Como todos los científicos relacionados con los seres vivos, los microbiólogos necesitan ver los

organismos que estudian; siendo su herramienta imprescindible el microscopio, también los

microbiólogos necesitan realizar experimentos, que casi siempre requiere su cultivo en el
laboratorio. Cultivar un microorganismo significa proporcionarle las condiciones adecuadas para
su crecimiento y multiplicación.

PROPIEDADES DE LA LUZ

La luz es aquella parte del espectro de ondas electromagnéticas que es visible para el ojo
humano.

La longitud de onda es la distancia entre dos picos o entre dos valles de una

onda. La intensidad de una onda luminosa es la altura de esa onda.

Si un rayo incide en un objeto y es devuelto, se dice que se ha reflejado; si pasa a través

del objeto, se ha transmitido, si transfiere parte de su energía a dicho objeto, ha sido absorbido.

Cuando la luz pasa a través de una pequeña abertura o alrededor de un objeto

opaco, se desvía; a esta desviación se llama difracción.

La refracción es la desviación que tiene lugar cuando un rayo de luz penetra, formando un
Angulo, en un objeto de diferente densidad.

LA MICROSCOPÍA

En todos los microscopios, la calidad de la imagen depende de tres factores: El aumento es

la amplificación de un objeto. El contraste es la diferencia de la intensidad luminosa. Una buena
resolución significa ser capaz de percibir dos puntos adyacentes de una imagen como separados
uno del otro.

El poder de resolución de un microscopio se puede aumentar usando lentes de aumento

de mayor tamaño, iluminando el espécimen con una luz de menor longitud de onda, o usando un
material (como el aceite de inmersión) con un índice de refracción mayor que el del aire, entre la
lente del objetivo y la preparación.

La apertura numérica (AN) es una medida del tamaño de la lente del objetivo y depende
de si la lente va a ser usada con aceite de inmersión.

Un microscopio óptico utiliza la luz visible como fuente de iluminación. Un microscopio

óptico compuesto posee dos sistemas de lentes, la lente del ocular y la lente del objetivo. Otro
sistema de lentes, el condensador, dirige la luz a través del espécimen. La luz transmitida por el
espécimen forma una imagen en el tubo del microscopio; esta es aumentada por la lente ocular y
proyectada en la lente del ojo.
 Los microscopios ópticos compuestos están provistos de varios objetivos:

débil seco (10x), fuerte seco (40x), y el objetivo de inmersión (100x)

Un microscopio óptico ordinario produce una iluminación de campo claro, la luz pasa a
través del espécimen y el campo se observa iluminado de forma brillante.

PREPARACIONES EN FRESCO

Una preparación en fresco se emplea para observar microorganismos vivos. Una

preparación en gota pendiente evita la desecación y puede ser observada durante más tiempo.
Ninguna de ellas aporta mucho contraste.

Los colorantes son compuestos químicos utilizados para aumentar el contraste. La mayoría
solo son efectivos si los microorganismos han sido fijados: muertos y adheridos al portaobjetos.
Los colorantes básicos son iones cargados positivamente, y los ácidos negativamente.

Un mordiente es un compuesto que aumenta la afinidad del espécimen por

el colorante o que recubre la estructura para hacerla más visible.

Una tinción simple utiliza un solo colorante. Una tinción diferencial consta de dos etapas,
una tinción primaria y una de contraste.

La tinción de Gram es diferencial y distingue entre bacterias Gram positivas y Gram

negativas, debido a sus distintas superficies externas.

La tinción de ácido – alcohol resistencia – o de Zichl – Neelsen – es diferencial y tiñe las

micobacterias de rojo, mientras que las otras bacterias son teñidas de azul por el colorante de
contraste.

La tinción de Wirtz – Conklin tiñe las endosporas, estructura de reposo de algunas

bacterias. La tinción de Leifson utiliza colorantes y mordientes para teñir los flagelos, apéndices
filamentosos para la motilidad. La tinción negativa se utiliza para observar la cápsula, una
estructura protectora de algunas bacterias.

En la microscopía de contraste de fases, el contraste se debe a que los diferentes

materiales absorben diferentes cantidades de luz. Debido a que puede utilizarse con células vivas
sin teñir, puede usarse para estudiar el movimiento celular. Dado que no existe distorsión debida a
la fijación o tinción, es una técnica muy buena para observar detalles internos. Pero se observa un
halo de luz alrededor de la imagen, que es inevitable.

En la microscopía de campo oscuro, la imagen se ve brillante contra un

fondo oscuro. Se puede utilizar con células vivas sin teñir.

 La microscopia de fluorescencia incrementa el contraste por medio de la fluorescencia y,
además de servir para observar microorganismos, se puede utilizar para identificarlos. Las técnicas
son anticuerpos fluorescentes (o inmunofluorescencia) son herramientas importantes de
diagnóstico.

La microscopía de Nomarsky proporciona contraste por interferencia, como lo hace el

contraste de fases, pero produce una imagen semejante a las tridimensionales con más detalle.

El microscopio electrónico posee un poder de resolución mayor, y por tanto un mayor

aumento útil que el microscopio óptico.

El microscopio electrónico de transmisión (MET) utiliza un chorro de electrones en lugar

de luz visible para definir el objeto. Produce aumentos de hasta 200000x (en comparación con los
1000x para un microscopio óptico)

El MET requiere que las muestras reciban una preparación especial, como la sección fina,
la criofractura o el criograbado: a menudo se aumenta el contraste por sombreado metálico,
utilizando un metal pesado.

El microscopio electrónico de barrido (MEB) bombardea a la superficie del espécimen con

un rayo de electrones de tal manera que produce imágenes con una profundidad aparente
tridimensional.

Las muestras para microscopia electrónica de barrido deben ser congeladas y desecadas
al vacío y después recubiertas con un metal pesado. Los especímenes son observados al vacío. El
MEB se utiliza generalmente para visualizar células enteras, pero la criofractura o el criograbado
también permiten observar estructuras internas.

Generalmente los microscopios de uso cotidiano son los ópticos, ya que proporcionan una
buena información acerca del tamaño, forma y apariencia general de las células; sin embargo, la
resolución, y por tanto también el aumento, son limitados.

Los microscopios electrónicos, que permiten visualizar la ultraestructura celular , se

utilizan en investigación. Los virus y los objetos más pequeños como las macromoléculas, solo
pueden verse mediante microscopios electrónicos.

Los microorganismos son sujetos ideales para la investigación en el laboratorio porque se

pueden estudiar millones de ellos en un solo mililitro de medio, porque se multiplican
rápidamente y porque los conocimientos adquiridos pueden, a menudo, generalizarse a sistemas
celulares, plantas y animales (incluida la especie humana)

OBTENCIÓN DE UN CULTIVO PURO O AXENICO

Un cultivo axénico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola
célula. Los cultivos axénicos son muy raros en la naturaleza. En los medios naturales – por
ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo animal – existen cultivos mixtos. En un cultivo mixto
viven muchas y diferentes especies de forma conjunta. Un cultivo axénico se obtiene
artificialmente en el laboratorio.

La obtención de un cultivo axénico es un proceso de dos etapas. Primero, hay que

esterilizar todos los materiales para eliminar todos los microorganismos presentes en ellos.
Segundo, hay que aislar y cultivar un solo microorganismo, para producir un clon de
descendientes.

La primera etapa para obtener un cultivo axénico es la esterilización: eliminación de todos

los microorganismos de un material. Todos los instrumentos y materiales utilizados para obtener
un cultivo axénico deben ser esterilizados, incluyendo el medio de cultivo.

La esterilización por calor mata los microorganismos por desnaturalización de sus

proteínas. El calor húmedo es más rápido que el calor seco, pero se requiere una temperatura
mayor que la temperatura del punto de ebullición del agua; normalmente se utiliza la autoclave.

El calor seco se utiliza para materiales que se dañan por la humedad. Se necesitan
temperaturas de al menos 170 grados centigrados y un tiempo mínimo de una hora. El flameado
directo es otra forma de esterilización por calor seco.

La filtración es el paso de un fluido a través de una barrera con poros demasiado pequeños
para las células microbianas. La filtración no elimina los virus por que pasan a través de los filtros.

La esterilización química se utiliza para destruir los cultivos después de un experimento y

para minimizar la contaminación en el laboratorio.

La segunda etapa de para obtener un cultivo axénico es inocular, o introducir, una sola
célula de un microorganismo en un medio estéril. Un clon es una población celular descendiente
de una sola célula. Las colonias son clones que han crecido sobre un medio sólido el tiempo
suficiente como para hacerse visibles.

Las células de un cultivo deben diluirse previamente, para poder aislar una de ellas.

En el método de siembra por estría en placa, se sumerge el asa en el cultivo mixto y se

hacen estrías sobre un medio sólido en placa Petri. El proceso se repite hasta que se aíslan células
individuales. Se incuban las células hasta que se observan las colonias. Entonces se repite el
proceso.

En los métodos de siembra por vertido en placa y extensión en placa, las suspensiones de
células microbianas se diluyen antes de ser sembradas. A continuación se pueden seguir dos
técnicas distintas; o bien las diluciones se mezclan con agar fundido y se vierten en placa, o bien se
siembran en la superficie de una placa de agar, extendiéndolas con una asa de vidrio. Las placas se
incuban hasta que aparecen las colonias. A continuación se repite el proceso.
 Un medio definido se prepara a partir de productos químicos puros. Los microorganismos
exigentes requieren medios químicamente complejos. La preparación de los medios definidos es
laboriosa y las bacterias suelen crecer en ellos más lentamente que en los medios complejos.

Los medios complejos se preparan a partir de extractos de sustancias naturales como la

carne, la sangre o la caseína. A un medio líquido se le llama caldo. Los medios complejos son
fáciles de preparar y permiten un crecimiento rápido de los microorganismos.

Los medios selectivos favorecen el crecimiento de ciertos microorganismos, mientras

suprimen el de otros. Se utilizan para aislar una especie concreta, a partir de una mezcla compleja.

Los medios diferenciales como el agar sangre, se utilizan para la identificación de las
colonias de un tipo concreto de microorganismo. Los medios selectivos - diferenciales reducen el
campo de identificación e identifican una bacteria específica.

Un medio de enriquecimiento se utiliza para aislar un microorganismo particular o un tipo

microbiano a partir de una población natural grande y compleja

En general, los microorganismos crecen más rápidamente a temperaturas medias. Para

disminuir los cambios de pH, generalmente se adicionan tampones a los medios.

Los microorganismos aerobios estrictos requieren oxígeno para obtener energía. Los
anaerobios estrictos no pueden crecer en presencia de oxígeno. Los microorganismos anaerobios
facultativos utilizan oxígeno si disponen de él, pero no lo necesitan. Los anaerobios aerotolerantes
no utilizan el oxígeno, pero tampoco les perjudica. Los microaerófilos requieren bajas tensiones de
oxígeno. Suministrar o excluir el oxigeno de un medio siempre representa un problema técnico.

Los cultivos que se conservan para su estudio y como cepas de referencia; se les llama
cultivos de colección.

Se puede mantener un cultivo desecándolo (eliminación total del agua).

Como técnica de desecación suele usarse la liofilización. Los cultivos también se pueden preservar
a bajas temperaturas. Tras la congelación, el cultivo se almacena a -50°C, bien en nitrógeno líquido
o en un ultracongelador.