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Alumnos:
López Portillo Felipe de Jesús
Márquez San Juan María Fernanda
Práctica No. 2
“Inducción de mutantes en Escherichia coli”
Sección: 2
Las mutaciones espontaneas pueden también resultar de procesos de desaminacion o depurinacion en el ADN
que cambian el patrón de apareamiento de bases, en el primer caso o que favorecen la incorporación de bases
incorrectas, en el segundo. Los agentes inductores de mutaciones se pueden globalmente dividir en:
Ya sean de tipo espontaneo o inducido, los cambios en las bases nitrogenadas pueden producir los siguientes
tipos de mutaciones:
En la luz ultravioleta (Imagen 1) las bases absorben en alto grado la radiación con una longitud de onda de
unos 260 y una de las consecuencias de esto es la fusión fotoquímica de dos pirimidinas que ocupan posiciones
contiguas en la misma cadena de polinucleotidos. En el caso de dos timinas, el producto de la fusión se conoce
como dímero de timina que comprende un anillo ciclobutano generado por enlaces entre los átomos de carbono
5 y 6 de timinas contiguas. En el caso de una timina adyacente a una citosina, la fusión resultante es un aducto
timina-citosina en el que la timina está unida por su átomo de carbono 6 al átomo de carbono 4 de la citosina.
Estas bases unidas entre sí son incapaces de aparearse con sus complementarias y hacen que la DNA
polimerasa se detenga durante la duplicación.
En el caso de hidroxilamina (HA) que es especifica de citosina, esta molécula hidroxila grupos 6-amino de la
citosina; causa transiciones GC – AT.
Los efectos de las mutaciones pueden revertirse, la posibilidad de mutaciones de reversión, o revertientes es
una característica importante que distingue las mutaciones puntuales y las inserciones de las deleciones.
Las mutaciones que inactivan un gen se llaman mutaciones primarias o directas. Sus efectos son revertidos
por retromutaciones, que son de dos tipos: reversiones verdaderas y reversiones de segundo sitio.
Una reversión exacta de la mutación original se llama reversión verdadera. Así, si un par A-T fue reemplazado
por un par G-C en la mutación original, otra mutación que restablezca el par A-T regenerará exactamente la
secuencia original. La remoción exacta de un elemento de transposición después de su inserción es otro
ejemplo de reversión verdadera.
El segundo tipo de retromutación, la reversión de segundo sitio, puede ocurrir en cualquier lugar del gen, y sus
efectos compensan los de la primera mutación. Por ejemplo un cambio de un aminoácido en una proteína puede
suprimir su función, pero una segunda alteración puede compensar la primera y restablecer la actividad de la
proteína. Una mutación directa produce cualquier cambio que altera la función de un producto génico, mientras
que una retromutación debe restablecer la función original del producto alterado. Por lo tanto, las posibilidades
para las retromutaciones son mucho más restringidas que para las mutaciones directas.
Resultados.
Se presenta la producción de mutantes de la cepa Escherichia coli W3350 mediante el tratamiento
con hidroxilamina y luz ultravioleta, así como el número de revertantes utilizando diferentes agentes
mutágenicos, con los que caracterizara el tipo de lesión que produjeron la hidroxilamina y la luz
ultravioleta.
Tabla 1. Obtencion de mutantes de la cepa Escherichia coli W3350 de la sección 2 del grupo 5QM2
mediante el tratamiento con Hidroxilamina a diferentes concentraciones.
Del número de colonias sobrevivientes y número de mutantes obtenidos por la cepa Escherichia coli
W3350 del equipo 8, después del tratamiento con Hidroxilamina a diferentes concentraciones se
procede a calcular los títulos de células viables para cada uno, de la siguiente manera:
1 1
UFC/mL= 128 x 0.1 x = 1.28x109
1x10−6
*De la misma manera se calculará el número de células viables para las demás concentraciones con
hidroxilamina, modificando el número de colonias y diluciones respectivamente.
Tabla 2. Generación de revertantes después del tratamiento de HA con los diferentes mutagenos de
la cepa Escherichia coli W3350 de la sección 2 del grupo 5QM2
Hidroxilamina
Equipo Str 9-AA 5-Bu NG HA Agua
8 SR SR SR R R SR
10 SR SR SR R SR SR
12 SR SR SR R R SR
Str: Estreptomicina; 9-AA: 9-aminoacridina; 5-Bu: 5-bromouracilo NG; Nitrosoguanidina HA: Hidroxilamina;
SR: Sin reversión; R: Reversión.
Figura 1. Curva de Dosis-Respuesta de Escherichia coli con tratamiento de Hidroxilamina a diferentes
concentraciones obtenida por el equipo 8 de la sección 2 del grupo 5QM2.
120
100
100
80
% Sobrevivencia
60 44.53
40
20
0.84 0.97 0.46
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
-20
[HA]
Figura 2. Supervivencia de células en función del tiempo o duración del tratamiento con un agente
que lesiona el DNA. La meseta de la línea azul representa los mecanismos de reparación activados
en el DNA.8
Tabla 3. Obtención de mutantes de la cepa Escherichia coli W3350 de la sección 2 del grupo 5QM2
mediante el tratamiento con ultra violeta a diferentes tiempos de exposición.
Equipo Tiempo de # Colonias # Mutantes Título de Título de %
exposición sobrevivientes sobrevivencia mutantes Sobrevivencia
10-5 10-6 10-5 10-6
7 0” 55 61 11 9 0 0 0 0 5.8x107 <1x10-5 100
15” 37 35 2 1 0 0 0 0 4.4x107 <1x10-5 62
30” 36 39 1 3 1 0 0 0 3.75x107 5x105 64
45” 12 4 1 2 0 0 0 0 7x106 <1x10-5 13
60” 10 -4 10-5 10-4 10-5
15 5 1 2 0 0 0 0 1x106 <1x10-5 2
9 0” 300 383 21 18 0 0 0 0 3.41x108 <1x10-5 100
15” 56 39 4 4 0 0 0 0 4.75x107 <1x10-5 13.91
30” 13 25 1 0 0 0 0 0 1.9x107 <1x10-5 5.56
45” 7 8 2 0 0 0 0 0 7.5x105 <1x10-5 2.19
60” 10 -4 10-5 10-4 10-5
7 5 0 1 0 0 0 0 6x105 <1x10-5 0.18
11 0” 45 32 3 7 0 0 0 0 3.85x107 <1x10-5 100
15” 10 4 0 0 0 0 0 0 7x106 <1x10-5 18.18
30” 5 4 1 0 0 0 0 0 4.5x106 <1x10-5 11.18
45” 3 0 1 0 0 0 0 0 1.5x106 <1x10-5 3.89
60” 10-4 10-5 10-4 10-5
3 14 0 0 0 0 0 0 8.5x105 <1x10-5 2.20
Tabla 4. Prueba de revertantes de la cepa Escherichia coli W3350 mediante el tratamiento con luz
ultravioleta.
Luz UV-Vis
Equipo Str 9-AA 5-Bu NG HA Agua
7 SR SR SR SR SR SR
9 SR SR SR SR SR SR
11 SR SR SR R SR SR
Str: Estreptomicina; 9-AA: 9-aminoacridina; 5-Bu: 5-bromouracilo NG; Nitrosoguanidina HA: Hidroxilamina;
SR: Sin reversión; R: Reversión.
Ejercicio 1. Determinar la frecuencia de mutagénesis de acuerdo a la fórmula del manual7 usando el
porciento de sobrevivientes determinado en la Tabla 1 del equipo 8.
Tiempo de
[HA] exposición con # Mutantes Promedio Título de Título de
luz U.V (seg) 10-3 mutantes sobrevivientes
0 0 0 1 0.5 5x103 1.28x109
0.2 15 1 2 1.5 1.5x104 5.7x108
0.4 30 1 2 1.5 1.5x104 1.09x107
0.6 45 3 2 2.5 2.5x104 1.25x107
0.8 60 1 1 1 1x104 5.9x106
Cálculos
Título de mutantes
FM = 𝑇í𝑡𝑢𝑙𝑜 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑏𝑟𝑒𝑣𝑖𝑣𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒𝑠
5𝑥103 2.5𝑥104
FM0 = 1.28𝑥109= 3.90x10-6 FM 0.6 = 1.25𝑥107 = 2x10-3
1.5𝑥104 1𝑥104
FM 0.2 = 5.7𝑥108=2.63x10-5 FM 0.8 = 5.9𝑥106= 1.69x10-3
1.5𝑥104
FM 0.4 = 1.08𝑥107=1.38x10-3
0.002
Frecuencia de Mutación
0.0015
0.001
0.0005
0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
-0.0005
[HA]
Discusión.
Los tres genes lac-lacZ, lacY y lacA- se distribuyen en el genoma de Escherichia coli, los cuales participan en
el metabolismo de la lactosa. Estos genes se expresan en grado alto sólo cuando en el medio hay Lactosa y la
glucosa no está disponible. El gen lacZ codifica la enzima β-galactosidasa, que escinde el disacárido lactosa
en disacárido galactosa y glucosa, para que la célula las utilice como fuentes de energía. El gen lacY codifica
la lactosa permeasa, una proteína que transporta la lactosa hacia el interior de la celula. El gen lacA codifica
tiogalactosidos tóxicos que también transporta el producto del gen lacY.3 Las mutaciones de lacZ o lacY pueden
crear un genotipo lac que se caracteriza por la imposibilidad de las células de utilizar lactosa. 2 En el caso de
una mutante por el tratamiento de HA que es especifica de citosina, esta molécula hidroxila grupos 6-amino de
la citosina; causa transiciones GC – AT, por lo que estas transiciones pueden afectar a cualquiera de estos
genes impidiendo que la bacteria degrade la lactosa. Para demostrar el efecto revertante se vuelve a inducir un
reversión con diferentes tratamientos de mutagenos entre los que usamos fueron: los análogos de base (5-
bromouracilo y 2-aminopurina) que inducen mutaciones debido a que presentan cambios tautomericos, con una
mayor frecuencia que las bases nitrogenadas normales. Los agentes modificadores (ácido nitroso,
hidroxilamina) cambian la estructura química de las bases nitrogenadas mediante procesos de desaminacion,
hidroxilacion, entre otros. Los agentes alquilantes (nitrosoguanidina) introducen grupos metilo o etilo en las
bases del ADN. El efecto mutagenico de los agentes modificadores y alquilantes se produce como
consecuencia del cambio del patrón de apareamiento de bases. Los agentes intercalantes (9-aminoacridina)
son moléculas planas que se introducen entre los pares de bases distorsionando la copia complementaria de
bases durante la replicación generando inserciones y delaciones de bases. La radiación ultravioleta origina
dímeros de pirimidina y 6-4 fotoproductos intra e intercatenarios.4 En el equipo 8 hubo reversión con
nitrosoguanidina e hidroxilamina en el medio mínimo lactosado donde hubo crecimiento alrededor del disco de
papel filtro con dichas soluciones impregnadas (Tabla 2). Por lo que se puede deducir que la HA y la
nitrosoguanidina son mutagenos que causan sustituciones, es decir, transiciones entre pares de bases.
La frecuencia de mutación nos indica la proporción de mutantes en una determinada población, está puede
aumentarse significativamente con el uso de agentes mutagénicos, como se interpreta en el Ejercicio 1. En
este se determinó la frecuencia de mutación conforme al título de mutantes y título de sobrevivientes calculados;
en donde se observa que la mayor frecuencia de mutaciones inducidas es a mayores concentraciones de HA
(Figura 3). Una manera de disminuir la frecuencia de mutación es por medio de mecanismos como la
fotorreactivación, esto se debe a la activación de una enzima llamada fotoliasa, que corta los dímeros de
timina en presencia de luz.
Conclusiones
Bibliografía.
1. Herráez, A. (2012). Biología molecular e ingería genética. México: ELSEVIER. Pág(s).381-391.
2. Krebs, J. (2012). Lewis genes: fundamentos. Buenos Aires: Medica Panamericana. Pág(s).15-26, 298-
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3. Watson, D. (2016). Biología molecular del gen. Buenos Aires: Medica Panamericana. Pág(s).320-325,
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4. Andrioli, N., (2011). Evaluación de agentes químicos con potencial genotóxico en células
meristemáticas de Alliumcepa (Tesis doctoral). Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad
de Buenos Aires.
5. González, A. (1994). Los efectos biológicos de las dosis bajas de radiación ionizante: Una visión más
completa. Informes Especiales., (60), pp39-40.
6. Gary, P. (2017). Koneman: Diagnostico microbiológico. México: Walters Kluwer. Pág(s). 212.
7. Espinoza, A. Hernandez, M. Valdivia, G. Villa, M. (2018). Experimentos en genética
microbiana. México: Escuela Nacional de Ciencias Biologicas. Pág(s) 1-11.
8. Snyder, L. Peters, J. (2013). Molecular genetics of bacteria. Washinton D.C: ASM PRESS. Pág(s).434-
435.