PRÁCTICA N° 1

RECONOCIMIENTO DE MATERIAL

INTRODUCCION

Algunos de los instrumentos más utilizados en los laboratorios, son elaborados de vidrio
resistente a altas temperaturas, por su alto contenido de dióxido de silicio, bajo álcali,
óxido bórico y vestigios de otros óxidos, lo que condiciona su escaso coeficiente de
dilatación, teniendo una gran aplicación en la fabricación de materiales de laboratorio,
uno de los mas conocidos es .el vidrio PYREX. Así como los elaborados de distintos
metales pesados como platino,' mercurio, aluminio, cobre que les otorgan
características como buenos conductores del calor o por que al medio ambiente son
muy manejables sin alterar su composición

OBJETIVO

Que el alumno conozca parte del material necesario en un laboratorio de microbiología

y parasitología.

Que el alumno aprenda a manejar el material utilizado en un laboratorio de microbiología

y parasitología

MATERIAL DE VIDRIO

Constituye una de las principales herramientas para los fines que se persigue en el
aboratorio. Los requisitos necesarios para que un material sea un "buen material", son

1.Ser de buena calidad; es decir que no sean fácil de quebrarse.

2.Ser de color neutro.

3.Poseer resistencia a las acciones mecánicas y a las variaciones de temperatura así

como también a los álcali-libre (no se raje).

4.Poseer bajo coeficiente de dilatación (que no pierda su forma).

Tubos de Ensayo:

Se emplean como recipientes de medios de cultivo.

Tubos de prueba

Deben ser de vidrio neutro, paredes gruesas y equilibradas, de preferencia sin

rebordes para facilitar el taponamiento.
De 16 x 150 mm
De 15 x 125 mm
De 13 x 100 mm para estudio de fermentación trabajos mecánicos
De 10 x 75 mm pruebas, estudios serológicos.
Tubos de Roux

Con escotadura de 4 cm. de fondo, de 25 x 200 mm para

Tubos de centrífuga
De vidrio, pueden ser cónicos o cilíndricos, siempre de paredes gruesas,
De paredes gruesas, por estar inmersos rotando a alta velocidad.

De polietileno, se utiliza para centrifugaciones a altas velocidades, de medidas

semejantes a los anteriores

Cápsulas o Placas Petri:

Cajas cilíndricas, se emplean como recipientes de medios de cultivo para el cultivo y

aislamiento de microorganismos. Las más usadas son las de 10, 15 ó 20 mm x 100 mm.

Espátulas de Meta con mango de madera

Estuches cilíndricos o Cubículares
Mecheros de Bunsen
Canastillas o Cestos de Metal
Soportes Universales
Trípodes
Asa de Kolle

Varillas metálicas o de vidrio que llevan en un extremo alambre de platino; cuando el

alambre es recto se llama Micrón y cuando el alambre forma un anillo de diámetro
variable en su extremidad toma el nombre de asa.

Centrífugas:
Se utiliza en la separación de sólidos suspendidos en líquidos. Hay centrífugas de
tamaño y velocidades variables, la velocidad, se mide en revoluciones por minuto, La
velocidad a la cual sedimentaran las partículas en un líquido dependen de varios
factores:
Tamaño de la partícula.
El peso de la partícula.
La viscosidad del líquido.
La fuerza gravitacional

Ultra centrifugación; para obtener alteraciones elevadas (mayor o igual a 100 000 g),
pueden ser:
Ultra centrifugación analítica: para determinación de características físicas de proteínas
o de Acido nucleicos.
Ultra centrifugación preparativa: permite la separación de organelos

Baños de agua

También llamados BAÑO MARIA tienen salida de aire presentan un termostato que
regula la temperatura del agua presenta un piso para colocar los materiales que se
desea

Refrigeradoras y congeladoras Son incubadoras de temperatura fría menor de cero

grados y los frigideres de dos a siete grados

Filtración Sirve para separar materiales líquidos de sólidos un ejemplo los FITROS DE
MEMBRANA

Autoclave Funciona por las presiones que se dará a una mayor temperatura logrando
su esterilización como por ejemplo las conservas

Horno Pasteur

Es como una mufla que tiene tres paredes y la cubierta es de asbesto sirve para la
esterilización por el calor seco.

Estufas de aire caliente

Al igual que el anterior es utilizado en la esterilización por el calor seco. Tienen solo dos
paredes y son de forma cúbica.
Mechero bunsen:

Dispositivo que se utiliza mucho en los laboratorios debido a que proporciona una llama
caliente, constante y sin humo. Debe su nombre a Robert Bunsen el que lo creo. Los
mecheros Bunsen constan de un tubo vertical, enroscado en su parte baja a un pie por
donde entra el gas.Mediante un aro metálico móvil se regula la entrada de aire. La
mezcla se enciende por la parte superior.

REALIZAR ESQUEMAS
 PRACTICA Nº 2

MICROSCOPIA: EXAMEN AL FRESCO

INTRODUCCION

Con el microscopio podemos observar organismos y estructuras que son invisibles por
simple inspección ocular.
La morfología de las bacterias se puede examinar de dos maneras:
1. Observando los microorganismos vivos sin teñir.
2. Observando células muertas teñidas con colorantes.

Para hacer un estudio de los microorganismos, se suele recurrir a técnicas especiales

que van a permitir el acondicionamiento del material para dicho estudio. Los colorantes
y coloraciones se usan en estudios macro y microscópicos, por ejemplo: para estudios
de la actividad bioquímica de los microorganismos, clasificación de los
microorganismos, etc.
Para efectuar una observación del microorganismo, los métodos de coloración son
diversos y además, constituyen un ítem más que posibilita realizar una clasificación, es
decir, que hay técnicas que permiten hacer un diagnóstico informando cómo reacciona
una célula microbiana a ciertas manipulaciones físicas y químicas con los colorantes
(ejm: métodos de Gram-Nicole, ácido-alcohol resistencia, etc.).
El descubrimiento del microscopio de contraste de fases y el uso del microscopio
electrónico para exámenes de microorganismos, han dejado de lado muchas de las
técnicas de coloración. A pesar de ello, los colorantes y las coloraciones se siguen
usando en trabajo de diagnóstico y de investigación por ser de un manipuleo sencillo y
de fácil comprensión e interpretación.

EXAMEN AL FRESCO

Muestra 10 X Muestra 40 X
 MICROSCOPIA II

COLORACIÓN DE GRAM Y AZUL DE METILENO

Colorantes
Los colorantes son compuestos químicos que tienen la capacidad de comunicar su color
a otros cuerpos y quedar fijados a pesar de ser lavados con solventes ácidos o álcalis
débiles. La coloración que así se obtiene, se debe a una absorción selectiva de la luz,
lo que da como resultado, cuerpos coloreados con un color complementario del que ha
sido absorbido.
Muchos colorantes son moléculas cargadas positivamente o negativamente es decir son
cationes o aniones, los que dan las reacciones correspondientes cuando se unen a otras
moléculas con cargas complementarias.
Muchas veces, los colorantes necesitan de la adición de otras sustancias con la finalidad
de aumentar o de dar una afinidad química que ellos o el cuerpo a colorear no posee.
Estas sustancias se denominan mordientes y también pueden ser aplicadas en forma
independiente.
La combinación mordiente más colorante forma lo que se denomina laca.
colorante + mordiente = laca

Métodos de Coloración
La coloración tiene por objeto, fijar el colorante sobre el objeto a colorear de tal manera
qué, después de sucesivos lavados con solventes, el objeto quede coloreado.
Los métodos para el estudio de materiales biológicos, pueden ser agrupados en dos
categorías: 1) los que estudian al organismo vivo en su estado natural se denominan
Coloraciones vitales o in vivo y 2) los que lo estudian después de su muerte se
denominan Coloraciones no vitales o post-vitales.

1) Coloraciones vitales o in vivo:

En este tipo de coloraciones, se trabaja con el material sin que se produzcan
modificaciones en sus estructuras biológicas. Esto permite el estudio del material «in
situ», para ello se debe trabajar con colorantes diluídos y no tóxicos.
Dentro de estas coloraciones, están las supravitales: en donde se sumerge el material
o fragmento de células vivas dentro de la solución colorante a usar (ej: levaduras teñidas
con azul de metileno para diferenciar vivas de muertas); y las intravitales que son
aquellas en donde se inyecta por vía subcutánea, endovenosa o intramuscular,
soluciones muy diluídas de colorantes, en el interior de animales de experimentación
donde se encuentra el organismo en estudio; luego de 20 o 30 minutos, se sacrifica al
animal y el tejido que nos interesa, se coloca entre cubre y portaobjetos con solución
fisiológica y se observa al microscopio.

2) Coloraciones no vitales o post-vitales:

En este tipo de coloración se encuentran:

- Directa: cuando se produce una simple inmersión en el baño del colorante.
- Indirecta: cuando se necesita con colorante de un mordiente.
- Progresiva: se usan soluciones colorantes diluidas hasta obtener la intensidad
de color deseada.

OBJETIVOS
- Observar su movilidad.
- Entrenamiento en preparación de extendidos y realización de coloraciones.
- Observación microscópica de morfología y agrupamientos bacterianos.
MATERIALES
- Suspensión de bacterias
- Láminas porta objetos y laminillas cubre objetos.
- Mechero a gas ( bunsen)
- Microscopio.
- Coloración de Gram.
- Coloración Azul de Metileno.
- Láminas preparadas de la cátedra.

COLORACION AZUL DE METILENO

Se usa en la investigación de microorganismos que a pesar de ser transparentes pueden
ser observados al estado fresco, al microscopio, sin hacer actuar sobre ellos ningún
colorante, se pone también de manifiesto funciones biológicas como movilidad,
luminosidad, refringencia, etc.

OBJETIVO
Comparar el tamaño de las bacterias con otros microorganismos.
Observar la movilidad de microorganismos vivos.

MATERIAL
Muestras de aguas estancadas Asa bacteriológica
Tubos de centrifuga Mechero a gas
Laminas portaobjetos Microscopio
Centrífuga Cultivos de bacterias

PROCEDIMIENTO

Colocar una gota de agua sobre una lámina portaobjeto, usando una asa bacteriológica
y luego cubrirla con una laminilla cubreobjetos secos de 10 x y 40 x.
Observar con lentes objetivos secos de 10 x y 40 x.

COLORACION AZUL DE METILENO

La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad
específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son
moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los
constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los
polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal
violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente
(aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales
como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo
Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este
grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para
revelar la localización de las gotas o depósitos de grasa. Un ejemplo de colorante
liposoluble es el negro Sudán.
La coloración azul de metileno se usa para observar morfología, agrupación, elementos
celulares, leucocitos, células epiteliales. etc.
(Ver Procedimiento en Métodos de Coloración)

COLORACION DE GRAM
La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio
bacteriológico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su
utilidad práctica es indiscutible y en el trabajo microscópico de rutina del Laboratorio de
Microbiología las referencias a la morfología celular bacteriana cocos, bacilos, positivos,
negativos, etc) se basan justamente en la tinción de GRAM
Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram, quien la
desarrolló en 1844. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias
pueden dividirse en dos grupos, Gram positivas y Gram negativas (en este caso, los
términos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga eléctrico, sino simplemente
designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias).
Las bacterias Gram positivas y Gram negativas tiñen de forma distinta debido a las
diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula
bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo así como para prevenir la lisis
osmótica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el
peptidoglicano. La pared de la célula Gram positiva es gruesa y consiste en varias capas
interconectandas de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. Generalmente,
80%-90% de la pared de la célula Gram positiva es peptidoglicano. La pared de la célula
Gram negativa, por otro lado, contiene una capa mucho más delgada, únicamente de
peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos,
lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la célula Gram
negativa es peptidoglicano.

PROCEDIMIENTO
1. Preparar el frotis.
2. Fijar la preparación a la llama.
3. Hacer actuar el colorante de Violeta de Genciana (solución acuosa al 1%), y tres
gotas de Bicarbonato de Sodio al 5%, dejar actuar por 1 minuto.
4. Lavar la preparación con agua de caño y cubrir la preparación con la solución de
Lugol, dejando actuar este mordiente por tres minutos.
5. Lavar con agua de caño y decolorar la preparación con alcohol de 95% durante
l0 a 15 segundos. Lavar con agua de caño.
6. Cubrir el frotis con el colorante Safranina (solución acuosa al 1%) durante 2
minutos, lavar
7. Secar y observar al microscopio usando objetivo de inmersión.

COLORACIÓN AZUL DE METILENO, COLORACION DE GRAM

COLORACION AZUL DE METILENO

Muestra _____________100 X Lamina stock ___________100X

COLORACION DE GRAM

Muestra _____________100 X Lamina stock ___________100 X