrica
a= 0 a= -0.91 De acuerdo al coeficiente
Datos de regresión de 530 a 570 nm b= 1 b= 0.001 de correlación podemos
R=1 r = 0.9807 decir que no cumple.

Luz Dispersa
%T a 400 nm (Solución de Si los valores de %T son
4.9% 4%
NiSO4·6H2O al 20%) cero, no existe luz dispersa
%T a 450 nm 1% 0 en el espectrofotometro
%T a 500 nm 1% 0

Ancho de Banda La variación es igual al 3%,

por lo tanto si cumple.
%T a 510 nm 93% 90% Parte involucrada:
Monocromador.

Exactitud fotométrica La variación es menor al

1. Método del filtro de vidrio neutro 3% por lo que es exacta la
%T a 530 nm 88% 87% escala del
espectrofotómetro
2. Método de la solución de Parte involucrada:
NiSO4·6H2O al 20% Detector
Sale del intervalo de
Absorbancia a 400 nm 1.2- 1.4 1.5
referencia
Cumple con el intervalo ya
Absorbancia a 500 nm 0.03- 0.04 0.04
que esta dentro de él.

Intervalo dinámico Lineal de

Concentración
a= 0 a= 0.004 La relación es lineal por lo
Datos de regresión lineal b= 1 b= 4.27 que el detector codifica
r= 1 R = 0.99 bien los datos
0.0 M – 0.152 M –
Intervalo de concentración
0.19 M 0.19M
Discusión

Para determinar el la eficiencia de un espectrofotómetro fue necesario evaluar varas partes que lo conforman,
monocromador, fuente, muestra y detector, dando como resultado numero cercanos a los de referencia que
fueron otorgados por el profesor, esto quiere decir que el espectrofotómetro utilizado tiene las condiciones
optimas para trabajar ya que no presenta alteraciones como luz dispersa, exactitud fotométrica, etc.

Conclusión

 Evaluamos el rendimiento instrumental de una espectrofotómetro

 Verificamos las diferentes partes que conforman un espectrofoto

Bibliografía

 Skoog, Douglas A., West, Donald M. Fundamentos de Química Analitica.Editorial Cengage

Learning 2014. Mexico DF. 9a Edición pp 950
 Whitten, K.W., Davis, R. E., Peck, M.L. Química General Editorial Cengage Learning 8va
Edición. Mexico DF. Pp 1058.