Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Departamento de Bioquímica

Laboratorio de Métodos de Análisis

Grupo: 5QM2 Sección: 3

Profesor:Gabriela Ruiz Olguín

Práctica

DETERMINACIÓN DE PROTEINAS POR EL MÉTODO

DE
LOWRY Y DE BRADFORD

Fecha: 06/03/18

OBJETIVOS
  Elaborará una curva de calibración para la cuantificación de proteinas empleando un método
fotométrico.
 Determinara si hay diferencia estadísticamente significativa entre la precisión y la exactitud
entre los métodos de Bradford y Lowry.
 Conocerá el efecto de sustancias no proteínicas, en el desarrollo del color .
 Analizara las ventajas y desventajas del método de Lowry ,con respecto a otros métodos para
cuantificación de proteinas.
 Determinará las ventajas y desventajas estadísticamente significativas en la presicion y la
exactitud respecto al método de Lowry.

RESULTADOS

Método de Lowry

Tabla 1. Curva de calibración de albumina método de Lowry.

Tubo No. Cantidad de proteína A590

(ug)
Serie a Serie b

1 25 0.066 0.090

2 50 *0.124 *0.139

3 75 0.145 *0.159

4 100 0.181 *0.200

5 125 0.247 *0.215

*Valores tomados para realizar la ecuación de la recta.

Ecuación de la recta:

 B (ordenada)= 0.0734
y = 0.0017x + 0.0734  A (pendiente)= 1.17x10-3
 r= 0.9809

Cantidad de proteinas :
𝑦 − 0.0734
𝑥=
1.17𝑥10−3
 0.3

0.25

0.2
Absorbancia (nm)

0.15

0.1

0.05

0
0 20 40 60 80 100 120
Cantidad de proteína (ug)
Grafico 1. Curva de calibración de la albumina

Tabla 2. Replicas para el análisis estadístico método de Lowry.

Tubo No. A590 Cantidad de proteína (ug)

1 0.137 54.17

2 0.141 57.58

3 0.147 62.69

4 0.132 49.91

5 0.140 56.72

6 0.156 70.35

7 0.145 61.83

8 0.141 57.58

9 0.131 49.06

10 0.143 59.28
Tabla 3. Resultados del análisis estadístico

X S S2 %C.V. u

57.92 6.26 39.19 10.81 72.08 – 43.76

Tabla 4. Efecto de algunas sustancias no proteínicas en el método de Lowry.

Tubo No. Sustancia A590 Cantidad de proteína Tipo de

(ug) interferencia
generada
1 Tris 1M, pH 7.0 0.123 42.25 -
2 Glicerol al 1% (v/v) 0.179 89.95 +
3 Detergente comercial al 1% 0.175 86.54 +
4 Dodecil sulfato de sodio 0.160 73.76 +
(SDS) al 1.0%
5 Ácido tricloroacético (TCA) al 0.185 95.06 +
5%

Método de Bradford

Tabla 1. Curva de calibración de albúmina Método Bradford.

Tubo No. Cantidad de proteína A590

(ug)
Serie a Serie b

1 25 *0.240 *0.259

2 50 *0.390 *0.394

3 75 0.707 0.566

4 100 *0.708 *0.586

5 125 0.658 *0.696

*Valores tomados para la curva

Ecuación de la recta:
A (Pendiente)= 4.76x10-3
y= 4.76x10-3x – 0.1441 B (Ordenada) = 0.1441
 0.8

0.7

0.6
Absorbancia (nm)

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0
0 20 40 60 80 100 120
Cantidad de proteína (ug)

Grafico 1. Curva de calibración de albumina por el método de Bradford.

Tabla 2. Replicas para el análisis estadístico método de Bradford.

Tubo No. A590 Cantidad de proteína (ug)

1 0.480 70.57

2 0.500 74.64

3 0.498 74.22

4 0.480 70.44

5 0.488 72.25

6 0.495 73.72

7 0.513 77.50

8 0.492 73.09

9 0.479 70.36

10 0.479 70.36
Tabla 3. Resultados del análisis estadístico

X S S2 %C.V. u

72.71 2.38 5.68 3.27 78.09 – 67.33

Tabla 4. Efecto de algunas sustancias no proteínicas en el método de Bradford

Tubo No. Sustancia A590 Cantidad de proteína Tipo de

(ug) interferencia
generada
1 Tris 1M, pH 7.0 0.493 73.17 0
2 Glicerol al 1% (v/v) 0.546 84.28 +
3 Detergente comercial al 1% 0.217 15.31 -
4 Dodecil sulfato de sodio 0.136 -1.70 -
(SDS) al 1.0%
5 Ácido tricloroacético (TCA) al 0.481 70.78 0
5%

Tabla 5.Diferencias entre precisión y exactitud de los métodos Lowry y Bradford.

Tubo no. Prueba Prueba Diferencia Di – D (Di – D)2

Bradford Lowry individual (Di)

1 70.57 54.17 16.40 1.60 2.56

2 74.64 57.58 17.06 2.26 5.11

3 74.22 62.69 11.53 -3.27 10.69

4 70.44 49.91 20.53 5.73 32.83

5 72.25 56.72 15.53 0.73 0.53

6 73.72 70.35 3.37 -11.43 130.64

7 77.50 61.83 15.67 0.87 0.76

8 73.09 57.58 15.51 0.71 0.50

9 70.36 49.06 21.3 6.5 42.25

10 70.36 59.28 11.08 -3.72 13.84

 Formulas empleadas

 Prueba t- Student:
∑(𝐷𝑖−𝐷)2
SD= √ SD= 5.16
𝑛−1

9.07 > 2.262

Ttabla= 2.262
Si hay diferencia significativa
(𝐷)(√𝑛)
Tcalculada= Tcalculada= 9.07 entre la exactitud de los
𝑆𝐷
métodos .

 Prueba F-Fisher
𝑆𝑏2
Fcalculada= 2 Fcalculada= 6.89 6.89 > 4.03
𝑆𝑎
Ftabla=4.03 Si hay diferencia significativa entre la
precisión de los métodos .

ANALISIS DE RESULTADOS
La comparación entre los métodos de Bradford y Lowry para identificar proteínas teóricamente el
método de Bradford es 4 veces más sensible que el método de Lowry, es decir, que el mínimo error
como por ejemplo de medición de los reactivos este método presentara resultados con varianzas y
desviaciones estándar con valores altos. También se observó que en el método de Bradford los
aminoácidos contenidos en la proteína no influyen en el método, a comparación de Lowry que solo los
aminoácidos triptófano y tirosina de anillos aromáticos darán la coloración y con base a esta observar
que longitud de onda emite.

Como se puede observar en la tabla 1 de Lowry y 1 de Bradford para realizar la curva de calibración
de la proteína se descartaron algunos datos que se generaron por errores sistemáticos por parte del
analista, mismos que se pueden evitar cuidando por ejemplo la medición del reactivo colocando la
pipeta a la altura de los ojos para así observar el menisco se encuentre arriba de la escala de medición
de la pipeta, también evitando en volúmenes pequeños de muestra que no resbale por las paredes
del tubo de ensayo para así no perder volumen de la muestra.

Este error se corrigió en el método de Bradford colocando parafina en la boca del tubo y agitando por
así se evita que quede muestra en las paredes del tubo y que se genere un error.

Así también el método de Bradford es más probable que no se presenten muchos errores ya que solo
es de un paso y Lowry se realiza en dos etapas.
Al realizar los análisis estadísticos de ambos métodos se logró observar que hay una diferencia grande
entre el coeficiente de variación de los dos métodos, mejorando la precisión del analista en el método
de Bradford, también se logro observar por medio de la desviación estándar que en el método de
Lowry los puntos se encontraban mucho más dispersos que en el método de Bradford.

Se observa que el tris, el detergente comercial y el acido tricloroacetico son interterentes negativos por
que hay una disminución de la concentración de la proteína, mientras que el glicerol y el SDS
aumentan la concentración de proteína por lo que son interferentes positivos.

El glicerol y el SDS presentan interferencias positivas , esto se puede deber a que las sustancias
tengan propiedades similares a la proteína, por lo que la absorbancia será mayor y en consecuencia
se leerá mayor concentración de proteína. El glicerol, el detergente y el TCA son interferentes
negativos, esto se puede deber a la reacción de las sustancias con la albumina, disminuyendo la
absorbancia.

CONCLUSIONES

 Hay diferencia estadísticamente significativa entre la exactitud de los métodos.

 Hay diferencia estadísticamente significativa entre la precisión de los métodos.
 La cantidad de proteína puede verse afectada por compuestos parecidos o no a
los aminoácidos presentes en la proteína.
 Los métodos colorimétricos son menos sensibles ya que dependen mucho del
analista.
 Los métodos espectrofotométricos son más sensibles.

BIBLIOGRAFIA

 http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/MATERIALAPOYOANTECEDEN
TES_22427.pdf

 https://books.google.com.mx/books?id=R3Hn3NMt0zsC&pg=PA57&dq=metodo+
de+lowry&hl=es&sa=X&ved=0ahUKEwiR5YGnwKrLAhUKnoMKHXlaD1cQ6AEIK
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