Ingenieria bioquimica Teoria y aplicaciones Rodolfo Quintero Ramirez , Departamento de Biotecnologia Instituto de Investigaciones Biomédicas Universidad Nacional Autonoma de México Abts | avHamaral 183 Pe ett seo icc: tes aus te meee in Moe Ba naeas B Tet oct ee es aoe eine A us age tte tae, tre Bee se " Tar ca o turlae sani ra Penatians ee 190 Audie 130 natn I32 an 132 II Teeadogin emi Hern eon, 138 Te eae 136 ieecanes 28 mee Ed ea soe I pate ance Vacca 223 Rendimiento del sustrato (Y,) 233 cue 2a Fae iicnee eH He ec rrea os renin Secon) 3 Rondinent eos (hy ae on wate 8 2s weno 2 nema i 0 Chin ezimtica 2 io 3 fone cheat 3 Indice gonorat Bfecto de la temperatura en la actividad enzimatica y cn Ia actividad inicial Efecto de la temperatura en Ia estabilidad de Jas enzimas. Efecto del pH en la actividad enzimatica Efecto de la concentracién del sustrato en a actividad | cenzimética isi Modelo sin inhibicion Inhibici Otros factores que aiecian la acti Nomenclatura. Referencias fda enzimstica - © Tratamiento de aguas por métoosbolicos Parametros de medicion ‘Tratamiento preliminar. ‘Tratamiento primario ‘Tratamiento secundario Lagunas de oxidacion Filtros biol6gicos. Lodos activados , ‘Tratamiento terciario Caracteristicas generales de la oxidacién biolégica ‘Modelos matemiticos y sistema de disefio Ottos usos de los lodos activados Tanques y equipa utilizados en lndos activados Avances tecnologicos en el tratamiento secundario. Nomenclatura Referencias D__Conamo de enema por agiacio y aercin on stemas de fermentacion Consideraciones tebricas Potencia absorbida en fluidos sin aeracion Potencia absorbida en fluidos con aeracién. ... . Potencia necesaria para agitar liquidos no newtonianos. Enerpia transmitida de la fase gaseosa al liquido ‘Nomenclatura. Referencias Determinaci fermentacién Medicién indireeta. ‘Oxidacion de sulfito, ‘Técnica de eliminacion de gas Medicién directa . Balance de oxigeno en el sistema ‘Técnica dinémica (régimen no estacionario) Tiempo de respuesta. : Nomenclatura. Referencias . experimental de la transferencia de oxigeno en wna 1a 234 234 236 236 246 246 246 247 248, 250 250 250 251 251 252 252 252 253 261 263 264 266 267 269 270 2 274 216 a7 279 279 281 282 283, 283, 284 284 286 288 291 2924 Indice generat F Métodos de inmovilizacion enzimitica ‘Via grupo diazonio de grupos amino arométicos Via grupo isotiocianato por tratamiento de grupos can tiofosgeno Via grupo acil-azida por tratamiento de hidrazina con dcido nitroso Via grupo imido earbonato por reaccién con bromuro de cizndgeno con grupos hidroxilo . Via grupo cloruro activo. Via grupo dcido carboxilico activado con N,N.diciclo hexilearbodimida : Via grupo Sido carboxilico setivado con el reactive K de Woodward. . ‘Via copolimero de etileno y anhiidrido maleico ‘Activacién de soportes por la reacci6n de Usi Activacion de soportes por sales de metales de transicién ‘Via grupo carbonatos ciclicos introducidos por la reaccién de cloroformato de etilo con grupos hidroxilo Via floruro de arilo Via grupo bromuro de alquilo Via grupo dcido carboxilico activado con sulfonato de L-ciclo- hexil 3(2-morfolinoetil).carboimida meto-p-tolueno Referencias G_ Problemas Introduccién Crecimiento microbiano Cinética de fermentaciones Cultivo continuo ‘Transferencia de masa . Escalamiento de fermentaciones, Métodos de esterlizacion del medio de cultivo y del aire. Procesos de separacin y purificacion Proteina unicelular. Aspectos generales Proteina microbiana a partir dela cana de azticer y Sus subproductos . ‘Tecnologia enzimitica . Balance de materia y energia en fermentacion Cinética enzimitica Tratamiento de aguas por métodos biol6gicos Consumo de energia por agitacién y aeracién en sistemas de fermentacion % Determinacién experimental de la transferencia de oxigeno en ‘una fermentacién . Métodos de inmovilizacion enzimatica Indice analitico. 293 294 295 296 297 297 298, 299 299 300 300 301 301 302 302 302 305 305 305 306 307 309 310 31 313 314 315 317 318 319 320 323, 324 326 327 1 Introduccién EI cultive de microorganismos, tanto en el laboratorio como en Ia industria, hia sido tratado més coma un arte que como una ciencia, y a menudo empleando la intuicién en lugar de la l6gica. Este estudio tiene como fin fundamental presentar los principios de operacién y control de la fermenta cidn, con objeto de que investigadores y estudiantes del campo tengan un marco comtin, necesario pata unificar y facilitar el avance cient teenoldgico del cultivo microbiano y de sus aplicaciones, La ingenieris bioquimica ha suigido como resultado de la interacciGn de la bioguimica, la genética, la microbiologia y la ingenieria quimica, y es a ella a quien concierne el estudio y la utilizacion de los microorganismos y sus productos. A Aiba ef al.1 se debe una definicién aceptada de esta disciplina: Singenierfa bioquimica es la actividad que se ocupa del procesamiento econdmico de materiales de cardeter w origen biol6gico con propésites itiles. La funcidn del ingeniero bioquimico es aplicar en la prictica los conocimien: tos del mictobiélogo y del bioquimico, Para levar a cabo esta tarea, el ingeniero bioquimico debe no solamente tener bases sélidas en los principios bisicos de ingenierfa, sino conocer las ciencias biolégicas.” Sin embargo, esta definicién cualquier otra de las que se han dado, indica dnicamente el ontexto general de la’ ingenieria bioquimica, porque slo a través de su estudio se logra conocer sus aleances e importancia. A continuacién se presentan algunos aspectos generales de la fermentacidn, que consideramos DESARROLLO HISTORICO Desde hace miles de anos el hombre ha utilizado los métodos biol6gicos para produeir y contervar sus alimentos y también para obtener productos que le hhan ayudado a mejorar su salud (por ejemplo, antibidticos y vitamninas) 0 le Ls)“ Indice general F _Métodos de inmovilizacién enzimitica a 1 ‘Via grupo diazonio de grupos amino aromiticos .... ..« . ‘Via grupo isotiocianato por tratamiento de grapos con tiofosgeno Via grupo acil-szida por tratamiento de hidrazina con écido nitroso Via grapo imido carbonato por reaccién con bromuro de ciandgeno ‘con grupos hidroxilo . Via grupo cloruro activo... ...- i Via grupo écido carboxlico activado con N.Ndiciclo hexilcarbodimida ...... « x ‘Via grupo deido earboxilico activado con el reactivo K de Woodward ‘Via copolimero de etileno y anhidrido maleico, Activacién de soportes por la reacci6n de Ugi ‘Activacion de soportes por sales de metales de transicion, Via grupo carbonatos efelicos introducidos por la reaccién de cloroformato de etilo con grupos hidro» Via floruro de arilo ‘ Via grupo bromuro de alquilo en \Via grupo dcido carboxilico activado con sulfonato de I-ciclo- hhexil 3(2-morfolinoetil).carboimida meto-p-tolueno Referencias 4 G_Problemas Introduccion a Crecimiento microbiano Cinética de fermentaciones . Cultivo continuo... ‘Transferencia de masa Escalamiento de fermentaciones. 2... « Meétodos de esterilizaciOn del medio de cultivo y del aire. Procesos de separacion y purificacion ‘ Proteina unicelular. Aspectos generales a Proteina mierobiana a partir do la cafla de aztcar y sus subproductos ‘Tecnologia enzimitica . en fermentacion Cinética enzimatica : ‘Tratamiento de aguas por métodos biol6gicos Consumo de nee por again yaercin en stemas de fermentacién ie ~Aiaes Determinacién experimental de la transferencia de oxigeno en. una fermentacién : i Métodos de inmovilizacién enzimatica.. Indice analitico. 293 294 295 296 297 297 298 299 299 300 300 301 301 302 302 302 305 305 306 31 Introduccién I cultivo de microorganismos, tanto en el laboratorio como en la industria, ha sido tratado més como tn arte que como una ciencia, y a menudo empleando a intuicién en lugar de la logica. Este estudio tiene como fin fundamental presentar los principios de operacion y control de la fermmentar cidn, con objeto de que investigadores y estudiantes del campo tengan un marco’ comin, necesario para unificar y facilitar el avance cientifico y ‘eenol6gico del cultivo microbiano y de sus aplicaciones; ‘La ingenieria bioguimica ha surgido como resultado de la interaccién de la bioguimica, Ia genética, la microbiologia y le ingenieria quimica, y es a ella a ‘quien concierne el estudio y la utilizacién de los microorganismos y_ sus broductos. A Aiba e¢ al.| se debe una definicién aceptada de esta disciplina [Ingenieria bioquimica es la actividad que se ocupa del procesamiento econémico de materiales de_cardcter w origen biol6gico con propésitos ‘tiles. {La funciGn del ingeniero bioquimico es aplicar en la prictica los conocimien- tos del microbidlogo y del bioguimico. Para llevar a cabo esta tarea, cl ingeniero bioquimico debe no solamente tener bases s6lidas en los principios basicos de ingenierfa, sino conocer las ciencias bioldgicas.” Sin embargo, esta definicion © cualquier otra de las que se han dado, indica iinicamente el ontexto general de la. ingenieria bioquimica, porque solo a través de su estudio se logra conocer sus sleances e importancia. A continuacién 9 presentan algunos aspectos generales de la fermentaciOn, que consideramos necesario meneionar. DESARROLLO HISTORICO Desde hce miles de anos el hombre ha utilizado los métodos biol6gicos para producir y conservar sus alimentos y también para obtener productos que le han ayudado a mejorar su salud (por ejemplo, antibidtieos y vitaminas) o le us,ih Introduecién haan procurado algin gusto (entre otros, sborizantes y bebidas aloohslias). Se recomienda revisar los tratados generales de microbioloaia y_ferments- idnl- a todos aquellos que estén interesados en ese desarrollo histérico, Los principios de Iz microbiologia industrial fueron establecidos cuando Pasteur, a mediados del siglo pasado, demostx6 indiscutiblemente que la fermentacién aleohdlica era. producida por levaduras. Desde ese. momento hasta la segunda guerra mundial s» dosarrollaron muchos proeesos industriales de fermentacin, fundamentalmente las diferentes fermentacionesalcohlices y Ia produccion de acidos acético, Mccoy citrico, asi como Ia de slicer, acetona y butanol. Los procesos tipieos utilizados durante ese periodo fueron el cultivo sumergido anaerdbico y el cultivo en superficie aerdbico, Sin embargo, debido a la necesided apremiante de producir antibiétioos durante la guerra,6 hubo que utilizar un proceso industrial més ripido y eficiente que los comtinmente utiizados; éste fue el cultivo sumergido aerdbico en tenques agitados. No cabe duda de que lo anterior produjo el estimulo necesario para due surgera I ingenieria bioquimica, pues se hizo evidente la necesidad y las posibildades de aplicar los principios tecnoldgicos de ingenierfa ala fermenta- €i6n, y de combinarlos con el conocimiento biolégico, Entre los decenios cuarenta y cincuenta se lograron grandes vances {ecnolégicos en el cultivo microbiano, y se desarroll6 el fermentador agitado con controles automiticas para preservar las condisiones adecuadas de la fermentacién, La mayoria de los procesos.utilizados en eta época son aerdbioos y operan de manera discontinua (en forma de lote, 0 proceso Datel El Oltimo decenio ha visto el desarrollo y establecimiento de Los procesos aerébicos continuos. Dos han sido las dreas que en estos aflos han tenido avanees importantes: la produccién de proteina microbiana* y la tecnologia enzimdtica. La primera surpié como respuesta a la gran demanda y necesidad de producir alimentos baratos ya gran escala, y al encontrarse que, las camteristicasmicrobianas (Corto tiempo de duplicacién, alto contenido proteieo y no dependencia de las condiciones climatoldpicas), presentan srandes ventajas respecto a otras fuentes de proteina, La tecnologia enzimatica ha recibido un gran impulso debido a que. sus posibilidades de aplicacién en el érea médica y de alimentos son muy prometedoras. En ambas éreas se han registrado importantes avances debido al gran mimero de investigadores que han dedicado su esfuerzo a resolver los problemas interdsciplinaros surpidos durante su desarrollo, haciendo de llas campos interesantes eintelectualmente atractivas Pero la ingenieria bioquiinica no sélo ha avanzado y tenido éxito en procesos.industriles, sino que ha contribuido al mejor entendimiento del ‘metabolismo microbiano al utilizar la técnica de cultivo continuo que somete a un microorganismo a diferentes condiciones ambientles constantes. por latgos periods y estudia los cambios que a nivel celular ocurren cuando el medio ambiente varie. Los aspectos cinéticos han adquirido importancia y, en * Se denomina indistintamente proteina microbians, proteina unicelular 9 Womasa al producto que s obtiene del erecimiento de microoanismes (y que son ellos mismoe) Peden sex bacteria, levadums u hongos que utlizan para creer dversos sustatos en un cultivo aer6bice, con fines do allmentaci Proceso de fa fermentacién ” particular la cinética enzimética, que considera los efectos de difusion y de Giseto de reactores, ha permitido un conocimiento mds extenso y profundo del problema general de la catdlisis. Estos son s6lo dos ejemplos de los logros tientificos alcanzados; la mejor muestra de la importancia presente y futura que tiene Ia fermentacién es la proliferacién de la Literatura relacionada y el fstablecimiento de grupos de investigacion cientifica e industrial dedicados a ‘abajar en el rea, Es muy dificil indicar qué areas se seguirén desarrollando ‘0 surgirin en los prximos alos, pero entre las que parecen mas probables estan: te aplicacion de la técnica de cultivo continuo a diferentes tipos de fermenta- ciones, el diseiio de mejores procesos de separacién y purificacién (utilizacion de la proteina unicelular por humanos), la fermentacién anaerdbica (principal- mente produecion de metano), el desarrollo del cultivo de tejido celular animal y ‘vegetal (hormonss) a nivel industrial, la aplicacion en la préctica de la ingenieria ‘penética, la utilizacién de desperdicios agricolas c industriales como sustratos de fermentaciin, ¥ la disminueion y control de la contaminacién ambiental PROCESO DE LA FERMENTACION Las industrias de procesos bioguimicos se encargan del aprovechamiento, bajo ‘condiciones controladas, de materiales biologicos tales como microorganisms, fejido celular animal, productos microbianos y enzimas. Los procesos asoci dos con la produccién. de microorganismos y de algunos productos especificos son importantes comercialmente. Como todos los sees vvos, ls mieroorgamismos eréen, se reproduce y segregan algunos compuestos bioquimicos de importancia para el hombre. Estas son las caracterfsticas en que se ha basado 1a utilizacién de los microorganismos como productores de fermentacién, a que de una manera fesquemitica se puede representar ast ‘CONDICIONES ANDIENTALES MICROORGANISMOS —_-ELEMENTOS NUTRIENTES ‘ADECUADAS fe). (=) | taj celular, ve = FFermentaciGn* Microorganismos + CO, + Productos (intra y extracellares) * Cuando se provee de oxigeno molecular al sstoma, la fermentacién se denomina aecSbicsy hay deaprondimiento d= CO, ; cuando cl oxigeno molecular esd ausente, se deno- ‘mina anaerdbic, decir, que para que una fermentacién se realice son necesarios los siguientes requisitos: tener un microorganismo de caracteristicas idneas para fl proceso y/o producto particular, prover un medio de eultivo adecuado (que contenga todos fos nutrientes esenciales en las proporciones y cantidades Sptimas de producciin) y, finalmente, establecer y controlar las condiciones8 Introduccién Fisicoquémicas necesarias para el desarrollo de la fermentacién. Como resultado se obtendrd una cantidad de microorganismos mayor que la inicialy diversos productos (antibidticos, esteroides, enzimas, cides orginicos, ete.). Todas estas variables son las que interaccionan y deben optimiearse para lograr un proceso adecuado. En el caso de la proteina microbiana, por ejemplo, lo que se pretende es obtener la cantidad méxima de células y minimizar’ la productién de CO; 0 de cualquier otro producto extracelular; en la produce cidn de antibidticos, por el contrario, se trata de obtener el maximo de productos especificos extracolulares. No debe olvidarse, sin embargo, que un proceso de fetmentacién compren- de, en un sentido més amplio, no s6lo las reacciones bioquimicas efectuadas peor mtootgenios yfo por enzimas sino qu ademds consider Tas erate Teas fies y de operacin del recpinte en done so leva a cabo. cel Fermentador~”y as operaciones que’ we fectin antes y dspuds Jel fermentacin, La figura 11 presenta el diagrama de flyjo de una fermentacin Tipe. Se pueden dating fret der principales botstona fermenticon exracelén. Cai una de estas eas ert explctde detaladamente eh Tor Siguintes capitulo, pero debe hacertehincaple en que today elas funconsn 1nd de re en 1 cop raductor cong a Sa dose 2 Grecmento ane Envadangusseentionionto 3 Mavaragtado de culo © Sade crams a reece eit © Adlon El, aly 5 Earmentaor pine ibrar 8 Fra ratone ect F Biomasa (micelio) 7 3 & Deirion : H Ser ° Suctn 10 Eremaie de prec Figura 1.1. Diaprama de flujo de un proceso sipico de fermentacién ‘Microorganismos en ta fermentacion 19 como un todo y. aunque para su estudio se dividan, al evaluarse una fermentacidn siempre deberd tenerse en mente la totalidad del proceso. Los eapitulos de este estudio han sido. preparados de acuerdo con las necesidades los problemas que se presentan en el desarrollo de una fermentaciGn a escala de laboratorio e industrial. El capitulo dos se refiere a la preparacién del medio de cultivo y a las condiciones fisicoquimicas necesarias para obtener un producto deseado con un rendimiento elevado. Los capitulos fres y cuatro analizan la cinética de la fermentaciGn y de sus productos en sus formas de operacién més comunes: batch y continua. Los capitulos cinco y seis presentan el problema de diseno de fermentadores, de transferencia de masa y c6mo se emplean los resultados de Laboratorio, cuando se pasa a escala industrial, El capitulo siete trata del problema de la esterilidad del medio. de cultivo y del aire, la cinética de ésta y_sus efectos en la fermentacion. En el capitulo ocho se estudia In separacion y extraccién de productos y se indiean los diferentes métodos empleados y cuil es el criterio de seleccién. En los ‘capitulos nueve y diez se analiza el problema de la proteina unicelular y sus diversas soluciones posibles: bacterias, levaduras, hongos, ete., asi como los diferentes sustratos utilizados: n-parafinas, metanol, melazas, celulosa, etc Finalmente, el capitulo once constituye una introduccién a Ia tecnologia ‘enzimatica en sus diversos aspectos. Debido al enfoque de este trabajo no se hace especial referencia a tres sspectos importantes de la fermentacion que han sido ampliamente tratados en ‘otras publicaciones:7-11. microorganismos.utilizados, productos obtenidos y literatura especializada en fermentacion MICROORGANISMOS EN LA FERMENTACION Los microorganismos utilizados en la fermentacién son generalmente bacteria, levaduras, hongos, algas y tejido celular animal y vegetal. La figura 1.2 indica ta ‘lasificacién general y Ia subdivision de los protistas; debido a sus caracteris- ticas particulates, los virus no entran en esta clasificacién. Entre los protistas superiores los hongos tienen una importancia industrial mayor. Organismos pluricellares Orpanismos uniceh metafitas protistas protista superiotes (cucariote) protistas inferiores (procariotes) protozaarios hongas ales (eucariotes) clanofioeas| bactorat gua 1.2, Clasficacion general y subavision de Jos protstas!220 Introduceién El nombre y la variedad de los hongos (Fungi) hace que su clasificacién sea dificil. La figura 1.3 sitta las principales especies que se utilizan en la industria bioquimiea; los hongos imperfectos (Fungi imperfecti) son utilizados en la transformacién de esteroides y en Ia produccién de ciertos antibisticos. Debe indicarse que en la gran mayoria de las fermentaciones se emplean cultivos puros (o sea el uso de una cepa de une especie dada de microorgani ‘mos y se evita Ia contaminacién microbiana proveniente de fuentes externas) y slo en casos muy particulares se ysan dos 0 mas especies (denominado cultivo mixto) yen condiciones sépticas; tal es el caso del tratamiento de aguas por procedimientos biologicos (véase apéndice C). En varios paites existen amplias colecciones de’ microorganismos, que pueden obtenerse generalmente en forma gratuita y répida. Se pueden emplear ‘cuando se desea partir de un microorganismo cuyas caracteristicas y condicio: nes son conocidas, para efectuar, por ejemplo, estudios de utilizaciin de iversos tipos de sustrato 0 para hacer experimentos cingticos. La tabla 1.1 presenta las principales colecciones microbianas; Hesseltine y Haynes!3 dan la lista completa de las colecciones mundiales. Cabe sefialar que en la mayoria de los estudios experimentales se emplean ‘microorganismos de alguna de las colecciones indicadas, pero no debe olvidarse que en la naturaleza existen miles de especies que ain no han sido exploradas fii en cultivo puro ni mixto, y es muy probable que, por ser resultado de la seleccién natural, tenga caracteristicas genéticas superiores a algunas de las ‘species utilizades © produzean compuestos bioquimicos de valor e importa cia superiores. Los microorganismos utilizdos en procesos industsales se him obtenide generalmente, aiskindolos del medio ambiente mediante diferentes técnicas, La técnica de aislamiento por cultivo de enriquecimiento (se inicia la fermenta- ‘cin con un cultivo mixto en un medio especial en el cual sélo sobreviven los microorganismos que se adaptan mejor; con los sobrevivientes se inicia otra = ae ric Figura 1.3. Clsiticacion de los bonpos (Ran. !2 Productos de fa fermentacién a TABLA LL Principales eoleeciones microblanas\4 Nombre Diveceibn Tipo de microorganisms American Type Culture ‘Rockville UA Bacerias,actnomicetos, Coltection (ATCC) Maryland 20852 hongos, aga, protozouros Central Bares voor Baar Holanda Hongosyyastinomicetos Schimmetcltice (CBS) ‘Commonwealth Mycolo- Kew Inglterta Hongos sical Institute Agricultural Research Ser Peoria BUA. Bacterias, atinamiceios ‘ee Culture Cellecton”Minois 61608 hongos INRRL) National Collection of n- Aberdeen Bseocia | Bacterias styl bacteria (NCTB) Contre de. collection des Lausana Sola Bacteria types microbiens Culture Collection Universidad de Inglatert__Algasy protozoarios Cambridse National Cllection of Type Londres Inglaterca. Bacterias, actinomicotos Cultare (NCTC) yhongos Culture Collection oftndix. Bloamington © FAIA Alga fermentacidn en el mismo medio y asf se continia hasta que se obtiene o un caltivo pura 0 un cultive mixto capaz de crecer Optimamente en las condiciones especificadas) variando temperatura, pH, concentracién de diferen- les sustratos, etc., ha rendido resultados satisactorios en muchos casos.'5-1? Una vez aislado, el microorganismo es sometido a procedimientos de mejora- rmiento y seleccién genética hasta obtenerse una cepa altamente productora, estable ¥ euyos requetimientos nutricionales son conocidos,"® A través de los cjemplos y de la literatura citada se espera que el lector adquiera una vision de ccuiles son los microorganismos que se usan en diferentes reas de la fermentacién.. PRODUCTOS DE LA FERMENTACION ‘Tratar de enumerar y analizar todos y cada uno de tos productos de lx fermentacidn es una tarea que varios altores han inttentado, y a ellos conviene recurrir para un estudio detallado,19-25 La tabla 1.2 indica los principales productos de la fermentacidn industrial Ja agrupacién presentada se basa en la estructura quimica de los productos y, fundamentalmente, en el uso prictico. Como. se puede spreciar, los productos de la fermentacién se relacionan directamente con las areas sizuientes: a) Alimentaria (proteina, sab sntes, aminodcidos, ete.)a finde Literatura sobre fermentacién 23 TABLA 12, igi Bits Bh gane'4e Principales productos obtentdos por fermentacion A oa oe ue amraeert itanmecre: | penne, Ateohey beter 2S wi agers ge 23 A aeiticn ‘Glutamato de sodio ‘Acctona! Phin hele : ago as ees Visi Sane 3 a i Hee A fumarico Diemetionina 33 Batanodiol eo 2238 3 ge 4a 1X gluconico Lriptorano Etanol SE eg abe & be 38g ‘& ltgconico (raking Glicerol Boga 2 Rise SB oss ar) sa dag bee eet aie Aniboticos Esterotes Proteinaaniclular eegiag i? ae ate Bacitracine Cortisona, Alga pa a ts 8 5 ge Epa Eze Petretomiing Fdroortisona Bacteria 3 Be gee a) bE she Efe Nomina Fredniotona Levadra z 3 eee sie G48 stig iether Hongo = Ba ae | ae acing ameinolond 3 hee ar ie ere Viarinas wos 2 ges Ei 5 Ga Ee see Ee = a ae €e 6 28 25 Ese 288 ‘Acido sebrbico ‘Alealotes Promotores de esimiento Giocobalamina Pramas Eemoteno Iyuccticidas biobgicos Rivoarne Mewne ecugeacon de mineaes Ge tiPe Zn cte) Nucledtios (aborizantes) Polisetnios ek hac bin vale i ce i eee G2 ml «bales +b) Farmacéutica (antibi6ticos, vtamings, esteroides, etc.) 3 a2 es, Feared ¢) Quimica (solventes, deidos orgénicos, enzimas, etc.) s : Ain Bribie seb 4 4) Contaminacién, ambiental (tratamiento de aguas y de residuos sélidos, 8 = See ae Ep of recuperaion de minerals, ec) 3)4 2 2 ani Hog veetcas en que, interccionan indieotamente; agriculturay ganaderfi: a promotores del greimiento. insctcias bilogeos; ener: produecion ie 3 romotors fina; uso de onzimas snmovilizadas para diagndstien médieo, te 5 tans, medi aportancia, en la tabla 1.3 aparecen algunas de las posibles i a | aplicaciones que puede tener el uso de eizimas en alimentos $ a3 LE "i cacao etocientes de la tecnologia de la fermentacion industrial han 3 eee Satan q heck posible la preparacion de soluciones enziméticas libres de eélulas, y i Bei hese va, tal £63 a9 ech ee de. eparacion bioguimica se han logrado, mediante avances SC ie es aa 58 tes eness os. grads de_pureza, 10 que ha permitido que se extienda el Glas ia at ya i é empleo de las soluciones enziméticas. g li) 22 22 22 2 2 ron gy Tiss principios generales de Ja formacion de productos serén mencionados = |€|Se 82 ab 4 & Dee Ae Bias en ton Contalos dos y tres, pero cuando se trate de un producto especifica se € facorseja recurrit a Ja literatura especializada. Debido a a neces de aculir a a literatura con objeto de obtener Ie 23 ai 2 aeoitacionbloquimica, microbiolégica y genética para llevar a cabo. une Se eee ge 3 3 inrormtecion, a continuscién se indican cudles son, a juicio del autor, Mes oka) S [gies Bin a 3 ment nt les. son, juicio del. aut eR \e| ge 5 ad 3 i Fbliactones y tenieas mis rlevants. Ademis se da Ie lista de libros sobrePouibleutilidad Ensina (9) Posibles aplicaciones de las enzimas en alimentos (continuacién) Alimento Introduecién Literatura sobre fermentacién 25 eats lag 8 Ingenieria bioquimica publicados hasta la Fecha; nétete que el primer libro 3 8) s aparecis en 1958, 1o que demuestra que esta disciplina esti apenas surgiendo. ge oS Bg En los capitulos siguientes se indican muchas otras referencias, que sin z ae a ae 3 akg duda permitirén al interesado adentrarse en cualquier drea de la fermentacién, pies Fe ¥ entendec cufl es ol camino que:han soguido'la microbiologie eplicada:y la ot eG ingenieria bioquimica en su desarrollo. gas; eed fee g 22 3 Hpi dy een a8 4 ae Qcaee Revistas cientificas mensuales Peg og American institute of Chemica Engineers Jourel (GUA. hea F ERE ‘Applied Meroblotgy (BUN). fe: 2 2 Blorcinoloy end Bloenscetng (EUAN). aig = ¢ Canadien four of Microbiology (Canad). ani ou Lnzyme nd rob Teohotogy Cntr). eek & as ‘Buropean Journal of Applied Microbiology and Biotechnology (Alemania). Food Technology (EU) Journal of Applied Bacteriology (EUA). ‘Turnel of Applied Chemistry and Biotechnology Cnglater). ‘ournal of Fermentation Technology (aps. Process Blochertry lnglaterta). Publicaciones clentiicasy tenicasanuaes i ‘ Advances in Apple Merobiotogy EU). Fi: oe ‘Aaroncesnlochomte!tgeerngAtoar) e303 Sie ‘Advances in Meri Physotoy (EUR) Bea. a a ‘nel Reports on Fermentation Processes (EUR). oan ‘Mischnsly tad bteagheorte Syopotin Seer GUN) Awe eae Developments nInatcr! Mlerobiolagy (EUR). Bo ae § Fconomie seobitoey neater). SFP SBot, oh ‘Methods Microbitogy (naar. Topic n Grape and Fermentation Biotechnology (rats). Livros de ingens bloquica generates 3 Aba, SAE, Humphrey. y N. Mis, Biochemical Bunecring, Acadenic Pres, Nucve abe York, 1965 (Ia) 1973, a a. Atkinon, By Blochenieal Reactor, Pon, Ladies, 1975. eae aisle Taiey, James Fey David FOlls, Biochemical Paginceing Fundamental, MeGraw a toe ee ers York, 1977 fo 2 2 ee Blakebvough, A. 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Whitaker, “Food Relaied Enzymes", Adv, Chem Series, 136, American Chemical Society, Washington, DC, 1974 2 Crecimiento microbiano EI estudio del crecimiento y desarrollo microbianos comprende varias diseip nas pues, a pesat de ser un fendmeno natural, su descripeidn en términos Cualitativos y cuantiattves es conmpleja Para poder tener crecimiento micrabiano, desde el punto de vista de ta fermentaciOn, es necesario que se cumplan varios requisitos tanto de tipo biologico como fisicoquimico. En primer lugar es necesario tener un cultivo en ‘condiciones adecuadas, es decir, células en estado vegetativo o esporas suscepti bles de reproducitse. Para ello es menester conservar adecuadamente las cepas en el laboratorio y es recomendable que cada 3 0 4 meses las cepas almacenadas sean transferidas a nuevos medios. MEDIO DE CULTIVO, EI microorgenismo requiere para su crecimiento de une fuente de eneraia y de fuentes de materia, En la mayorfa de las fermentaciones industriales la fuente de energia y la de materia son la misma (v. gr. azicar), pero es necesario que la fuente de materia contenga todos los elementos constitutivos de la masa celular en las proporeiones requeridas por la composicion interna del onganis- mo. En la tabla 2.1 se presentan los compuestos orgénicos de los principales clomentos de la masa celular y su porcentaje en peso seco: las cifras son de ‘earicter general, pero se considera que son representativas de la composicién mictobiana. La formulacién del medio de cultivo debe considerer todos los, elementos de la tabla 2.1, asi como otros necesarios para la produccién de metabolites especiales.®? ‘Un problema practico que se presenta con el uso de medios que no estan definidos quimicamente, por ejemplo melezas, es que la composicién varia con el tiempo, el lugar y la forma de almacenamiento, Paia la formulacidn del medio se deben emplear composiciones similares a las m126 Introduceién Messing, Ralph A. (E4.), Immobilized Enzymes for Industrial Reactors, Acalemic Press, Londres, 1975. Pepper, Hy Microbe! Technology, Reinolé, Nuova York, 1967, Prescott, SC y C.G. Dunn, Industral Microbiology, McGrav-Hil, Nuova York, 1959, Richard, W. Thoma (Ea), Industria! Miorobiology, Benchmark Papers in Microbiology, Vol. 12, Dowden, Hutchinson & Ross, Ponnsylvanis, 1977 Rhodes A. y DL. Fletcher, Principles of Industrial Microbiology, Pergamon Press, Oxford, 1966. Rote, Ai, Industrial Microbiology, Butterworths, Londres, 1961. 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Biochem. #ng. 1,113 (1931) 17, Ry Yamada ef el, The Microbial Production of Aminoacids, John Wiley, Nueva Yor 1972 1B. Wb Turner, Fungal Metabolites, Academic Press, Londes, 1971 1, KL. Smiley y GW, Standberg, Ade Appl Morobiol, 15,13 (1972), 20. 1.W. Sizer, Adv. Appl Microbiol, 1S. 1 (1972), 21. H., Peppir, Microbial Technology, Reinhols, Nueva York, 1967 22, WT, Hane ¥ M. Shapio, Progr Ind Microbiol ,9, 79 (197). 23. A, Pinches Mining ana Minerals Engineer, 7,14 (1971) 24, M. Sherwood, Schoo! Seience Review, 30,762 (1969). 25. ALC. Olan ¥ CA. Cooney (6d), Inmobiized Enzymes in Food and Microbial Pro ‘esses, Plenum, Nueva York, 1974, 26, ALR, Whitaker, "Food Relaled Enzymes". Adi. Cher. Series, 136, American Chemical Society, Washington, DiC, 1974 1975 2 Crecimiento microbiano El estudio del crecimiento y desarrollo microbianos comprende varias diseipli- fas pues, a pesar de ser un fenémeno natural, su descripcién en términos Cualtativos y Cuantiattvos es compleja Para poder tener crecimiento micrabiano, desde el punto de vista de ta fermentacion, es necesario que se cumplan varios requisitos tanto de tipo biolbgico como fisicoquimico. En primer lugar es necesario tener un cultivo en condiciones adecuadas, es decir, células en estado vegetativo o esporas suscepti bles de reptoducitse. Para ello es menester conservar adecuadamente las cepas fen el laboratorio y es recomendable que cada 3 o 4 meses las cepas almacenadas sean transferidas a nuevos medios. MEDIO DE CULTIVO, EI microorgenismo requiere para su crecimiento de una fuente de eneraia y de fuentes de materia. En la mayoria de las fermentaciones industriales la fuente de energia y la de materia son la misma (9. gr. azicar), pero es necesario que la fuente de materia contenga todos los elementos constitutivos de le masa celular en las proporeiones requeridas por la composicion interna del onganis- mo. En la tabla 2.1 se presentan los compuestos orgénicos de los principales lomentos de la masa celular y sw porcentaje en peso seco: las cifras son de ‘aricter general, pero se considera que son representativas de 1a composicién microbiana. La formulacién del medio de cultivo debe comsiderar todos los elementos de la tabla 2.1, asi como otros necesarios para la produocién de metabolites especiales.2.? ‘Un problema practico que se presenta con el uso de medios que no estan definidos quimicamente, por ejemplo melezas, es que 1a composicién varia con el tiempo, el lugar y la forma de almacenamiento, Paia la formulacién del medio se deben emplear composiciones similares a las pn8 7 Grecimiento microbiano TABLA 21 Compuestos orginicos de los principales elementos constituyentes dd tas clas microbianas % det Blemento Compuesto orginicos pero seco Compuests oiiosv aga i 3 Gompuestos organises 50 Drotcinas, deidos nuceicosy coenzimas is Proteinasy algunas cocnzimas 1 ‘Actos nuctecos, fstolfpdos y coenzimas 3 Cotactor de reacciones enzimaticar os (Cofactor de agunstensimas 0: Gotactor de ensimas (proteasas) o Gitocromos, proteinasy colactor de enzimas 0 ‘Constuyente dea vtaminaB, BORORDEETOZOO= ‘Constituyente de ciertas enzimas indicadss en la tabla 2.1; aplicando el concepto de rendimiento (véase apéndice A) se puede elaborar un balance estequiométrico para definir las ccantidades. necesarigs de cada elemento. La tabla 2.2 es un ojamplo de un ‘medio definido que se utiliza en investigacién en el laboratorio; la literatura cobra este arpecto ot muy abundanted-” y debe sor reviseda cuando se quicre iniciar una fermentacién y se tienen dudas de Ia composicién inicial del ‘medio. Conviene advertir que las unidades de los rendimientos varian y es fécil ‘cometer errores; en ocasiones se expresan como gramos del sustrato y en otras ‘como gramos del elemento, METABOLISMO MICROBIANO. Una vez que se proven los nutrientes necesarios y el microorganismo, las cdlulas empiezan a crecer y/o a producir algunos metabolitos de interés. La transformacién de nutrientes en células y/o productos se denomina metabolis- ‘mo y en ls figura 2.1. se presentan las principales reacciones que ocurren durante éste. La gluco tiene el doble papel de generador de energia y ‘material de construceiém celular (la bioquimica se encarga del estudio detalla- do. de cada una de las reacciones y caminos metabélicos). Esté fuera de los objetivos de este trabajo el intentar revisar el metabolismo microbiano; sin embargo, es necesario aclarar que es importante su estudio pues s6lo asi se comprenderé que se debe enfocar la fermentacién desde un punto de vista imterdisciplinario. La conversién del sustrato 2 células ha sido motivo de muchas investigacionesS-10 ya que es un factor muy. importante. pues controla, ademés del rendimiento, In demanda de oxigeno y Ia produccién de calor. Por lo general, cuanto mis oxidado esti el sustrato menor es el renidimiento; otro problema es que los rendimientos dependen también de las condiciones ambientales.8 La figura 2.1 indica la importancia de las teaceiones ‘metabélicas, sobre todo en lo que se sefiere a la produccién de metabolitos ‘Fases del crecimiento 28 Giveosa, N, Ma, PO:?, $032. vitarinas, otros Mise en ‘Teenperatura, oH | el eee =| fea. an pore 8) real oe oats 3 TATPNADH) | seicos oe ie Tra, DNAY eneraia | potisscdridos} pave Biosinteticos) = ipidos enerais producto (aminotcidos,penslina, ete) i Producto extracalulr langbisticas ensimes, et.) Figura 2.1. Metabolismo microbian. ‘especificos; Bolivar y Quinterol1 han revisado recientemente los mecanismos de control microbiano tanto para metabolitos primatios como secundarios. Los aspectos energéticos son de gran importancia tanto en lo que se refiere a la genoracién como la ulilizicidn de Is energia,13 pues de acuerdo con ello se ‘lasifica 4 los microorganismos y porque representan la eficiencia de conversion. PASES DEL CRECIMIENTO En un eultivo microbiano todss las partes estan sujetas a las mismas condiciones TABLA 22 CComposicisn de un meio defini para poduetr Klebsiella ecopenes hasta 10g]! (peso seco} en cuivo aerBbico’ eee a ae lipioauas 3h puma eoromore! = i z To00 eee ig zt ster us i iro, Stone ie Ht 1450,.78,0 33° bang oa H 2a out “aH.0 9 sto! ’ SoHo. er le $30, wns, 417,0° 20 x 10 0.002 ‘7n80,.7H,0 20 x 10% 0.002 CuSO, 5H,0 10 x 105 0.0004 sean 18 Sits see ota i ase— 30 Grecimiento microbiano ‘de temperatura, pH, concentracién de nutrientes, otc. En la figura 2.2 se indican ths diferentes fases que ocurren en un cultivo en las condiciones anteriores; estas fhace reflejan cumbios en la biomasa y en el medio ambiente. Después de un periodo lag. (véase capitulo 3), el crecimiento ocure a la maxima rapidez y Bhalmente cesa, ya sea por cafencia de un nutriente.o por acumulacién de un producto inhibitor o algin cambio en el ambiente fsicoquimico. Después de he la biomasa alcanza el maximo, aparece generalmente una fase estacionarie durante Ia cual la biomasa permaneee constante; més adelante ésta disminuye tomo consecuencia del metabolismo de mantenimiento © por autoliss tag de biomasa 1 bag 1y_ devaceleracin I actleraciGn del crecimiento _-V._estaionayio IML crecimiento exponencial VL detinacin ‘gure 2.2, Curva de aecimsionto batch con eit foo. La duracion de la fase exponencial de crecimiento depende parcialmente de a concentraciSn inicial del sustrato Kimitante; lo anterior implica que. el Euitivo pasa de vn estado en. el cual crece con exceso de sustrato a otro de Sireneia de sustrato, de manera que los periodos a velocidades menores que I Gnixima no son suficientemente largos para permitir al organismo ajustar su estructura interna a las nuevas condiciones. Eeuacion de Monod Cuando el crecimiento de un eultivo de lote sélo esti Timitado por Ia eantidad ficial de sustrato, [a curva de crecimiento puede expresarse en términos de los parimetros de crecimiento. La bien contocida ecuacién de Monod # describe ls PapelOn entre la velocidad specifica de crecimiento, u, y la concentracién del nutriente limitante, Sen un cultivo microbiano. EI modelo de Monod expres: i 2) Fases del crecimiento 3 x—x0 = ¥(So ~ 8) BI donde xo ¥ So son los valores iniciales de la concentracion de biomasa y del ‘sustrato limitante, respectivamente. Sustituyendo x y Sen la ecuacién {1} se obtiene: x _ Hix (¥S» + Xo ~ 9X dt "KY +S.Y 4% —x ta La ccuacién [2] esti representada en Ia figura 2.3 en donde 4 se grafica ‘como funcién de la concentracién del sustrato. El valor K, se obtiene cuando (0.Suimax. La tabla 2,3 es una recopilacion de tas constantes de saturacion para diversos sustratos. La tabla muestra que los valores de K, para las fuentes de carbono y de energia son del orden de 10~* M. Los valores para el oxigeno son de 10° a 10?M, y para los iones potasio y magnesio, 10°* M. En seneral, [a relacién de Monod se cumple aunque hay desviaciones cuando la velocidad de crecimiento ¢s alta.!$ Concentracién celular La determinacién de la concentracin celular, x, se hace de diversas maneras, dependiendo de las) caracteristicas fisicas de los microorganismos (véase capitulo 8), principalmente su tamaflo. El crecimiento celular se determina midienc sl niimero de células 0 la masa celular. El nimero de células se puede medi en organismos unicelulares (bacterias, levaduras) utilizando un Inieroscopio; se considera que es éste un método barato y ripido, para ciertos tamanios de células pero con la desventaja de que no se obtiene informacion acerca del estado de las oélulas (vivas 0 muertas), Otro procedimiento es “pltear” o sea colocar un volumen pequefto del cultivo en una caja de Petri ‘con agar (inedio nutriente) e ineubarlo a una determinada temperatura durante lin tiempo fijo; el resultado que es el nimero total de células vivas se obtiene contando el niimero de colonias y multiplicando por la dilueién que se haya hecho. El método mds empleado para medir el crecimiento en bacteria y ota 40 ap eo 100, Ks" “Simei Figura 2,3. Weuscion de Monod, ecvacién (2), dome yyy Oh y K-10 maf22 (Cracimiento microbiano TABLA 2.3 Constantes de saturacion (K,) para diferentes sustratos.y microorganismos Organism Sutra Easing rf fbrero! tlimitante) imal 7] “Escherichis ‘Glucose 68x10? 38x10 Esoherchie Gicose ‘ 22 ‘Escherichia Manitot Pt it Gindice Geral as 49 Candide Oxiseno 4Sxw1 4 Conia Oxieeno 420107 13 x10 ‘Saccharomyces Gcana a8 4 Asperiue Giucosa 3 28 ‘Kista Tones magnesio Sexton | 23 Kiebstla Tones potas. asxtot 10 levadura es por nefelometefa (dispersi6n de la tuz) o mediante un medidor Coultercounter. Ambos métodos dan buenos resultados y permiten trabajar ‘con soluciones diluidas. Para microorganismos miceliales la masa celular se determina midiendo’ el peso seco. La técnica es la siguiente: se centrifuga o filtra con un filtro millipore una muestea, se lava ésta cuidadosamente con agua o buffer y se pone a secar a 105°C y al yacio, de 6 a 18 h hasta alcanzar peso constante Otro métado consiste en centsifugar Ia muestea en condiciones fis de tiempo ¥ revoluciones por minuto y en medir el yolumen del s6lido; esta es una ‘enica de uso y préciica industrial. Pirt4 hace un andlisis de cada una de las téenicas anteriores asf como de otras usadas en investigacién, Tiempo de duplicaci ‘i se integra la ecuacién [1] entre los limites siguientes: 2 4 dx S (eat Ce fl X= 2x1 tg = tiempo de duplication donde: se obtiene que ta=In2fq. La ecuacién [5] es de importancia biolbgica pues si se tabulan los tiempos. de duplicacién maximos para bacterias, levadutas, mohos y protozoarios, se ‘observa que estos tiempos se agrupan, siendo las bacterias Iss que tienen un ty menor y los protozoatios uno mucho mayor. Fh Ia figura 24a se observa la Fases del crecimiento 33 10m do fos tampos maxims de duplicacién para miroorganimios 2 3 | bacteria levedura. moo protezoarios 5 g A 152045 80 780 30 Tempo de duplicacion 1g (min} Efecto dp la temperatura anol crecimiento Pslcrofllos | metbtiios_termtilos a a a a a ‘Tomporatura Cl Efecto dels concentacién del nutrients en el crecimiento —— i 220098 er centracion de nutriente: ne Concanacion de uve Pur 2.4. Ect de dversos factors ho creetmiento mietblano existencia de traslape, de lo que se deduce que un organismo unicelular crece ho necesariamente mds aprisa que uno micelil Como se explic6, las condiciones ambientales tienen una gran influencia en l crecimiento microbiano, de manera que 1= (I, pH, naturaleza y composi- cidn de los nutrientes, fuerza i6nica, etc.). Efectos de la temperatura Le temperanura afecta el crecimiento de manera notable, principalmente porque los microorganismos de una especie dada solo pueden crecer en un Fango restringido de temperaturas. La figura 24b muestra cOmo se pueden clasficar Jos. organismos de acuerdo con la temperatura Los. pslcrfilos presentan un rango de $* a 15°C, los mesifilos de 25° a 40°C y los terméfilos de 45° a 60°C pero se han reportado casos de hasta 94°C, Los organismos terméfilos. tienen un gran potencial de utilizacién pues la alta temperaturasal Crecimiento microbiano permite una mejor transferencia de calor, velocidades de reaccién mayores y menor posibilidad de contaminacién, La mayor parte de los microorganismos que se usan actualmente pertenecen al grupo de los mes6filos. ‘La dependencia de la velocidad especifiea de crecimiento respecto a la ‘temperatura puede expresarse como una ecuscién del tipo Archenius:4 fe 6) donde E, es la energia de activacién (cal/mol) y A es una constante..Si se Brafica log 4 versus T~* se debe obtener una linea recta cuya pendiente es p,/2.3 R. De esa forma se han obtenido energias de activacion para diferentes forganismos (no debe olvidarse que la ecuacién [6] s6lo es vilida en el rango de temperaturas indicado). La tabla 2.4 da algunos valores de E, ; ndtese que para Jos mes6filos es de alrededor de 13 000 cal/mol. ‘La temperatura también afecta el rendimiento (Y en el caso, por ejemplo, de Fusarium (M4) en cultiva batch a pH constante se aprecia claramente un ‘aumento de rendimiento dentro de su rango de temperatura, mientras que la Nelocidad de crecimiento. disminuye dristicamente cuando la temperatura es mayor de 34°C. La curva de T versus wes tipica y aparece representada en. Ia figura 2.5 Otra forma de expresar la dependencia de 1 respecto a la temperatura ¢s la siguiente:20, 22 ax | mix, PERE. thaisal dhe ahah Abaca oh seuteeeesnialen 2o sty at Ka 35 * Ve ds __Mmi(S* | at Y(DIK,(T) +S] donde 2 pl TABLA 2A Valores dela encrsia de activacion (Eg) para erecimento microblano Rang de rs Organism a ccatfmot Referencia “Aspro: ier 20-37 14600 4 tice cor Bou 13100 if Cini uate i535 13000 5 ‘obec erence Boa 10300 b Siti aooxenes 2-40 14330 % Peedomonas rote) 2-12 ab ¢ SERIO Ae UO SAI ace lase Elastin aus, peltondh Fases de crecimiento 96 oa wet) os. ° oe: 04 oa 02. 03 0 02 on o no 8 © 6 0 4% Temperatura °C Figura 2.5. Brecto de la temperatura en Ia velocidad especitica de crecimiento (s) (0) ¥ fn el rendimiento (¥)(») en eultivo batch de Fusarium sp, (M4).21 Carbohideato-sacatoss, MenioH= 40, Las ecuaciones anteriores explican la yariacién encontrada en la figura 25 ‘A medida que s¢ empleen microorganismos termofilos, mayor informacién irs fapareciendo y se podré encontrar las constantes cinéticss indicadas ¢” las fecuaciones (71,(8] y [9], Efectos del pH FI pH, medida de conoentracién de iones hidrégeno, tiene también un marcado efecto en la velocidad de crecimiento y en el rendimiento. El pil para una especie presenta generalmente un maximo denominado pH 6ptimo. En bacterias el pH dptimo varia entre 6.0 y 8.0; en levaduras entre 4.0 ¥ 6.0 yen mohos entre 3.0 y 7.0. La ecuacién de Monod ha sido modificad para indicar el efecto del pH en u:23 eee to} donde Hy 3 la concontracién de iones hidrGgeno, y K, y K, son las constantes ide disociacion: pee nso VIG uw) sin embargo, las eeuaciones (10] y [11] sélo son vidas en certo rango de pH Jno necesariamente se cumplen en la. préctia. La figura 2.6 indica que fuando el pl! ostila entre 5 y 6, wes casi independiente, pero a un pH menor disminuye considerablemente, Se eree que el gradiente de concentracion do jones hidrégeno intracelular junto con el potencial eléctrico de la membrana36 Crecimiento microbiano Bhd hoc, Ay, MRM RELY elt oH eura 2.6, Efecto del pH en la velocidad expestfica de crecimiento (x) (0) yen ol rend Trisnto CY) (e) en cult batch de Fusarium sp, (M4)21 Carhohidratersacarost, 40 g/l ‘temperatura, 30°C. determina la fuerza motora de protones que dirige las reacciones de la membrana, Un cambio en ef valor del pH del medio puede afectar su composicién y la naturaléza de la superficie microbiana al disociarse acidos y bases. Este ultimo efecta, puede afectar Ia floculacién de la biomasa 0 su ‘dhesién al vidrio. El pH tiene una gran mnfluencia en los productos finales det ‘metabolismo anaerébico. En el caso de produccién de Acido citrico, Kris- tiansen24 ha demostrado que el pH es el factor de mayor importancia tanto ‘en cultivo batch como continuo. Efecto de nutrientes ‘Se menciond que un meio de cultivo debe tener todos los elementos TABLA 25 Carbon asimilado y desasimilado como fuente de energias Carbono de glucose Glucosa desasimilada Orgenieno Condiciones "axiiada e pera proveerenergta % Sweprococeus facile Meso, 7 8 Seecharomyee crere Meio Se f 98 Sacharomycerceriae Moo, 10 30 Aerobacter cloacae Meco $5 45 Referencias 37 neeesarios para el crecimiento microbiano, pero conviene sefalar que las relaciones entre certs elementos son de particular importancia.1325 (ver figura 24g) Nyitiencontt en un cutivo de Candida en melazas que a reaci6n carbon nitrbgeno debe ser 1 para que la productvidad celular sea maxima. También la felacion foxforofoxigeno ex relevante en Io que se sefiere {a eficiencia de Conversion energticay a ln respiacion.26 . I oxigeno merece mencion especial pues su ausensia 0 Nbuadancia26 permite una seleecion tanto de microorganismos como de productos del Inetabotismo. Cuando el eultive se produce en presencia le oxigeno molecular, in fermentacion se denomina aersbica, y ciando éste carsse de oxigeno, tnaerobiea. Si la fermentacion es angerObiea la mayor parte del carbono se tmplea como energia y s6lo 2% se asia coma material celular, La tabla 2.5 presenta algunos datos que dan una idea general defo que sucede El crecimiento microbiano es funcién de muchas variables y fodavfa no se establecen relaciones. matematicas que cubran los rangos de operacién 0 interrlaciones con ellas. Sin embargo, con el conocimiento actual es posible iniciar una fermentacion y poco a poco, a través de la experimentacion, ila tmejorendo y dirgiendo el crecimiento yal metabolisma microbiano en. el Sentido que se desce: aumentando el rendimisnto, disminuyendo el consumo de nutrients o excluyendo selestivamente ciertos products. NOMENCLATURA consitante energia de activacén (cl/mol) concentracin de jones hidrégeno cambio deentalpi (caljemol) constante de disociacion constante de disociacion constante de saturacgn, que se obtiene cuando = O.5tméx (8!) constante de Ios gases (1 atm/gmol °K) S = concentracion de sustrato (gi!) 9 = concentracin de sustrato nical (0) T= temperatura CK, °C) {= tiempo (es, min) tg _ = tiempo de duplicacion (seg, min) x concentracién celular (g/1) Xq = coneentracin inical de céluls (g/l, mg/ml) Y' = rendimiento colular por unidades de sustrato (g/s) 4 = velocidad especifica de crecimiento (h7!) Hix = Velocidad especitica mixima de crecimiento (ht) REFERENCIAS. L.A Rive, Les applications indusoriles de la microbiologie, Masson, Paris, 1975.Crecimiento microblano [AcL. 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Ghose, Proces: Biochem, 6, 19 (1976). 3,798 197), jek (ed.), Food rom Waste, Applied 3 Cinética de fermentaciones Los estos cinco son necsatios para entender el comportamieno de sealer fermenter yen emera const en mediion 0 extimal6n de iie"Mocitader de sins uu, de formacién de provicios de fo ates del medio amblente sobre etn velocidad, xe aptly se tefireexcamente al evo de seman calulaeh, 80 representaion models a el eat, no. Molecular” Adonis abaca Sclamente proces de Tot © batch jas ton so los que enen mayor Trpowanca comercial En cl apengie B se presenta ua invoduecon I cn ae a you rv aur oe apn compar studs diferencias en cueston cngtica, El eapitulo 4 tala aspectos del cultivo continuo, eae ‘CINETICA DE DIVERSOS TIPOS DE FERMENTACIONES 139)38 Mice! Appl Chem. Biotechnol, 22, 68 (1972). Crocimiento microbiano ‘Ack. Demain, “Microbes and Biolosical Producti Genert de Microbiologia, Londres, abril de 1971 K. Nakayams, Process Biochem. 3,4 (1976). 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Ghose, Process Biochem, 6,19 (1976). 38 Cinética de fermentaciones ‘Los estudios cinéticos son necesarios para entender el comportamiento de cualquier fermentacide y, en general, consisten en la medicion.o estimacion de las velocidades de sintesis celuleres, de formacion, de productos y de los efectos del medio ambiente sobre estas velocidades. Este capitulo se refiere exclusivamente al estudio de sistemas colulares, su representaciGn y modelos a nivel celular, no molecular.» Ademds sbarca solamente procesos de lote o baich ya que éstos son los que tienen mayor importancia comercial. En el apéndiee B se presenta una introducci6n ta cinética de enzimas y se aconseja rovisarlo al estudiar este capitulo para ‘comparar similitudes y diferencias en cuesti6n cinética. El capitulo 4 trata aspectos del cultivo continuo. CINETICA DE DIVERSOS TIPS DE FERMENTACIONES, Los prossot Batch Ue ermentacion hn so clsiiadon por vai ators ‘ait erento eresos Caden sg que se clans le Tormactn del sretctov cont utlzaion el stator en be tbla 31 te dan agunon oso depos estas deve ein se Tas ques 3.1, 32 y 33 repent Jor tres spot de ft cn SE 3 oe gua omentaon Mecho en eames tclanata eon la ulleacion de eatoldat, Lat eames A, Bly C de la idee 3a son muy snares on forma ys pendent pares la mika, La fe ture 1b penta produtiidady mea qe Is inten de alcohol la Stein’ de atc ouen creas my sete cys mixes cain Unag (paid defers) repeto sa cur de productad para cet 19)40 Cinética de fermentaciones ‘TABLA 3.1 TTipos de procesos de fermentacién de acuerdo con Gacien? Tipo Relaciones especifieas de velocidad Hjemplo T Formacion del producto diactamente relcionado Elanot Sora utacion de cartohidato Formaciin del producto inditectamente lacio- Acido eftico 1 ‘ajo com Te utlizacin do carbohidrato 0 Formacién del. prodcto aparentements no rela Ponicitina EBmudo con la utlizaeion de earoohidreto miento, La productividad especifica muestra Ia misma tendeneia y por ello es ‘lara que Ia fermentacién se considere de tipo I. a figura 3.2 representa ol tipo If; en este caso la produccin de dcido citriso esta asociada a la utilizacién de azticar aunque en forma indirecta. La gine de_productividad y productividad especitica indican un desfusamiento cate ta sintesis del dcido y el consumo de carbohidrato. Los méximos no oinciden en su posicién relativa respecto al tiempo. Del tipo Ill es ejemplo la fermentacién productora de penicilina (Hgura 33) en la que la formacién del producto ocurre en la Hamada fats ‘aiGharia. & este tipo de productos que aparecen en la fase que sigue a la Set cesctmionto se lee denomina generalmente metabolitos secundarios. En la figura 3.3 se incluye el consumo'de oxigeno porque desempea un papel my itaportante en la fermentacién y porque se ha demostrado que el eonsumo de ‘oxigeno puede asociarse a la produceién de penicilina eita elasficacion propuesta por Deindoerfer? se basa en el proceso de fermentavion (véase tabla 3.2), y se considera que es itil, partiularmente en O aatudio de fermentaciones de proceso ba‘ch, El tipo simple se refiere a ta ftica de fermentaciones de dos tipos: asockidas al crecimiento y no ein TABLA 3.2 lasificacién de fermentaciones por tipo de reacctéin, segin Deindoerfer? sepin Delegate sar maneita dl gouey eomaaic 30a tae Tipo Dése ‘Simple ‘Notrigntes Gonvertdos én productos com dna estequio: ‘eta fia sin aourmuacton de ntermediaios Simuttineo Natrientes comvertiads en productos eon und prop Ngteentss cstoquiometria variable, sin acumulacon de intermediarios consecutiv ‘Nutrientes eonvertdos en producto, con acumulacién oun inermediato Por pasos Notsientes convertidos en un intermodiario anos de ‘onversin oa producto, © Nutvizntes seketivamente convertides en producto nun arden preferencia Cinétco de diversostipos de fermentaciones a colt A micelio (peso seco) # alcohol C azucar consumida 4 eracimiento sintesls alcondlica ¢ utihzacion de azicer Aafh Balh Cah 005-02 A ceocimiento, Sintesis aleohélica ak ok gL pny a ed € lizesion do azécar 27,48), Buena, ‘4 i lo ‘Tiempo de fermentacion (unidades) ura 3.1, Fermentacin aleohilica, (4) Curvas tiempo-concentracton; (b) tas volume: treat; @ tasas especies asociadas a éste, La reaccién sinulténea se refiere a las fermentaciones fon més de un. producto, a las velocidades relativas y a su variacién con fespecto a la concentracién de nutriente, Las reacciones de tipo consecutive fon aquellas en las que tin intermediario se acumula hasta cierta concentracion fantes de que se forme el producto, En las reacciones por pasos se efectéian dos Teaceiones simples, que pueden ser reguladas por induccién enzimética ‘Una gran mayoria de fermentaciones son procesos que envuelven una combinacidn de las reacciones mencionadas y su complejidad puede ser muy trande. Para el proceso de produccién de penicilina, por ejemplo, en ls figura 434-se presentan esquemiticamente los datos de Hosler y Johnson. La curva de‘2 Cinética de fermentaciones up HO zal 209 ist _ 100 ace tn A micelio aL = a0 seldo eftricg ¢.-co acide titulable he «i oo Acido citrico: i ol © ezécar consumida @ ond ooh tomP o ial A crecimiento 2 Sinesis del cid, al € Utlizacion de extcar on] 0.10 SOh Bout Ss < oa pam Ne, 4 crecimiento 2 Nesasg, HB sinesis de Sido dl eee Neng sek I 6 iiizacion de svicar OF 4a oo 129 60 200° 40 2 “Tiempo de fermentacién th) ‘igure 3.2, Proce de sido citico poy frmentacon (a) Curas tempo consenraléns (@) tas volumétveas (c) tasasespecifies crecimiento representada por el nitrégeno micelial es de tipo difisico y la cur- vva de produccién exhibe también un earicter difisico y un lag respecto ala curva de crecimiento, Se considera que en algiin momento entre la desaparicion del fanicar y la aparicién de la penicilina se produce ta acumulacién de un intermediario. En este caso se aflade un precursor durante el proceso para mejorar la produccién, ‘Otro caso diferente ocurre en Ia producci6n de alcaloides, que sigue una cinética compleja debida posiblemente a que e! micelio no se encuentra en un estalo morfolbgicamente diferenciado aunque si lo esté fisiolbgicamente. Este aspecto, que se refiere a cultivos miceliales, ha sido poco explorado debido Ja dificultad que supone detorminar la diferencia entre los diversos estados Modelos cinéticos de crecimiento celular “3 fisiologicos, pues se han dedicado muy pocos esfuerzos a relacionarlos con algiin modelo cinéticoS (ver figura 3.5), MODELOS CINETICOS DE CRECIMIENTO CELULAR El crecimiento unicelular en eultive barch limitado por la cantidad de sustrato, suministrado inicialmente, puede ser expresado en términos de la concentra: ién celular x, la del susteato limitante S y la de un inhibidor 1. Notese que existen casos en que la limitacién por sustrato se debe a mas de un tipo de fnutriente, ‘También debe considerarse que las condiciones de temperatura, fuerza iénica y pH se establecen al principio de la fermentacion y es muy probable que varien durante el transcurso de la misma, @ no ser que se 2s 0 wo aan rt # 4 micelio 2 pete FS ica ost naan ost ovois ae zing ©) Zoats = 064 ) 2 3 hg ay ie 4 ercimieno ° obo 4 Sintat'S0ponicina C utilizacion de azticar eongumo de oxigen o-oor2t 0-19] o-20F a-a010f 0-10 $ Bp. 4s} S0-o008y 0-08 2 | Bo-n006t 60:06] 0.0004{, 0-04 ie o A crecimiento 48 Simtesie de penicilina € utilizacion de acucar D consuma de oxigeno 0.0002} 0-02] 020 40 50 80100 120 140 “Tiempo de fermentacién th) ‘Figura 3.3. Produccion de penislina por fermentacién. (a) Curva tempo-concentracion: (@) tas votumétrias; (c) tas especiicas3— 44 Cinética de fermentaciones Meson a en aricar anodic Tienes eure 324, Produecién de peniciina en medio sintétic con slimentacién continua de ‘lacoaa(concentractones en diferente escala).* controlen extemamente; Io anterior puede tener un efecto notable en el ‘erecimiento ealular. Una expresién general es: dx L ° 1 && — F¢4,8,1,T pH ete) ro fin 1942 Monod establecid un modelo de_ crecimiento celular s n= Hine as demanera que $a px p soni BF = seosidad de crsininto ex. 1 = velocidad sspeaiica_de_crecimento,\El valor de se considers const tS ara fase exponencial del erecimiento, cuando éste es proporcional a la asa de células presentes. La velocidad especifica de crecimiento esté en relacién con el tiempo de duplicacién, tg, y la ecuacidn [2] se integra entre los limites x y 2 6) Se han propuesto otros modelos para crecimiento, tal es el modelo del ‘Modelos cinéticos de crecimiento celular 46. ‘crecimiento lineal, que ocurre cuando existen limitaciones debidas a veloci- dades de difusién o de transferencia de mas En el caso de organismos filamentosos y dependiendo de si crecen como mnicelio o en forma de peifet los modelos son diferentes. Righelato® propone para crecimiento en peler lo siguiente x! xe kt i} La ecuacién [4] se ajusta_mejor que él crecimiento exponencial, ya que ‘considera que la capa periférica del pellet crece exponencialmente cuando txcede cierto didmetro, y cuando esto sucede el sustrato mo se difundird lentro del pellet con Ia velocidad suficiente para mantenet un crecimiento fexponencial en toda su masa. Esto se debe a que la masa del pelfer es proporcional al radio elevado a Ia tercera potencia y Ia superficie a través de la Bhal se difunde el sustrato aumenta con el cuadado del radio. Una aproxima- tion es suponer que dentro de la capa periférica, ef pellet no crece en Absoluto, en cuyo caso’ ax SE = iy (1 donde xp =masa de la capa periférica, y ar a (6 ‘@ Acaloise x 1000 8 oso seco x 5 F Galactom en ol medio = Amania cor nitvoaeno) tenet medio X 10 Dias Figura 35. Produceibn de aleatoie, crecimiento micelial y cambios en le composiién Aicimedio durante la fermentacibn de Clavieeps purpurea.®46 Cinética de fermentaciones donde radio del pellet, ‘espesor de 1a capa perférica (constante para cada concentracion de sustrato limitante) Integrando [6] ¢ introduciendo la densidad del pellet, fy, se tiene: = wt + fo m M= 3 Pb [3] sustituyendo [7] en [8] entonces: Mus (ela hth aby 5 (G/4 Pm) es una constante numérica igual 8 0.74 si py =0.1 glem?, Puede consierarse, por lo tanto, que el crecimiento de un peller 0 de sin grupo de pellets del mismo tamafo sigue un modelo de crecimiento de tipo rate ctibica, cuando et mayor que w. Siempre que + sea menor que w tendré lugar el crecimiento exponencial Sin embargo, la expresién empirica més uilizada para descrbir la velocidad eapeeifica de crecimiento ex s He bine RES (19) ah Api = velocidad espectfica maxima de crecimiento RO" = constante de saturaciSn Sie ator aeemos Is dfntn de rendiminto,Y (vas aénde A), come: dx Tas. oy X—Xe = YSo—8) 02) dicho rendimiento es constante cuando las condiciones de cultive permanecen cconstantes, aunque dependiendo del sustrato, sobre todo cuando es utilizado principalmente como fuente de energia, parte de él se emplea en el manteni- Imiento_de la célula. Una eélula puede utilizar glucosa para llevar a cabo una rospirafln endégena sin crecimiento. A bajas concentraciones, la ecuacién de Modelos cinsticos de crecimiento celular an fendimiento debe incluir un factor que tome en consideracién la utiliza del sustrato para mantenimiento (véase capitulo 4). dS _ de - & pi at "dt Tus Fa 03) Ys donde Goss = rendimiento para crecimiento Cas), 1m = yelocidad expecifica de consumo de sustrato para mantenimiento celular (g de sustratojg de célulah. La figura 3.6 presenta diferentes casos de la ecuacién [10] para diversos valores de K,, La ecuacién [10] es andloga a la ecuacién de Michaelis Menten Pero su derivacién fue empirica y no tedrica. En general se considera que la fexpresion de Monod [10} es una sobresimplificacion dal problema, pero twlecuada como una primera aproximacién, A medida que el valor de K, es ‘mayor Ia curva se “aplana” més; también cuando S es menor que K, existe tina relacién lineal entre la Yelocidad. de crecimiento y la coneentracién de sustrato Cuando S>K, se aleanze la velocidad especifica de crecimiento Indxima, En muchos casts, euandy Ta convention de sustrato es muy grande Suele producirse una inhibicion y la velocidad especifica de crecimiento disminuye. La integracion de fa ecuacién [2] lleva a ua) 5 Ks 25/al_— BT fe swore ‘Veloce eupaciica do eae ‘0.00. 1250” 25.00. 37.50” 50.00 CConeanteacion a stata (al) ‘gura 3.6, Efecto de Ken Ia ecuseiin de Monod (ecuacién (10D.“3 Cinética de fermentaciones: ara = constante 21 = pelt lus) Ia eouacidn [15] ola exprsion del crecimiento exponencial. Combinando tas ecuaciones (2), [10] y [12] y sustituyendo una en otra, es poribleexpresar el eultivo batch como: HyyixX(YS0 + Xo — x) 64) See oe dx Hma® integrando entre limites: a oe bene ed eye rr gm ha se puede resolver Ia ecoacion 17] anal itkamente por conversén por pats: nix Pee yeaa x este Ms * (¥So+YKs+%0) dx, Ykscx 8) YSo xo X (So + Xe)(VS #0 —¥) YSo + YKy + x0 (2) YK, YS ¥So + xo e ies oar) Hmixt (191 Y85#x_ | \¥So Xo Xi La ecuacion (19] da ta figura de una curva con forma de S y representa el cultivo batch. EL valor asint6tico a que llega esta dado por el caso limite cuando $=0 (Jodo el susrto ha sido consumido) de la ecuacion (12), X= Xo + YSo La diferencia entre las ecuaciones [14] y [19] es que en la primera se considera 4 constants y en la segunda es funcién de la conoentracion de sustrato. Al modelo representado’ por la ecuacién 19] debe agregérsele un cierto tiempo de adaptacion al medio antes de empezar a erecer exponeacialmente; dicho tiempo se conoee como periodo lag o simplemente lag, En la figura 3.7 , Loa « gc often) “tiempo th) Figura, 3.7. Efecto del tamalo de inéculo en cultivo Boich de acuerdo con ta ecuacién [191 Parimetros: jg "0-5 h*, Sy = 10 gl, K,=0.1 gl, Y=0.5 (~~ —) Xj =D gl, (9X, =05 eft se expresan grificamente la ecuacién [19] con y sin lag y también se indican dos niveles de inéculo (xp); se aprecia claramente que el tamafo del indculo ‘es muy importante en lo que se refiere a crecimiento celular. Si el dag es muy grande también tiene relevancia, sobre todo en lo que concieme a la productividad. La segunda parte de la ecuacién solo tiene efecto cuando x; es mucho mayor que x9, lo que hace que la curva se vuelva asint6nica La productividad celular P, pata un cultive bare se define como: t (20) hot siendo P los gramos de eélulas producidas por yolumen de fermentador durante el tiempo total de fermentacién. Para el caso ideal de crecimiento exponencial Ia productividad es p=" pn) donde t,=tiempo muerto y de preparacién de la fermentacion (limpieza, esterilizacion, inoculaci6n, ete.) empo de crecimiento logarfemico tempo lag soncentracién celular méxima tt tte t Xi fo Este caso se compara con Ia productividad del cul siguiente, continuo en al capitulo60 Cinética de fermentaciones La tasa de consumo especifico de un sustrato es otro factor que a menudo: se mide y que se define como: o> 9: a? (22) donde q=velocidad especifica del metabolismo 0 cociente metabélico = 8 sustrato/g célulash; sustituyendo [11] en [13] y considerando que ¥ es cons tante, se tiene (sin considerar la energia de mantenimiento) aly (24) (6 neceserio indicar que si nse expresa como f (S) 6 Y no fuese constante, Ia expresion del cociente metabélico varia, Soman reihenia cee eect em. Para el detarolo de prottos microbianos para Ia formacion de Produtos ex necesario optimizar 3 elementos: el rendimiento del producto por gramo de a te concenttaion del pipdiaio-¥- la Veloctad “Ue Termaen. del rmsmo{ Los pasos principales para el desarvollo de un proceso de-fermentacion som 1, Seleccién de una cepa mictobiana 2, Determinacién de los valores Gptimos de temperaturas, pH, concentra- cidn de oxigeno, ete Ax Determinacién de los requisitos éptimos nutricionales y la concentracion celular 4, Modificacion de Ia estructura genética del microorganismo para aumentar Ia formacién de producto, | Los cuatro aspectos se refieren basicamente a la regulacion metabolica del ‘migfoorganismo.| Normalmente el metabolismo esta ajustado para. producir solamente el miftimo necesario de metabolitos. El éxito de una fermentaciin consiste en interferiren Ie regulacién metabdlica y provocar una sobreproduc cin del compuesto deseado, Demain!9 y Bolivar y Quintero! han discutido ampliamente las posibilidades de aplicar la modificaci6n de los mecanismos de control. ‘Se han propuesto muchos modelos para la produccion de_ diferentes metabolites. Tres de ellos han. servido razonablemente para explicar el comportamiento de sistemas simples a) modelo asociado eon crecimiento 'b) modelo no asociado con crecimiento ©) modelo combinado ‘Modelos para, formacién de producto 51 Cuando un sustrato se convierte estequiométricamente en un solo producto (B), la tasa de formacion estd en relacién con la velocidad de crecimient por i ya bo an. {ax tat donde a=constante estequiométrica, Este es el llamado modelo asociado con crecimiento. Para los casos en que la formacion det producto es independiente de la velocidad de crecimiento, (25) ‘8 26] a (26) donde|gconstante de. proporcionaliad, La constante et similat I actividad enzimatica (a Célula tiené lin sistema enzimético constitutivo.que Golan, tam_ce formacion del_producto).y.ceprrenta le unided de felvied fofinadora del producto por mua de cfs, El modelo combinado propone exprea In producciin como la suma de eee ' Pe Piceplaett2 (“a Ga Oy O ws ez Se j= ( BH 4m 27 ‘ e me ae teed 4 1B iat Bo londe_ v= tasa_especifica_de-formacién.-de_produeto,\ Luedeking'? y Ko- nol3.{4 fan aplicado este modelo a diversas fermentaciones con resultados ‘bastante buenos. También se han elaborado modelos mis complicados, en los cuales @'y 6 son variables o adquieren valores ditcretos en las cuatro fase del Grecimiento en batch.|4 Se considera que los moselos més tiles sen aquellos eR Ge sree ceed Seva aceeuieale Centracin de inductor, tasa de alimentacion de sustrato, et.) pues ademis de representar mejor el sistema pueden usarse pare controlar la fermentacion con computadora Pir,? empleando un método diferente, considera que el producto formado euler re diode code durante el erecimiento en un cultivo bazch con un tiempo infinitamente pequeno, dt, esté dado por Mpr alt 4 BK AB = qgxit Ich, de prodccor 29} Comhanke! ete quien ex Ce Petite /y tots donde mM % fina SH Nolin Ae Checimiente Me, main cela TN A ied a le a risCinética do fermentaciones 82 ay = asa expocfics de FormaclOn del producto yp= wa” Ye crendimiento del producto seferida a biomasa formads; sap °° conan Sunsontrasin del producto desputs de tempo, t f an of xat (201 esto es: Be tap fa in on 91] puede enlune came del svar d nity on ection 21] et ee msec ama es pole ined exit cm a po espns cements exponen se] oe nese se B Bo + ap Xo (CM — De (321 sit susuato lita se alimenta aumento de biomass puede se Heal 5 ae ge ituston a una velocidad constant. por. una cépas de toring 1a velocidad de sinus dl producto ee eres isminuclon emplea esando ia velo d¢ ce mi to alk valor eritico eercano a cero. Si se supone ied os jet sana On a Siento cosa onl tempo, t¥ gue mbpetent, constant Tt, rae oa sed mic dea ated Sti IMpredinestaré dada por aB = Xpaxaadt (i fl aumento en la coneentracién del producto esté dado por i B= Sp j saat pal os la concetracin dl londe t, es el tiempo en que Xméx S@ alcanza, y By cs sg donde ts 5 egy een emp despots. La integral deat praetor de ap cont. ty al ae de act 8g, exponencial o de primer orden “Gy = Kap ‘Nomenclatura 53 cuando K es constante: (35) 608 ap = 198 dam — 345 136] pm =1#a expeciica mbxima de formsein'de) producto, Una eéfia de log aonsontra tard a pondiente Ky la vide media dela actividad serd In 2/K Penson! y Pirtl6 han encontrado casos interesantes: el primero, trabajando fon un sistema enzimético, determind ona vida media de 8 hy ol segundo, Sstudiando la sintes de. penslina encontsd que la pérdida ex aproximad monte lineal y no exponential Un gran nimero de investigadores ha propuesto que tos_ modelos de crecimiento incluyan la distribucién de edad. Sin embargo el concepto de edad fes muy dificil de visualizar puesto que a la célula que se reproduce por biparticién, s6lo se le puede asignar una edad en términos del tiempo transcurrido después de la division, En el caso de las levaduras, Ia edad puede sor medida debido a las marcas que dejan Tas yemas en la céhila madre cuando se desprenden. Hasta ahora los resultados obtenidos no han permitido utilizar la distribucién de edad como un parimetro en los modelos celulares.17 Otros investigadoree que han observado los cambios en la camposiciin celular provocados por el medio ambiente y la velocidad a que crecen las élulas (véase cap. 2) han supuesto que las actividades celulares estan estructuradas Por estructurada debe entenderse que varios componentes de las células pueden utilizarse para representar las diferentes capacidades celulares. Por tjemplo, el dcido ribonucleico representa la capacidad de sintesis enzimatica y fl contenido de proteina es indicador de la concentracién de enzima en a eélula.?,18 Para que un modelo tenga una validez mayor es necesario volver a la ecuacion [I] y encontrar cudl es la relacién entre la velocidad de crecimiento y Jos factores ambientales en diferentes condiciones de operacidn. NOMENCLATURA AyB = constantes B= concentracién de producto B (mg/ml, ef) 4 didmetro (em) 1 cconentracién de inhibidor (e/I) K = valor de la pendiente de la grifica log ay 9s t(h*) K, k M ‘constante de Saturacion (m/l, g/l) constante ‘masa del pellet (8)£ Cinética de fermentaciones m velocidad espeeifica de consumo de sustrato para mantenimiento celular (g sustrato/e celulas h) M = masa(e) P productividad (g/I-h) q Jelocidad especifica del metabolismo o cociente metabsiico (a/eh) Gy = tasaespecifica de formacion de producto (h-') ey = tase especifica maxima de formacion de producto (h : radio del pellet (em) = concentracién de sustrato (g/l) T temperatura (K, °C) 1 tiempo (seg, min, h) ty tiempo muerto y de preparaci6n para la fermentacién (seg, min, h) itt iempo de crecimiento logaritmico (seg, min) HH) iempo de duplicaci6n (seg, min, h) iH empo lag (seg, minh) Cee a ties We = espesor de lalcapa periférica (em) concentracién celular (g/l, mal) ‘concentracién celular maxima (g/l, mg/ml) ‘masa de la capa periférica () rendimiento celular Yg__~ rendimiento del producto (22) a Yq = rendimiento par crecimiento 5,1 aq = constante estequiométr f= constante de proporcionalidad # velocidad especifica de crecimiento (h*) nsx = velocidad especitica maxima de crecimiento (h*) ’ taza especifica de formacion del producto (h™™) pm = Sensidad del pele (g/l) REFERENCIAS 1, EL, Gaden, Chem. Ind., 184 (1954). ae easy Humphrey y NA Mills chemical Engincerin, 2a. c8., Aeademic Pres, Nucea York, 1973. 3, Batkinson, Biochemical Reactors, Pon Limited, Londres, 1974 £ Fit Deindocrter, Ady. Appl Microbiol, 2,321 (1960) ‘ P Hoslery MJ. Johnson, dnd, Bg. Cem. 48,871 (1958. enone ons Production of Orenie cis by Continucus Quture of Fungi, tests doc- tora, UMIST, manchaster, enero de 1976. 7. Ve Shuth yA Berry, An Introduction f0 Biochemistry of Fungal Development, ‘Reademie Press, Londres 1974 1 Re Runelato, The Fimentots Fungi, Vol. 1, Edward Armold, Londres, 1975. BRS pat Priniples of Microbe and Cet! Cultivation, Blackwell, Oxford, 1975. 10, AL, Demin! Appl. Chem, Biotechnol ,22, 348 (1972) 11, Riothary R. Quintero, Rev, Soe. Quint Mex, 19 (2),43 (1978) Referencias 12, a 1 15 16. 17 18, 55 B Luedekingy EL Plt Blochom. Mobo Teck & Ey T, Kono y T. Asai, Biotechnol Bioeng, 11, 19 (1969). ‘f T.kenoy TAs Morcha Bien’ L293 1969) AH, Femsown y SJ. 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Eniston_dos formas bésicas de eultivo continvo: el cutive de flujo tapdn y -guimsovato. nel clu dejo tpn ides, clo vig sn mezlaie 3 Wravés_de.n-tubo-o-canal,-Un quimiostato consiste en un tanque.agitado ‘on_una suspensiGn-de. biomasa_perfectamentemezclada-y-homogénea, a la que _s2-alimentaconmediofrescoa. una. tasa.constante; el caldo de fermentacién es extraido a la misma velocidad de modo que el volumen ermanece constante. sistema de flujo tapén simula un cultivo burch y no oftece ventas de control ambiental diferentes_de.lis_aplicadas a ese tipo. de_cultivo. La importaicia fundamental del quimiostato se hizo evidente después de la formulacion de la teoria bisiea por Monod! y Novick y Sailird. Dicha teorta indicd que es posible fir la velocidad especifioa de crecimiento entre coro ¥ tn valor miximo. Esta conclusion auperd una barre tradicional de pens mniento que suponia que la tnica velocidad especifica de crecimiento extable Gra la maxima, que comespondia al tiempo de duplicacion en un sistema de tultivo batch. Las velocidades especticas dependen del sustrato.y son por Io mismo, variables, Se pens6 que si la teorfa predecia productividades muy alas de microorganismos en fs sistemas continuos, la aplicacion de dichos sistemas 1 las plantas de produccion serfa slo un problema de inversion economic, Sin embargo, ls plantas operadas en forma continua s6lo son rentables si se 137) | | |58 ultivo continuo conocen los procesos bioguimicos y de regulacién de los organismos en eultivo no ha probado ser un instrumento muy stil para estudios microbiolosicos, genéticos y bioguimicos; su aplicacién a sistemas industrials apenas ha empezado (proteina unieelulat), pero no hay duda de que se id extendiendo.3-6 Las ventajas del cutivo continuo se fundan prinefpalmente, en 1. La velocidad especfica de crecimiento 41 puede establecerse (dentro de Jos limites del organismo) de acuerdo con las necesidades del experimento. Se puede selecionar un estado de atided meta lion parila yl contol de ste 2. Se pueden obtener células en un estado definido independientemente del tiempo. 3. Con equipo de laboratorio se pueden produc, comparativamente gran des Cantidades de material celular definido. Esto contrasta con los métodos fazch en los que, dado el sistema de pardmetros variables, no se pueden controlar las reacciones. Debido a que la concentracién de sustrato, S, es una funci6n del tiempo, t, la regulacién imtrinseca representa un estado transitorio con constantes de tiempo muy pequefias. En la tabla 4.1 se presentan las variables susceptibles de ser estudiadas en caltivo continuo; a través de la lectura de este capitulo ird apareciendo la fundamentacin te6rica y experimental de cada una de ells. CLASIFICACION DE LOS Sts /EMAS DE CULTIVO CONTINUO Los sistemas de cultivo continuo pueden clasificarse desde varios puntos de vista; Herbert presenté un esquema que considera los tipos y esquemas de ‘mayor trascendencia practica. Para mayores detalles se recomienda consultar la referencia original ‘Siguiendo los criterios de recirculacion de eflulas, mezclado y atimero de tanques, es posible describir Ios sistemas de cultivo continuo para diferentes ‘organismos de Ia forma siguiente: Criterio I: Reeireulacién de células ‘Sistema abierto Sistema cerrado. Clulas en ef fuente; no recreulsclén 9 Sin edtolat en el eluents 1005 de edtulas so parcial, recirculadas. al reactor “quasi continuo” Hjempio Un resetor agitado: tanque perfectamente Tague con ns reciselacién de 100%: x agiado y homogéxeamente aspera. no es proporcional ¢ (5, ~S) (en presencia ae texleos. Criterio I: Mezelado Qasiticacién de fos sistemas de cultivo continua 59 Criterio II. Nimero de etapas Una sola etapa No se puede tener un serie de sisternas corradot Se pucien cambinar sistemas cerrados con lin reactor abierto (acta como anque de Mutietapas Se puoden combinar sistemas aiertos para formic eadenas de 20 mds reactores; ln alimentacién de sustrato 4e hace total 0 pateialmente en el primer reactor. Homoséneo Tapque aatado (élulas homogéneamente disperss en tna sire homogénts dfs gue ¥ B= Heterogéneo, Revetor tubular Tanque de particin (os owanismos ton retenidos por sedimentacion). Pelicula aherida @ alguna superficle Hembra) De acuerdo con estos criterios un quimiostato es un sistema abierto, homogéneo y de una sola etapa. La figura 4.1 presenta el arreglo experimental fecesario para llevar a cabo el cultivo continuo. Los quimiostatos se utilizan ppara estudiar levaduras y bacterias; para el estudio de organismos pluricelulares fe han tenido que hacer algunas modificaciones, pero todavia operan en condiciones similares al quimiostato,? TABLA. Aplicaciones experimentales del cultivo continuo Variables independiontes Variables dependientes Time “Tans motabiliens (9 Veloce crecimiento CConcontracion esta (2 Goncentracon dl sustato (9) Composien etular Stststo imtante Exereeon estar Morfolosia eeular Velocidades de mutacién Patrones metaballe Seloccin de miroorenims con ali ‘Tempo de expresiin del mutante- iru [Concontraclon del producto (P) utivo mixte i femperature 1), Actacionatitacion (kya) {anibidores Ieores de enzinas ‘Agsntse miutagenions Prerrequisitos de operacion y téenicas Para mantener en operacién un sistema continuo es necesario sleanzar y mantener un flujo permanente y constante. Durante las operaciones de estado estacionario no deben ocurrir cambios en Ja concontracién del sustrato, en el niimero de células y en la concentracién Jntracelular de metabolitos. Como resultado de las condiciones ambientales constantes (seracién, nutricion, pH, temperatura), las propiedades regulatorias de las células aleanzan estabilidad durante largos periodos de tiempo (véanse Jas figuras 4.2 y 4.3). Pueden ocurrir fallas o inestabilidades en cl equilibrio por imperfecciones LWenicas © por efectos biol6gicos. Por lo tanto, es requisito indispensable pare |i eficiente aplicacién de este método contar con un equipo perfecto y confiable [Los requisitos minimos para una unidad de laboratorio han sido enumera- ios por Fiechter:8 un tanque esterilizable; conexiones de lineas de aliments ion aséptices; filtros y accesorio de muestras;agitadores y aireadores; control de pH, temperatura y espuma, y volumen de trabajo “verdadero” (igual al60 Cultivo continuo ‘medio de [se] oe Vt bomb de {uj warable M antral de pH joe ice xt petluente ws v fermentor tis microorganisms de fuente Fatural era, lapos, esate, tc ano de temperatura Constante agitador mognético Figura 4.1, Aparato experimental pars cultivo continuo de enrquecimiento. ‘yolumen del guido sin acracién ni agitacion); dispositivos para transferencia de medio, fcida y ‘cali (se usan bombas peristlticas de flujo variable). La figura 4.1 muestra todos estos elementos. ‘Como tos estudios con el quimiostato son generalmente largos, todos los elementos deben ser de buena calidad, resistentes y de confiabilidad operacio- nal. ,dores no utilizan téenicas de cultive continuo por temor 1 fallas en el equipo, peto éste se puede construir més o menos fécilmente en scala 0 bien comprarlo a un precio razonable porque, aunque la Jos resultados y el tiempo que se ahorra lo justfiea ‘TEORIA DFL, QUIMIOSTATO El quimiostato, figura 4.1, es un cultivo en el que se introduce continuamente medio fresco a una velocidad uniforme; el volumen del cultivo se mantiene constante por extraccién también uniforme de ese cultivo. IMealmente, el mezolado debe ser perfecto, es decir que cuando una gota del medio entre al reaotor, instanténeamente deberd quedar uniformemente distribuida en el cultivo. Esto significa en la prictica que el tiempo requerido para mezelar un equetio volumen del medio con el cultivo sera también pequeto comparado Gon el tiempo de retencién, t,, dado por V/F, donde V es el volumen y F la velocidad de flujo volumétrico del medio. Considérese un cultivo en el cual ef crecimiento de biomasa esté limitado por la cantidad de un solo sustrato mientras todos los demés nutrientes estan. Teoria det quimiostato 6 jos eo} 20) § loc F of 3 st & Male 2 Ea ed joa E = aor & 10) 1D ape g * * = eae ia Se ce oma. 2 3 Baorotee |g ° o 002 04 06 08 10 "Velocidad de erocmionta th) Pigure 4.2. Composicion macromolecular de Aerobacter aerogenes en cultivo continuo a fferentesvelocdades de crecimiento (de Herbert, 1961) ‘en exceso, Si dejamos que el cutive prosiga en forma batch sin adicién de fnedlio y después inicigmos el flujo del medio (entrada y salida) y empezamos 4 medir la concentracién de la biomasa a la salida, veremos que pasado un liempo (usualmente 3 tiompos de residencia), la concetracién celular y la del fustrato limitante permanecen constantes. Este estado estacionario es autorre- julable; una disminucién en la concentracién de biomasa va asociada a un fiumento en la concentracién del sustrato limitanta, lo que aumentaré Ia Welocidad de crecimiento y restableceri las condiciones de equilibrio. ‘Velocidad expeeifica de crecimiento El cultivo continuo estd’ muy relacionado con la cinética de crecimiento det inieroorganismo, puesto que utiliza la correlacion entre actividad metabélica y imiaco NSPKMolimitado {en0 2600) ml ce culevo ma de bactas 00204 06 08 0 02 04 06 08 “Tena de dlucibo th") ‘gure 4.3. Vatiaciones We la concenteacin de Aerobacter aerogenes seg la velocidad de filueion. La lines discontinaa indica los valores teéricos para la concentracion bacterans, ‘uponiendo el rendimiento constanteN 7 62 Cultivo continua isponibiidad de sustrato. El control de fa velocidad de suministro de sustsato fila célula permite fjar condiciones definibles de biosintesis, metabolismo ¥ feaulacién de la célula. La ecuacién de Monod (véase cap. 3), que exprest la Telucion sustratowelocidad de crecimiento, puede describir esta situacién: aie uw La ecuacién se cumple cuando la eélula esti en presencia de un exceso de sustrato, las células estin ereciendo y no hay inhibidores presentes. En los procesos batch, el crecimiento exponencial se alcanza después de un ‘period lag durante el cual la. célula se organiza preparindose para un crecimiento sin restricciones. En este caso: = ux a dee (3) donde tg tiempo de duplicaciin, Monod demostré que Hes variable y sy dlopendenca dels concentraion de sustratoe= Hs § a if K+ a ‘Todas las teorias de cultivo continuo se basan en este modelo, que ha sido ampliado, para descrbir sistemas més complicados. Las ampliaciones de este inudlelo deben ser consideradas después de una revision critica de todos los datos experimentales y de las condiciones en que se obtuvieron. Para informacion més detallada_se_aconseja al lector consultar el trabajo de Fenel,10 Hough,l! Pirt?™ [cota K En Ia figura 4.1 la entrita-det-tiedio a una conoentracion So y a un flujo ‘yolumétrico.consiante, F, dividida por el volumen del cultivo (células, medi qs) se denomina tasa de dilucién D =F/V, y representa la Unica variable en el Sistema, La tasa de dilucién representa la tasa de flujo por unidad de volumen. aumento en la biomasa est4 dado por el balance de biomasa siguiente: Cambio neto de biomass = crecimiento — sslida 15 Para uit intervalo infinitesimal de tiempo, dt, el balance para todo el cultiva es V dx = V bx dt Fx dt (61 Teoria del quimiostato 63 dividiendo por el volumen V, ‘couacion [6] se transforma en: dx. & 2 WDE m in el estado estacionario dx/dt =0, y por tanto D=H {31 Balance de materia dela biomasa y del sustrato limitante Un balance del sustrato limitante es as. 1 dS = DS, -DS—-y Hx (1 Cambio = entrada — salida ~ consumo ho donde Y es la constante de conversiGn o rendimiento que describe la relacion tentre la biomasa formada y el sustrato: dx as, m e ee Peso de oflulas formadas feeder “¥ Peso de sustrato consumido ued on el estado estacionario dS/dt=0, y sustituyendo la ecuacién [8] se obtiene: (So = 9) Os) na Para poder obtener los valores de Sy % (valores de régimen permanente) se sustituye la ecuacién [4], y se obtiene: Ao) ¢ (14) y para x se tiene: KD x vs itn) 13) Las concentraciones de Ia masa celular y del sustrato en el reactor puedenSl 4 Cultivo continuo predecirse para un valor dado de la tasa de dilucién si se conocen tas Constantes Hig jx, Ky ¥ Y del organismo usado. En cultivo butch se pueden determinar estas constantes: se halla pip sq Tidiendo la pendiente méxima de la curva de crecimiento, y K, es aproximadamente igual al valor de S en ta fase de crecimiento estacionario. En Ia figura 4.4, x y S aparecen como funciones de D para diferentes valores de Sy y K, de un organismo hipotético ‘con las siguientes constantes Hmjx = 1.0 h”? y ¥=0.5. Se aprecia que tanto K, como > afectan el valor maximo de D en que puede operar el {quimiostato, La concentraci6n del nutriente limitante $ es muy baja en todo ‘el rango pero cuando D es alta sufre un incremento exponencial ‘Tasa de ditucién maxima o de dilucién critica (Wash out) La diluctén maxima puede obtenerse cuando S=Sp ¢ insertado este valor en la ecuacion [4] D, a 6) #* Dertce = SF Ry 06) este valor Dy of el valor figura 44. 10 de D, Ello explica el efecto de K, en Ia Productividad En un quimiostato la produccidn de blomasa por unilad de yolunien por tunidad de tiempo del eultivo se denomina productividad, P. P= Dx a7 Lo importante 3 encontrar el valor méximo de este producto. Para ello se diferencia Ia ecuacién [17] y se iguala a cero (la solucién representa un maximo): eo 3} oD Tike mn fh am 09) sustituyendo la ceuacién [19] en la ecuacién [15] se obtiene: Prix Soin ¥ [Se + VER #59] (20) La figura 4.5 es una representaci6n de las ecuaciones [17], [19] y [20] en la que s ve cémo se afecta Ia productividad respecto a K,. En'este sentido x(Sp = 109/1 x, Slt 3 Otrtras 04 0s 06 07 os oo “Tes lucida D, th!) ‘igure 44. Efecto de S, y Ky en cutivo continuo (estado estacionario) con limitacion de fatbono,Parimettos Heyy = LOW", Y conviene aclarar que dependiendo del sustrato, K, varia para un mismo forganismo. Por ejemplo, en el caso de Aerobucter aerogenes, Ken mg/l es 12.3 ‘con glicerol, 4 con glucosa, 3 con manitol y 20 con Iactosa, ‘Cuando ‘se opera a una tasa de dilueién mayor que la indicada por la ‘ecuacion [16], la teoria predice que x deberd ser cero, pero en condiciones texperimentales y a estas tasas supercriticas nunca alcanza cero. No esté muy tara la razén., pero se supone que debe haber un reacomodo metabolico que reduce los carbohidratos y grasas almacenadas y aumenta la concentracién de proteina, ‘Comparacién de productividades entre los sistemas barely continuo Como conseciencia de la autocatilisis, 1a productividad de un sistema66 uitivo continuo 050 Limitacién por © Produetivicad xs ‘O57, 086 035 0a? 2000, 0.12 a. 8 % 00" 0350.80 | 0.75 1.00, “Tosa de divoion| m0 028 05)" 075 1.00 ‘Tas de svesen Figure 4.5. Efecto de Ky en laconcentracion celular, X,y en la produetvidad de un cultio ‘continuc. Parimettos: Yy = 0.5, 8. = LO g/l, stmiy ~ 1.0, losvalores de Ky se presentan con niimeros arabigos: 1 {0.1 g/t}, 2 (0.01 g/I}y 3 (0.001 g/t). continuo es mayor que la de un cultivo batch del mismo volumen. Para poder hacer ina comparacién cuantitativa necesitamos establecer algunas suposicio- ines: la p del sistema durch es constante y maxima hasta que el sustrato se ‘acaba, Xx €S igual para ambos sistemas y t, es un tiempo muerto. entre cada fermentacién (considers el periodo dag y ef tiempo requerido para limpiar yy recargar el fermentador), El tiempo de duracién en batch es ee eg be et) to produetivda en butch ser maxima cuando YS, (22) . 3} Hvis YSo Pombes 7 age wr ae p41 tg la prodvctividad méxime del cultivo continuo esté dada por Ia ecuacin [19], YXmix PO rm "¥ [S0+K - VER +S | 23) Teoria del quimiostato 7 Si se divide ta ecuacidn [24] entre la[19] y la [25] se puede comparar los ‘dos sistomas. La tabla 4.2 los compara para condiciones particulars: es notable como la productividad en continuo es superior a medida que la velocidad de crecimiento es mayor, En el proceso de proteina microbiana (yéanse capitulos By 9) se utilizan grandes fermentadores que operan a altas Dy. con fonganismos de alta. Se ha. aplicado el mismo razonamiento a otras fermentaciones; empero, los resultados. no siempre. siguen. el mismo patroni6,10,13.18 Jo que se debe a que los productos del. metab pueden o no depender de la velocidad de crecimiento, y las condiciones fambientale (pH, temperatura, aeracién) tienen un efecto mayor, Limitaciones de Ia teorfa del quimiostaro La teoria anterior se basa en ciertas suposiciones que no se cumplen en todos los casos. La comrecci6n y los cambios a las suposiciones han dado pie a una fran cantidad de investigaciones y modelos cinéticos que pretenden expresar la cinética de los sistemas, Hasta ahora se ha supuesto que Y es constante, que 1 et regida por la ecuacién de Monod e independiente de la naturaleza quimica del sustrato limitante (un solo sustrato limita). De las tres. suposiciones anteriores podemos decir que ninguna de llas se ‘cumple en Jos casos reales, pero que en ocasiones la variacion es tan pequetia {que se puede considerar que si se cumplen. Herbert!5 estudié la composicién intracelular (protefna, ARN y ADN) de Aerobacter aerogenes wtilizando glicerol como sustrato fimitante en un medio on sales minerales y controlzndo Ia velocidad espeeifica de crecinienty mediante cambios en la tasa de dilucién, La figura 4.2 muestra la masa celular pmmedio y los porcentajes de ARN, ADN y proteina por unidad de peso eco. Los poreentajes de proteina y ADN cambian muy poco con D, pero la masa celular y el ARN aumentan considerablemente al aumentar la velocidad de crecimiento, Cuando el sustrato lmitante se cambié de glicerol a iones moni se observaron cambios similares en ARN, ADN, proteina y masa TABLA 42 Comparacion entre las productividades de eultivo contimo y batch. Indculo 3% (xo).¥ 6 horas de tiempo invertio (ta) entre cua fermentacién discontinuas Relacion Veloetdad de creimionto Tiempo de duplicecion Prod. continuo toh) Gah) Prod. batch 1382 98 We 0691 10 16 0345 xo 33 017 40 43 Sos 30. 37 bond 1620 3468 Cultivo continuo celular, 1o que implica que jes importante para determinar la composicion de las lula. Cuando se comparan Ios efectos de la naturaleza quimica det sustrato Timitante se encuentra que, si el elemento que controla es diferente del carbono, la concentracién celular responde de manera especial a tasas de dilucién bajas. En la figura 4,3 se muestra que la limitacién por N, S, P, Ky Mg producen un erecimionto denominado hipertrofica.16 En el caso de N el ‘alejamiento del modelo debe ocurtir porque las células que crecen a bajas tases de dilucién almacenan carbohidratos en mayor proporcién que a tases mayores, Io que produce un aumento en la masa celular.!7 ‘Tempest er ‘al 18-20'han estudiado este fendmeno para diferentes limitaciones en diversos ‘organismos, concluyendo que cuando la eélula esta limitada por un elemento diferente del C produce un “sobre flujo” de metabolitos para asegurar su mantenimiento de enerpia. Los Y para C son menores siempre que la limitacién sea por S, N, P 6K. En esas condiciones el organismo acurnula metabolitos (limitacion por N) pero también excreta productos parcialmente oxidados del metabolismo.19-2! Recientemente se han postulado Ios siguientes ‘modos de accién de los nutrientes limitantes: ‘Sustato timicante Modo de accion (Carbon enereia ‘Disminuye el sminisre de carbéa para big intess 0 enerpa, Inhibe Io sintess do proteinas. Retard la sintsis de cidos aucleicos y/o produccign de ener Reduce ls sintesis de Seidos auclicos 0 de la pared collar yo ke estructura dela mem ‘ban o permeabiidad. Nitrégeno o azutre Fosfato Magnosio 0 potasio Este aspecto del cultivo continuo puede tener una gran aplicacién en la produccién de metabolitos especificos o bien en Ia producci6n de proteina microbiana, utiizando el nutriente limitante como un factor de control de la ‘composicién intraceluler, En la tabla 4.3 se muestra cémo es posible mani- pular la relacién proteina/ ARN a diferentes tasas de dilucion con limitacién de C, Ny P. En ef proceso de proteina microbiana se pretende que. dicha relacién sea mdxima y que Ia tasa de difuci6n sea alta, pues el contenido de 'ARN limita la utilizacién de la biomasa como limento para humanos. Es muy probable que las manipulaciones de este tipo sean necesarias para optimizar et Proceso. ‘Variaci6n del rendimiento y energfa de mantenimiento Cuando existe en ef quimiostato limitacién por carbono, el rendimignto’ varia con Ia tasa de diluci6n. El efecto es mucho més variado para bajas D. Para poder explicar este fendmeno se han sugerido dos modelos: Metabolismo endégeno (K). Herbert24 encontrd que los bajos rendimientos a ba- jas tasas de dilueion podrian ser explicados y estimados sie sugeria que el meta- Teoria del quimiostato 69 ‘TABLA 43 Composicién macromolecular de A. aerogenes cultivado en quimiostatos, limitados por carbono, nitrogeno y fosfato?? ‘Nurrioatelimitante Glucose de entrada Amonlao de snirada Posjoro de entrada ma (500 mei (40 mel (27 mail) Tasade didn Gh) 022 OAS O77 O24 050 O78 “02s O50 070 Protetna (2) 3 636 720° $28 524° sab 720° 6rd 6s ARN CO) 133 182 248 ios i70 209 102 171 192 ADN GH) sa SL Lg ea ast Sic a Geodhitwtoo) «SDS TBAT 33 189 BRS tat itd gael ara mage Sad yi 9 ARN peelings ait 139 29 Proveina tee aa ee) ee ae ARN bolismo endégeno consume la masa celular y que este metabotismo es impor. tante a tasas de dilucién bajas. La tasa de produccién de microorganismos, dx/dt se puede representar por: SG wx p26) onde K es la constante de velocidad del metabolismo endégeno. La tasa de Uutilizacién del sustrato se expresa por: as ai (27) onde Y es el rendimiento que se cbtendrfa si todo el sustrato fuese usado en frecimiento celular y no se consumiera ninguna masa. Aplicando los dos concep- 0s anteriores a un quimiostato y haciendo un balance de materia se obtiene ue x y S pueden expresarse como: Sean oiDee Ee s Py euiando 1 sigue la ecuaci6n de Monod. Sinclair et ai24 aplicaron las feuaciones [28] y [29] y encontraron que el modelo se ajustaba muy bien a los ‘osultados experimentales, aN70 Cultive continuo Exergia de mantenimiento (mJ, Pirt? supone que los organismos y.células requieren de energia tanto para crecimiento como para los llamados propésitos de mantenimiento. Algunas funciones especificas de mantenimiento son: recam bio del material celular, trabajo osmético para mantener los gradientes de con: centraci6n entre las célulasy el exterior y la movilidad celulr. La energia de mantenimiento se define como la diferencia del sustrato total ‘gonsumido (AS,) menos el sustrato empleado en el crecimiento (AS,). La ‘energia de mantenimiento se representa por OS;.. Podemos escribir: ie aS, AS, + AS, [30] =0 el “verdadero” rendimiento para crecimiento Yqy es: x Sani Bi 5, Un balance de enerpia nos d: Velocidad total de = Velocidad de consumo + Velocidad de consumo [32] consumo para crecimiento ara mantenimiento si suponemos que para una cantidad de biomasa, x, la fuente de energéa se ‘constime a una velocidad constante de mantenimiento dada por: 2) 1 donde m es el coeticiente de mantenimiento. Sustituyendo les ecuaciones [30] [B11] y [33] en{32] tenemos: AX mmx Ba ‘que es igual a: 35] Cuando el concepto de energis de mantenimiento se aplica al crecimiento en lun quimiostato se tiene que: D¥eq (Sp — 9) DimYq Beal Teoria del quimiostaco n D+my, (D+m Yq) Ks ie ae - O+Yq =) CComparando los dos métodos se encuentra que (38) La tabla 44 presenta algunos valores para el coeficiente de mantenimiento, obtenidos para diferentes organismos en condiciones experimentales diversas, Abbott y Clamen25 han demostrado que el coeficiente de mantenimiento es lun factor que debe tenerse en cuenta al hacer 1a eleccién de las cepas para la produccién de proteina microbiana, Cuando m es grande y la tsa de Doperacién no es muy alta, Ios eostos por mantenimiento son sustanciales. TABLA GA Algunios valores del coeficiente de miantenimiiento para diferentes fuentes de energials 8, 26,27 Orsanismo Condiciones de cultivo (Og sustratolecéllas- by 1 ewe serio aco Oia ‘loweae® Se1Gblc0 imitado por glucosa 0.94 Pchyriopeum® ——_serdbleo, lucosa 0.022 A corogenct 20, limitado por tiptofano 2.880 - 3.690 SB ceresigiae 0, glucose 0.036 -0.360 G wise Sstrabiea,acetato 0.170 witie erGbleo, go de tuna 6.090, ‘A. terozenes® ser6bico,slcosa 180 © Cultivo continue Otros modelos que explican la variacién en el rendimiento son el concepto lle viabilidad y el efecto de la temperatura en cultivo continuo. Concepto de viabilidad Si se hace un balance similar al hecho en la figura 4.1 para obtener la fecuactén (6) pero considerando que algunas células mueren y que la produe- i0n de células muertas es proporcional a la concentracién de eélulas vivas, se ene: ‘Velocidad de mortalidad celular = x B917" 2 Cutivo continua aa) (So ~ §) (40) 1 Ot (40) K,(0+K +7) uae 41 Hai —D+K49) te wl (42 pty | ‘en donde v es la viabilidad y e3 Ja constante de la tasa de mortalidad. ‘Topiwala y Sinclair2® encontraron que a tasas de dilucién bajas las célules muertas representan un alto poreentaje del total de céhulas, mientras que a fasas altas ese porcentaje disminuia notablemente. Los resultados variaron de 1D =0.04 -0.38 y el porcentaje de viabilidad de 90 a 98.4. Efecto de la temperatura en cultivo continu Topiwala y Sinclair29 consideraron que tanto el metabolismo enddgeno. K, como la constante K, eran funciones de la temperatura. Emplearon un cultivo de A. aerogenes en phucosa.y la temperatura vari6 de 25 a 40°C. En esas condiciones encontraron: KCN) = 2.71 x 108 x erseoe/RT (31 1 me D6 UX 10H Rea 441 KD ‘Ambos modelos predicen una curva como fa de la figura 4.3 para limitacién de carbono, Diferentes expresiones para ‘Ademés de la ecuacién de Monod han aparecido otras que describen la velocidad tspeeffica de crecimiento; por ejemplo Contois? propuso la siguiente: 8 min \Bx+ 8, [45] -Existen muchas otras ecuaciones y se recomienda revisar las referencias 12 y 26 para mayor informacion. donde B es una constante. LLimitacién por oxigeno E} caso particular de [a limitacién del quimiostato por oxigeno disuelto rereee atencin especial, pues es una de Tas limitaciones que aparecen con in ii ulMM i lll _ Teorta del quimiostato 3 frecuencia, y siempre se desea tener la mayor concentracion celular posible en tun fermentador. Sinclair y Ryder26.30 hicieron bslances celuares, del sustrato.y’ del ‘oxigeno en un quitiostato, y aplicando una ecuacién del tipo Monod para la {asa especifiea de crecimiento encontraron: Ray - CL) 9 ME (46) D+k s=% x pra 147) Ko (D+K) ¢ L or ae (48) bd x [49] Yeo donde xg es In concentracidn celular cuando el oxigeno limita, kya es el coeficiense voliméuico de transferencia de masa, C, * et la concentracién del ‘xigeno disuelto en equilibrio con el oxigeno dela fase gascosa, Cs Ia feoncentracién de oxigeno disuelto, Ko es la constante de saturaciin’ de la fecuacién de Monod para limitacién por oxigeno, Yq es el rendimiento celular por unidad de oxigeno. La tasa especifiea de consumo de oxigeno Qo, ¢s igual 2 ka (CCL) att (50) © bien: ) (51) donde Y, =rendimiento endégeno para oxigeno. La figura 4.6 muestra el perfil de las concentraciones eelulares que aparceen si se aplican los ‘modelos de limitacion por earbono y por oxigeno. Los pardmetros usados ent la simulacion fueron tim jy = 1.0 N”, K,=0.1 afl, Y= ‘05, Yo = 10, Cyt =0.008 g/l y C=O. Las curvas son para Sy = 10 50 s/t y kya vari6 de 10 a 1.000 bh . fn Ia figura se ve claramente como la Coneentracién que predice la limitaciOn por C a tasas de dilucion alta es inayor que la obtenida’ por limitecion de oxigeno. En un fermentador ta1” {C) Sp = S0a/1 \o X gramosllitro “000° 0110" 020" 040" 060," 060 " 0'70” felucon th") Figura 46, Efecto on a concentvacién dela biomass, x, cuando la limitacion es por carbono (© 0 por oxigeno (0) a dos niveles de concentraciOn de wustratoincial$, y custo de kya h-"), Pardmettos: Y,= 0.5, Yo = 1.0, Ky = O.Lg/ls mie = 1.08, ‘concentraci6n de biomasa, x, siempre tendr el valor més pequenio, por lo que 4 tasas de dilucidn alta domina Ia limitaci6n por oxigeno y la Unica manera de climinarla es aumentar ta transferencia de oxigeno (véanse capitulos 5 y 6). Usos de cultivo continuo Como se indica en la figura 4.1 el cultivo continuo puede ser utilizado para ‘enriquecer y/o seleccionar una cepa o cultivo mixto al hacer constantes las, condiciones ambientales y la tasa de dilucién, Después de algin tiempo se hhabra establecido en el cultivo el microorganismo 0 cultiva mixto que mejor 2 adapte a las condiciones establecidas. En la tabla 4.5 se listan algunos productos obtenidos por fermentacién continua. Entre ellos destaca por su escala e importancia industrial la proteina unicelular. Es posible que el alcohol pronto sea producide exclusivamente-por a | Teoria del quimiostato 5 TABLAS Algunos productos quimicos obtenidos por fermentaeion continua Pee en et Tuan Glucoaromerase AS osama. Gis ‘okt ten shen foci Sito pssnico\ Glormtnicot Fomine ‘td facomco enol Peeing ict Ako ition Extnptomisia Viti By i aa Ras mM ee la misma técnica, Los demés productos presentan problemas téenicos o tienen limitaciones de mercado que los hacen por el momento econémicamente inaceptables, pero en el futuro se podrin produeir por cultivo continuo, al ‘expanderse los mercados y la distribucion de algunos de estos productos (x.g7 antbiticos y enzimas). Quimiostatos en serie Fl unir en serie dos quimiostatos, como se ve en la figura 4.7 Meva a un proceso de multietapas con diferentes condiciones en cada etapa. La tasa de ilucién en el segundo reactor esta dada por: a on Faz Beara de ee Aienatnen® fyamaas aioe wsisa) Vi Va” Va D La biomasa en el primer reactor esté dada, por la ecuacion [15]. En el segundo reactor se obtiene haciendo un balance de biomass: xs = hy xa + Dia x ~ Da x [53] a % Su Ki Figura 4.7, Dos quimiostatos en seri. Loss de tujo, el volumen, Ia biomass y ln concentra polos F, Vy $ represenian las velocidades in del sugttato mitante en varios puntos.76 Cultivo continu’ as . 2 réginen permanente"? =0, i euacin [53] 3 conitt en 2 — Da) xa + Dia 1 = 0 [54] y ty = Da Dia [5] De Ia ecuacion {55} se deduce que H2 < Ds. Reatreglando la ecuacion [55] s¢ obtiene: 2 Bae 56) Davie i si x; 8 finita, 3 6 finita no importa cuan grande sea Day lo que significa ‘que no hay difueién critica para el segundo reactor. Haciendo un balance del sustrato limitante para el segundo reactor se tiene: as; asa — en donde a3 As ue ko Wee ky Ng- 031) ge | sid < 0.8 mm 13] 2 1 Nec 3 s 2. Teoria ule la penetracion (Highie, 1935). La masa se transfiere al. 1iquido pon de aapate mo}eclar no permanente 6. Determinaciin de « EekenfelderS encontr6 que el area interfacial es T 02a i) Ce ual 7 a Vd Vp fn donde os «9% donde Q = flujo volumétrice de aire, Hl, = profundidad del liquide, V = volu: men del 1iquido, dy =didmetro de la burbuja, Vp velocidad ascendents euminal de fas burtujas, La ecvacién [14] no es aplicable en el caso de tangues agitados. Calderbank® logr6 correlacionar algunas variables de operactém y propieda- des fisicas del sistema para el edlculo de a ie eretond one ae A omedio que medirlo experimentalimente en el equipo y en las condiciones de ‘operacion que se deseen establecer, ‘Les el tiempo de contacto. 3, Teoria de la renovacion de la superficie (Danckwerts, 1951). Es uti modificacion de la teoria de Higbic, en la que se introduce el concepts de fenovacidn aleatoria de la superficie, VES GOA (91 aa. ‘ k, > VOS eo 4, Teorie de frontem {boundary layer). N’ en donde Nek (G-OA (10) CCorrelaciones para estimar kya La tabla 5.3 resume Jas corelaciones més importantes desarolladas en los lume 30 aos. Casi todas elas s basan en fa oxidacién de sulfto y por lo ame even a6lo como guia, Por 10 general el valor de Ka obtenido por fultito es dos 6 tres veces mayor, aunque no siempre es 3s Para fuidos. no newtonianos las eortelaciones deben aplicarse con mucho evidado, pues se deben corresir por un factor de viscosidad que no ha sido tstudiado con detale en donde Ky = f(Nke Neo) Li importante es que todas las teorias Hlevan a una exuaeiOn_ de la forme k AG, =O) ua86 Transferencia de oxigeno y disefio de fermentadores Conviene recordar al lector que las unidades de cada correlacién son diferentes y, en el caso de quererlas usar, deberd recurtirse a la fuente ori para tener las dimensiones correctas, ial te sae tie ut ae De todas les corrlacones que se han presentado’ se pueden sacar las siguientes conclusiones: \ tel a se ha expresado conto funcion de vanbles de operacion y disso ONY, Netw): §) tienen tn rango de volémenes en que son vidas 6) ninguna de ellas es adimensional Los valores tpicos de kya para tangues agitados son de 60 a 240 n°", y | fos de Na de 50 100 mf. th ‘Se-puste concluir que. la. predicclon de kya. presenta, Jos siguientes problemas 2) selecain de un método efective para medio in stu 6) no se puede obtener k,extudlando cl comportamient de la burbs, por et demasiado complejo; { «) no existe un buen rudtodo de estimacion dea 4) no se sabe qué ZC utilizar evando se tenen fermentadores de diferentes lamas; ) elk vara en el curso dela fermentacion; 1 el kya depende de la escala de operacin, pues a escalas pequenas la aeration superficial es importante y a escals mayores la determinaciin de k, a seve afectada pore lempo de residenca de as urbues. 2) los abentes tersoactives(antespumantes)afectan a ky 1) atkja medido en electroitos ex mayor que el ky w-de‘aqua pur Apesar de todos los problemas anteriores, el ky el pardmetro que totale fa eopoedl de Ulaabrenctd dS tgcno Ac unlanants —— Disefio de fermentadores 87 Formas de alterar kya Si se desea modificar el ky 2, generalmente para aumentarlo, se pueden hacer Jos siguientes cambios basados en la ecuacion [4] Na k, fe} (C= C,) promedtio 2) diluir el ealdo de fermentacion ) aumentar N 6) cambiar el digmetro del impulsor 4) cambios en los bafles £) cambio de viscosidad (disminucion) 2) aumento de la velocidad superficial del ace hh) aumento de la presion 1) enriquesimiento con oxigeno 4) variar el tamaio del indcuo. ‘Ademis, segin las correlaciones de la tabla 5.3, un aumento en (Pa/V) producira un ky. 8 mayor. DISENO DE FERMENTADORES Todo fermentador debe cumplir con dos requisitos fundamentales: mantener lin medio homogéneo sin zonas "’muertas” ya la yea transferir oxigeno al ‘medio empleando el minimo de energia posible Cuando se inicia el disefo de un fermentador, de cualquier escala, se eben considerar los siguientes aspectos: a) mezclado y patrones de flujo ) configuracin geométriea y tipo de reactor ©) transferencia de oxigeno ) consumo de enerzi Cada uno de estos aspectos debe estar enmarcido dentro de las especitica ciones del equipo disponible, Por ejemplo, Ios tanques agitados de més de 10.000 littos no tienen, por lo general, un control de la velocidad de agitacién, fino que ésta es fija y depende del tamafio de motor que use. Otro ejemplo lligno de mencién se refiere al tipo,de impulsor; deberd procurarse que tolos Js fermentadores tengan impulsores del mismo tipo y tamafo, para no tener {que hacer un fuerte gasto en equipo de reserva y en mantenimiento. Mezelado y patrones de flujo Las figuras §.2 y 5.3 muestran claramente los diferentes patrones de flujo que fe pueden obtener en un tanque agitado, dependiendo del tipo de impulsor ltilzado y de si se usan dafles para evitar el vértice. En la figura 52a el impulsor de flujo axial genera corrientes de flujo paralelo al eje de la flecha que gira (movimiento longitudinal). La figura 5.26 presenta un impulsor de flujo radial, tipo turbina, que genera corriente de flujo en direccion radial © tangencial (movimiento transversal y de rotacion). En fermentacién se prefiere el segundo tipo de impulsores porque asegura un88 Transferencia de oxigeno y disefio de fermentadores mejor mezelado, y al absorber més energia el P/V es mayot y por lo tanto el kya. La figura 5.3 muestra como afecta a los patrones de flujo el uso de bales. En Ia figura 5.36 se ve un patron tipico de un tanque de fermentacion con cuatro bafles, con Jo que se logra un mezclado eficiente, Un mal mezclado acartea, ademas de pérdidas de producto y desperdicio de energia y espacio, un cambio en la cinética del fermentador.17, 18 Tipo de reactor A nivel de laboratorio y de planta piloto existen muchos tipos de fermenta- dores, pero a scala industrial y en operacién son cuatro los tipos principales: el Waldhof, el de turbina, la columna burbujeadora y el airlift. En la figura SA se pueden apreciar las caracteristias, diferencias en geometria y patrones de flujo de estos fermentadores. De los cuatro tipos, el fermentador de turbiina ces el mis usado en fermentacion por ser capaz de suministrar altas cantidades de oxigeno por unidad de tiempo y de volumen, BI fermentador tipo airlift opera con menos energia y ¢ capaz de suministrar més oxigeno, pero todavia si us0 no est muy difundio. Las formas y velocidades de las corrientes de Liquido en el fermentador definen un factor tlsmado redispersion de burbuja. La eantidad de burbujas tecién formadas o redispersas en el fermentador se obtiene con la funcisn de istribucion del tiempo de residencia de las burbujas. La distribucién del tiempo de residencia muestra las cantidades relativas de burbujas de diferentes edades: la edad de la burbuia se cuenta a partir de su formacidn hasta ol ‘momento en que es redispersada.19 La figura 5.5 muestra curvas de distribucién de edades, directamente relacionadas con las configuraciones de la figura 5.4 Las figurés intentan dar una idea aproximada de las diferencias entre Tos fipos de fermentadores. Un ‘anilisis cuslitativo de las curvas en el fermentador de turbina indica que la ccantidad de burbujas nuevas o redispersas es muy alta. Esto se debe a que los dos impulsores crean corrientes pequeftas y por lo tanto alta redispersidn. En el airlift hay muchas burbujas con un tiempo de residencia largo, lo que indica que la redispersion no ocurre con frecuencia, La distrbucion de edades de las burhujas es, por dos sizones, un concepto importante desde el punto de vista del diserio, Fl tamano del fermentador y la configuracién geomética influyen muy marcadamente en el patién de flujo 'y A. Impvleor de . Impulsor de oe luo oxi uf radi {oropete) (iursinal Figura 5.2. Patrones de flujo. A: impulsor de uo axial (por elemplo, propel); do Maj radial (por ejemplo, tubina) 3: impulior -ransterent |A. Tanque sin bafles fermacion de vortice iC IG) | mee ey Pulte) 8. Tange con batt pare oes NS, Pigura 5.2. Compsracién de patrones de flujo en tanques con o sin defectores (bafes). {A tanque sin bales (Forms vértice)W: tanque con bafles (no se forma vértce), i la distribucién de edad de las burbujas, Como resultado, le distribucién de Glad de las burbujes que ocurre en un fermentador pequefio no se puede obtener en uno mis grande pero similar, porque las comtientes de flujo erecen Gon el tamafio del fermentador. La segunda razén es que la velocidad de de Ia burbuja cambia bastante con la edad de ésta. La concentra- fidn de oxigeno en el interior de la burbuja disminuye por transferencia al Inedio, por cambio de presion hidrostitica y por difusién del CO> producido, Se ha, informado, recientemente de un método que considera In eriad de ta hurbuja y el concepto de redispersion.!9 Configuracion geométrica Ia geometries de los fermentadores de tipo tanque agitado se ha estandarizado; ‘la figura 5.6 se presentan tos valores més comunes y en funcidn de ellos se ffectiia el diseno y el escalamiento de los fermentadores. En la figura 5.6 la Twlacion entre la altura del liquido, y el didmetro del tanque es igual a 1 oe Columna beurbujesdora Tipo erste wana igura 5.4, Patrones do fujo para diferentes tinos de fermentadores,90 Transferencia de oxigeno y dlsefio de fermentedores Fraecion = F ‘ermentodor Wiaishot Aermentadr de tubing tiempo de rerigencis = T r - calunna formontader uroujeadora tipo airife pena 7 rr ‘Figura 5.5. Curvas de distebucin de tiempo de rexdenea para diferentes tipos de fermen ‘dares, aunque exteriormente el tanque parezca mis alto, pues solo se utiliza de 75 2 60% de su vulumen llsl. A medida que la escala aumenta la relacién se hace mayor de | (aunque se siga utilizando el mismo porcentaje del volumen total) La figura $.7 muestra varias opciones de geometrias y niimero de impulsores. Guando H,/D,>1. se emplean dos impulsores para asegurar un mezclado cficiente yuna buena transferencia de oxigeno. Uhl y Gray,20 Gates et al.21 y otros han establecido métodos para ol diseflo éptimo de tanques agitados ppor turbina considerando otros aspectos ademés de la geomettia, ‘Transferencia de calor en un fermentador Las fermentaciones son_procesos_exotémmigos ¥ en ocasiones el problema de tmviamiento se. converte en el limitante del proceso (obtencién de proteina Ginigelular en paises teopicales). En la figura 58 se. muestran las formas onvencionales de tansferencia de calor: por camisa y con serpentines( En tanques menores de 400 litrs no es necesriaenfiiar con serpentnes, pero si son mayores se emplean sérpentinesy en ocasiones se deriva tia corsente del fermentador pars enfrira externamente Si se desea hacer el cdlealo pars la transferencin de calor se emplea a eeuacin [17] ee) Caray donde hy e& el coeficiente de transferencia de calor, La ecuscién, {17} se Disofo co formencadores ar femplea para tanques agitados, encamisados y funciona para dis trias.22 La tabla 5.4 se puede aplicar junto con la ecuacién [17] para eterminar las reas de transferencias necesarias. El serpentin es mejor fenfriador, puesto que el agua de enfriamiento que circula por él tiene una velocidad alta, lo que-hace que el coeficiente hy aumente, ‘Transferencia de oxigeno y consumo de energi La transferencia de oxigeno puede ser estimada como se indie6 al principio de mab fe He us fet eae comer eee Sy ce ame gg et PR Felacionesgoomévias pare un fementador eténdar Tipo de amy BAe Bales (aatctores impelerte |", Oe Dilire, _Nyslhaapm Tusdinede [lyfe oe to ano Depots | 9 10 - at tO vais Pais 10 aoa the N= ndmera de bafles ‘Riza 5.5. Dimensiones relciones seométrieas estindar para un fermentador92 Transferencia de oxigeno y disefio de fermentadores ‘TABLAS Valores relativos de los coeficientes de transferencia de calor comparados con serpentines Tubos Factor Serpentin _veriales Comisa Goetiiente de lado del mezclador oa 19 045 ‘Ares aisponible 1 as as felieua intern, agua de enftiamiento 1 a ney i i 10 1 Pelicula internay vapor deat x este capitulo; para el consumo de energia se debe consular el apéndice D. Las fiblas 5.5. y- 5.6 rednen datos de eficiencia de transferencia de oxigeno, Wuocidad de transferencia, Na, y la potencia consumida por unidad de Volumen. en procesos industries con fermentadores. convencionales y con Termentadores, de escala piloto, A nivel industrial se aprecia una diferencia «Gave las Termentaciones miceliles y las de lovadurp. F1 P/V de las micelles Gr aproximadamente tres veces mayor que para fas levaduras, mientras quo Shebnets de transferencia de las fermentaciones de levadura es de tres a diez Neves superior a la de las fermentaciones no newtonianas. Los valores de Nq TABLASS Eficiencia de la transferencia de oxigeno en algunos pprocesos de fermentacion industriat23-25 ‘Eficienca de rv Tipo de Fementador Volumen transferencia Na (i) proceso {tipo} ‘sel} (100, /HP-1) (mg, th) 1000 gat Teadom Waldhll 7600 3 sit 3 Levadura — Waldhot 4600 24 as 13 Tevodura Waldhor 7/600, 25 ‘60 14 Tevedura — Patix 15 000 17 650 30 Cavadara | Phnit 13 000, 24 1080, Xo Tevadura Pix 13000 zs 1340 ie Fevadura —— Vogstbusch 13000, 3 40 24 Tevadura — Vogetbuseh 13 000 2 1380 4 Tevadura— Vogelbaseh 21 000 24 1400 45 Tevadura Vowstbusch 105 600 30 4 800 13 Tevadura— Yoeetbuseh 264 200 3 4000 34 Teague Fangs 15 000 24 3130 na TevaduraTurbina sumergida 15 000 ta 2740 m4 Heater er Tursina samerga 11400 1.0 300 3 Endomcc Turina umergida 11.400 20 ~ 400 33 Endormyyees Turbinasumersda 4000 0.30 i 100 Srerromfces Turtina sumergda 4000 0. 408 92 Noho Turbina sumersda 10.600 ts 4740 4 Bacteria Airlift presuteado. 19 600 45 400 ai Salto ftuihina smeraida 4 600 10. 1360 200. Sullito Turbina sumergida 1$ 000 14 1330 21 Suto Turbina sumersida 15 000 a 2aK0, 20 ‘Suto mergida__13 000, a Von 19, Nuoencoton x 3 4 Tos oe ba 666 bale Passe We 3 nf Lote | b0.50y Figura 5.7. Vatias configuraciones acon superficial dol are 0.1 tise (Dy Dy, = 033; H/0 ean alata retro del anillo de seracién). : pers “silo sonreVowe que Tou coreapondints” tat lvadus Pease cuban oan ade dea yrs ol fot Aer tipo Vogstousch parece tenet buenas penpectas (este omental n0 tee ny mes na crete gu fr 8 fant art ue 1 Shea por parte Soper, pov season prsuaa), Vera ere para mayores detalles. ss o La tuble 6 nea ue ls fermentor ii enon andes poi der de apatn lo miso que as cunmas de gan profndial. NUEVOS DISENOS Le figura 5.9 proporciona las dimensiones Optimas para divenar un airlift; serpentin Comisa Agitador FPiwa 58. Atcasde tiansfeencia de caloren tanques aitados: camisay serpentin.wa 94 Transtoroncla de oxigeno y disefio de fermentadores a -fetencta de a transferenca de oxtgeno en fermentadores jloto de diferentes tipos de escala pilot 25 =< oy eee oe ee mre ne ane Hoa, com fea BSB Ait, Pati B ehemee mai ae geese Sener Cinemas. ropes.) te teu’ Sir niveus icons : "0, Sule theo 2 renee es ; Tangs iade pe chrysagenum gucoia 125 ‘en cuanto al método dessfortunadamente los datos de operaion son ezasns ¥ 0 tea de cdleulo de transferencia de oxigeno en dicho sist my BOD er onfiguraciones que tienen posbilidades de uso son: Sxeuer Oi de torre 30 y. los filtros biologicos aplicados @ proceso a secen mayor atencion sean la biisqueda de muevos uid tes teas a er eda, bra de vio, etc) ¥ ol aasarollo Je smnestes. do constrvecion (made, stemas de aeracion y agitacion no mecdnica. Mh by bios bo 4 = 09-08 ~ P-VE ‘igure 5.9: ewnonesytelastonessvoméica para un fermeniaos tipo aii 95 NOMENCLATURA A rea de transferencia (em?) 8 = fea interfacial © = concentracion Cf = concentracion del oxsgeno disuelto en equilbrio con el oxigeno de la fase gascosa , = concentracion en I interfase GC, = concentracion del oxigeno disuelto en el seno liqudio G, = calor espectfico (calfe°C) D,_ = didmetro del impulsor (m, em) Dy = diémetro del tanque (en, em) D. = difusividad (cm? /seg) dg = diémetro de burbuja (mm) = constante gravitacional (m/seg?) Hi, = profindidad del liquide (mi) kya = coeficiente volumétrico de transferencia de masa (b"") Kk = constante ky coeficiente de transferencia de masa para el liquido (mh, cm/see) N= revoluciones por minuto (min) N' = velocidad de transferencia de mass N, velocidad total de transferencia de oxigeno por unidad de volumen Ng = 25 = Nimero de Schmit potencia de icion (kg m/seg, HP) flujo volumét de aire Qo, = demanda espcifica de oxsgeno (mM, a élulas-h) tiempo de contacto (min, seg) volumen del liquide \elocidad ascendente terminal de las busbujas velocidad superficial del pas velocidad selocidad especifica de crecimiento (h"!) viscosidad en el seno del Iiquido (g/cm seg) sy = vseosidad en la pared (glem seg) densidad (g/em*), tensin superficial del Liquide [REFERENCIAS 1. ¥, Miura (en) TK, Ghose (@4,), Adv, Biochem, Eng, Vol 4, Springer-Verlag, Bel 1976, 2, SJ. 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A Ca Cee, Te Chemical Einar. ma 4) 301 Sin Fs Dud (on) TK, hie a, 688), Aah, PERE ‘eng., Vol. 4, Spvinger-Verlap, Bertin, 1976. Escalamiento de fermentaciones tt problema del paro de una ean a oa esaamiento) 3 uno Bh pote et tan ses neh 7 mayor importance menacibn serbiea el predeci reuados a esas de ta ca Pen on'elcieaamieno de datas obtenilos eel aboratono 0 proecin basal er ulere_de un andinn cudadoxo de cada una d° lt ese, Bas vrables Gasog meas como DOLE als tanto oa oratorio se opera eon matraces agiados(~ $00 mi © pein ernie, done torn ews peli es ee errr ae jor la cepa de prodvesion. En i pla en eeu efter de secon, temper ya Mot are ean los femertadores cuenian con, ngrurents park Di an_muchos mara con objeto de estudiar dirancn el cut Sonesta ie cauecer an coil por revoaimentacion. Los femeniado Foe eoecion (6 000-400 000) deben operat sgvendo un clendario reais tm deaomentar i podadaa Aa ef? ae un Hos aes tat conde taanion J slags de ons esa 2 te Solomons,3 por ejemplo, indica cuales son Jos rangos de operacion més Soom pave severe speci por ual de wlunen » ei se aga Oe a a Escala Industrial, 1- 3 Wil 501 100+ 800 rpm ae sh aces fir ia ARM a it SE wn96 2 4 5 @ 7 8 5. un 1 ri 4 18 16 1. 18 ty 20. a 22, Fa 2 2s 2. 2B. 2». 30 3 7 ‘Transferencia de oxigeno y disefio de fermentaclores swan, dendvook of Eneyne Technolo, Hus owed LARA yy A Wace er sou, Tan. frst Cher Bn 395337 (1960. Finy. pekentlder, Chem. Ene, Progr. $2,286, 1956 WN ce punk, Trans nat. Chem. Eng. 96,443 C1959) BH Cale any ldeger Biotechnol. 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Engineer, ne: #8 7) Te Sh To crs (en), Chom «a, (ois) ar, Becher EME vol. 4, Spcnger-Verag, Bertin, 197 Escalamiento de fermentaciones Wy pone dt pc dana eval aot (xalent) ono de nde Bh oso at ps em aac So cre mann oo gel yor impor no et eves a pede elias # cl de Bl sa cm tae nara 0 peso boas en cain gy candy de cata ue Ge Hs Bye ann sor ea oa om loge ai, te i a ae con mater agtados~ 500 a pci es on San mos mt yes fermentor, done Mn Ge prosion En l Dana pcan oy ae nln tet de sens, eee oto 500, i orn consign com. insrunenin Gt Di ences cs tn hc eur dir Slo Fe are col or fevodinentadon, Ls mena yt nb 2000 ashe ope send olen Feet Ge amare osetia Ao lan 8 i, ae he gn de laos de ace 802 wis detad de It te conor ann eon. Son en pine pred runeny ct este ein a eae ‘Escala del Potencia ‘Capacidad “Velocidad — (Ee fein, dd femantadr detain Hiseala Pequefia 810 Wil 31 20 pein fais Piste ssw 101 3001200 pm ea! | aiema En apten ee 200! 6, 0 a 001 es 7)= 98, Escalamionto de fermentaciones Surge, entonces, Ia pregunta de cusl debe ser el escalamiento de laboratorio > + planta piloto > produceién 0 viceversa, es decir, un escalamiento hacia abajo (Goule down). Puede haber necesidad de escalar un resultado de laboratorio, © de tsatar de escalar hacia abajo las condiciones ambientales que puedan Tograrse en un equipo de producciOn; si se escoge el segundo criterio, habra ‘gue determinar el tamaito minimo que puede utllizarse en el laboratorio 0 en Ia planta piloto y que pueda trashadarse a escala industrial. La solucién de estos problemas depende de la manera que se escoja para atacarlos, y esi ‘manera dependeré a su vez del tipo de problema particular de que se trate Existen tres tipos de problemas: ‘) tin proceso nuevo y una planta nueva, b) un proceso nuevo en equipo existente, y e) modificacién del equipo existente para lograr una mejora en el proceso, Desde Iego en cada caso se desea mantener al pasar de uma escala a otra, condiciones ambientales similares. También se desea maximizat la productivi- ad (en procesos de fermentacin que son intensivos en costos), o bien Ia eoncentracién del producto (en procesos de separacién que son intensivos en ostos), (Se recomienda revisar el capitulo 7 para mayores detalles), Aiba y ‘Okabe4 han demostrado la importancia de escalar no solo el fermentador sino todo el proceso, pues ta optimizacién de un equipo o parte del proceso solamente, no asegura el beneficio econdmico de la fermentacién. ‘CONTROL AMBIENTAL Desde ef punto de vista de diseno se debe watar'de delinear tas vatiables Fsicas (geometria, niimero de impulsores, ete.) del fermentador y procurar que se mantengan las mismas condiciones de mezclado, agitacion y aeracion. Sin ‘embargo, no se puede lograr lo anterior, porque existen limitaciones dimensio- Be ee) eee Geet los procedimientos de esealamiento, ‘Cuando se tienen equipos dados y se pretende trasladar las condiciones de foperacion de uno a otro (revoluciones por miniuto, cantidad de aire por ‘minuto, potencia por unidad de volumen), lo importante es establecer reluciones entre las variables que aseguren Ia similitud en el medio ambiente al cambiar de escals El contfol ambiental (y su escalamiento) depende por lo tanto de la limitacion del equipo. Usvalmente es la transferencia de oxigeno la que determina la capacidad de un fermentador y por ello se 1a ha escogido como titerio para el escalamiento. La transferencia de oxigeno puede establecerse Je In manera siguiente: Velocidad de transferencia de oxigeno =| 18 (Cy ~C,) promedio i Velocidad de transferencia de oxigeno. OH red yo coeficiente de transferencia de masa en general es:S ka=K eV)" PO" Wet, 448) pl bell we Criterios de escolamiento 9 Se comprende que si se desea trasladar la velocidad de transferencia de oxigeno, se debe poder escalar ka, que a su vez depende de variables les de escalamiento, como se ve en la ecuacion [3]. Sin embargo, en lpunas fermentaciones ~particularmente de tipo 'micelial~ la formacion de tgregados, el grado de mezclado, el esfuerzo de corte y otros Factores también. aadquieren importancia. ‘CRITERIOS DE ESCALAMIENTO ~ La figura 6.1 muestra esquemticamente la concentracién relativa del producto final en na fermentacién afectada por P/V o kya. El patrén hiperbdlico que se observa es general, independiontemente de las especies microbianas: bacte rias, levaduras © mohos. ‘Lo mejor es seleccionar una variable de operacién cuando la concentracion del producto ya no aumente (la Linea continua de la figura 6.1), mientras que para fermentaciones que sigan la Jinea discontinua es aconsejeble seleccionar la con- centraciGn maxima del producto, Otros factores tales como requerimientos de tenerpfa, Conveniencia de operacién, disponibilidad de equipo deben considerarse antes de determinar el valor 6ptimo de P/V o ka parael escalamiento. En la prictica se han escogido varios criterios para efactuar ef cambio de escala, todos ellos basados en resultados empiricos. 26,7 La tabla 6.1 resume los criterios empleados para cambio de escala en tanques agitados por medios metinicos y las relaciones entre variables de operacién y disefo. Bosindose en dichas relaciones se calculo la tabla 6.2 en la cual se emplean los Geno criterivs iiciicignados pata tros yolimenes de operacién: 10, 80 y 10000 TAL analizar los resultados obtenidos se concluye que ni el nimero de litros adel Concentracion fa Potancinidad de volumen CGostcionta volumétrieo de transferencie de ox {eelocisnd de wansierencia de oxigeno por unidad de volumen) ‘Figure 6.1. Dependencia dela fermentaci y las varlables de operacién.2al A m Criterios de escalarnionto. 101 100 Escalamiento de fermentaciones TABLA 6.1 pero los resultados de la tabla 6.2 indiean que no es una buena elecsign, por Jo menos para el valor de a=0.6. Lo mismo-se. puede decir de Q/V, ‘puesto ue, al cambiar de escals, el valor de P/V aumenta en vez de disminuir. [Los mejores criterios para pasar de una escala a otra son, al parecer, P/V eonstante o ka constante, estando ambas de acverdo con lo descrito en la Diferentes criterios para cambio de escala en tanques geométricamente similares, con medio propicdades fisieas constants (Ne. > 10%, Np = constante) Peseta) Vite tan) oe punks hl Rebels aaa figura 6.1. Conviene seftalar que si se mantiene la similitud geométrica, es nu /D\* imposible escalar siguiendo mis de un eriterio. otonca por uniiad de voles PVD) = (= ‘Usualmente se escoge kya constante como criterio de escalamiento_pero, go tennant be Ny gong ender or coca Luan ica en Seana ere 2, (2) “Sj en-el caso de. en elaciones para calcular el je ryan dl inplor oven aa (5) piston di cE fame ‘ ‘TABLA 62 son Le ND j, w+ Welded tango nD =k oe Variaciones retativas de las variables de operaciny disento cman ak ND, para diferentes excl, de acuerdo con diveroseiterios N/D\ abortorio By” Piet pioro ree ge aint a a ’ Ps Weg es 4 5 aT ee aie empo de mercato Bal P 20 20 Le eee (:) ; mB : mv a 056 N on os? 1, constante a ° S68 836 a D, gv om 033 ; XP. 1 oe aie Be ab ihe = constante ie Fy at Le By oi 093 078 bs fy, a\e kent 1204s, ) o 5 Beis ny @ ) en a3 o) \o Ty = nimete de potensia Reynolds ni el tiempo de mezclado son buenos crterios de escalamiento. En l_primer_caso_F/V_es_demasiado_pequefio_y_no_asegucria. na. buena traslacion. Hl crterio de Tiempo de mezclado igual tequiere un consumo muy “alto de potencia aando as eflulas microbianss o agregados celulires son_afectados por grandes esuerzos cortantes, ». gr rompimiento de los agregados, el esalat fmpleando como criterio In velocidad de la punta del impulsor constante isminuye te potencia por unidad de volumen en la misma proporcién que la scala del Termentador aumenta, haciendo que et ky disminiya Tn la prictica es dificil mantener la. geometria similar para realizar un escalamiento basado en métodos de anilisis dimensional. Oldshue§.? ha emostrado Ia venta de escolar sin obedocer la simlitud aeométrica, aungue la difieultad reside en in carencia de informacion sobre dicho cambio. Aiba et al? sostienen que se puede utilizar como criterio ky constante,Escalamiento de fermentaciones ¢ 102, fi. La viscosidad no ha sido considerada. aunque varios autores$.10 han Sefalado si importancia y efecto en cl cambio de escala. Particularmente en Jas fermentaciones miceliales (v. gr. antibidticos) 1a alta viscosidad del medio hhace que el kya disminuya y. por lo tanto para tener tina buena acracin-es ‘ecesario qu ‘aumente 7 “ioe | La-prictica actual” es tratar de mantener constante Is. transferencia de oxigeno (ecuacién [1)), es decir kya, asi como la velocidad de la punta del impulsor cambiando fa relacin entre gl impulsor y el diimeiro del tanque, La tabla 6.3 es un ejemplo deescalamientoutlizando como entero la velocidad volumétrica de transferencia (constante) para tanques con Y sin similitud geo- miétrica. Cuando es necesario o deseable mantener iuales volumen de aire por vyolumen de liquide por minuto ocurre que la velocidad lineal del aire a través el tanque aumenta en proporcién directa al diimetro. Sin embargo, si el Poreentaje del oxgeno absorbido es pequerio en Ja escala pequen, es posible disminuir el volumen de aire/volumen de liquido/minuto (VVM), aumentando la eficiencia de absorcion, Lo anterior se logra aumentando el valor de ky a. El ltimo caso muestra los efectos del cambio en la geometria En cualquiera de los casos anteriores es importante tener una forma de cstimar kya. Binsele? hizo recientemente una recopilacin de datos prove- nientes de fermentadores industriales, y encontrd que P/V disminuye la escala segiin la siguiente relacion: PIV a (vy? i] el tiempo de mezclado encontrado vari6 de 5 a 100 segundos en escalas de 501 100m, y obtuvo la correlacién siguiente: ty a (Wye? (51 ‘en el mismo rango de escalas hallé que as tasas de transferencia de oxigen varian entre 100-400 mMO, /I-h determinados en sistemas'de sulfito, Las ‘ransferencias biologicas son menores en ol orden de 60-300 mMO,/I-h. Los coeficientes de transferencia, k, a, fueron do 400 a 800 h~". La velocidad de la punta del impulsor vari6 entre 5-7 mseg, pero en varias ocasiones se encontr6 como el pardmetro dominante en el escalainiento de fermentaciones productoris {de antibidticos. TABLAS Excalamiento a velocidad yolumetrica de transferencia constante® Planta piloo Plana industriat Propiedd ‘gal "2500 gal Didmetra Lo 50 80 a8 Altura)Diémetro Xo too 28 Wa 10 O42 on a 02 on O41 x x Se 0x 6 S10 FLO SS10 i requerio. 1 — riterios de ascalarniento 103 Desarrollo historico, La cortelcién entre la concentracién de peniclina producida y Ia potencia ‘consumila en agitackin en fermentadores de diferentes vokimenes fue inves tigads por Bartholomew er al! y Gaden,t2, y comunicaron que el escala- miento de la produccién de peniclina puede efectuarse con éxito con un P/V de 153.0 HP/m', La figura 62. muestra la comelacion de la peniilina producida y la transferencia de oxigeno obtenida por Karow et af 12 para langues de’S 1 a 15 000 gal. Nétese el efecto que tiene en la fermentacion el duplicar la presiony el flujo molar del aire manteniendo la velocidad superficial del aire y la absorcion constante. Esto significa que la transferencia efectiva de gas se duplica para cada uno de los tes casos en que se vari. La productividad se mejoré marcadamente en condiciones de agitacién que ¢staban limitadss por la presion atmosfiea Bartholomew et al.L) encontré que la producsi6n de estreptomicina puede cscalarse con un P/V de? HP/m* La potencia requerida para agitar un tangue ha sido estudiada por muchos investigadores (vase apéndice D). La comrelacién que ha tenido mayor éxito hasta la fecha, fue propuesta por Michel y Miller:14.% 2,2 (ejprcic™? © (P3 ND#/Q,°9°)945 (6) Nagatal6 y otros han encontrado otras ecuaciones empiricas que toman en consideracion los efectos de diferentes geometries, rangos de operaci6n y tipos de fluids. La figura 62B presenta un caso en que la fermentacion es afectada por una agitacién excesiva, {En consecuencia fue necesario reducir In potencia y la transferencia de oxigeno para lograr el méximo de concentracion. La vitamina By se produce en un medio muy viseos0 y los picos encontrados son mcho mis pronunciados6 Muchas otras fermentaciones se desanollaron con base en ta. tasa_ de acim del sulfito (véase referencias 2, 6, 15), pero por ejemplo, Maxon y Steel! comunicaron gue el escalamiento de novebiocina no se podia efectuar con base en la tasa de oxidacién de sulfito, sino que podia usarse como eriterio de escalamiento Ia tasa especifica de consumo de oxigeno de Streptomyces niveus, cortelacionando Qo, con la velocidad de Ia punta del impulsor, independientemente del diamétrd usado. Mis tarde, en 1966, Steel y Maxon!7 usinda un disefio especial de agitador, encontraron que lz potencia requerida era independiente de los cambios en la viscosilad aparente del ina y Qo, que un agitador de turbina, pero con la mited de Ia potencia Yoshida ef a.1® demostraron que la tasa de absorci6n de oxigeno en solucion de sulfito de sodio es, por unidad de yolumen liquido, més répida que en agua pura, especialmente can agitaciGn forzada, que crea burbujas més peque'ias y * una drea interfacial mayor. Por todo ello se considera que el método de foxidacién no es adeeuado para escalamiento de fermentacién, especialmente fen cultivos de alta viscosidad 0 no newtonianos,el 104 Escalamiento de fermentaciones Pap ar ee 5 81 atm ‘Concentracion ah re a Ca ‘ian ae “200 a A. Exalymianto de nsec Snag + 10.00 gt aes i 1 Sone Grete de on! iy no * © 2oal q i ozo + 10m! vag 5 Ne #8000 BB. Correlacién de fa pro % & ¥ 12000 gat ‘duccién de vitarnina » gia two tote 2 Ferodia oo ox 9en0 x10! Figura 6.2, ¥scalamiento de fermentaciones considerando como critero la transerencia de ‘ovigeno, Hansford y Humphrey! que estudiaron el concepto de tiempo de mez lado para tanques con similisud geomética, comunican los siguientes valores Qe tiempo de mezcldo en segundos, para un tanque cuys relaciGn dime: trofaltura es 1.2 y didmetro del tanque/dsimetro del impulsor es 3: N irom) 31 26 0001 30 166 see 6a Lice 0 1s sce 26 sek 300 Set 750 Step : ‘Oléshue,§ utilizando kya y eND como criterios de escalamiento, demostrd que era posible escalar con geometria no similar, porque a altos P/\ la relaci6n diametro del. impulsor/diémetro del tanque puede variar de 0.20 20.50 y todavia se siguen obteniendo buenos resultados. Criterios de escalamiento 105 Uso del ky.a como criterio de escalamiento {A pesar de que es reconocido como uno de los eriterios mis adecuados, su uso presenta algunas difieultades por la siguientes razones 4) el kya cembia durante el transcusso de la fermentacion, b) las correlaciones de k, a s6lo son vidas en ciertos rangos y para geo- setrias particulars, y ¢) el método de detérminacion de kya FL kya varia durante la fermentacién_por-sasiasrazones,-entre-ellas-por-t- auihento de la viscosidad, los problemas de espuma_y_el-sumento- deta Om elulan Woardman2® enconird que kya@x para Candida licerol, tanto en cultivo batch como continuo. Es decir, sise tmplea como criterio kya, deben especificare las condiciones ambientales y tiempo de fermentacién en que se determind éste, pues puede ocutrir que se fescoja un kya menor que el necesario y al hacer ol cambio de eseala, descubrir aque no es sfciente, Lis correlaciones de kya son muy abundantes (véase capitulo 5) pero na de ells de uso general. La ecuacién [3] puede transformarse en: kas KP EW)” 7) excluyendo el término’ de viscostdad. Debe obtenerse la corelacion [4] para todos. los tamafion de equipo que se emplee para varias. geometrias 0 tmodificciones, En a gura 6.3 se grafican los valores de a citados en la Iiteratura.21-23" habiéndolos “transformado en nia euacion cn donde B= 0.67. Es notable como el valor de a varia con la esela y aungue todos los datos fueron obtenides por oxidacién de slfito, la tendencia del decremento de a es notoria, y cabe preguntar Guiles son los Factores que cambian con la exala r aa {) La tbuleneia en a superficie b) La relacion superficie/volumen aia Figura 6.3, Valotes de oy s8 vatiacibn on ol volumen, y106 Excalamiento de ferméntaciones La turbulencia de la superficie La turbulencia en la superficie es mucho mayor a volGimenes pequerios, por lo que al coefieiente de transferencia en la superficie tiene un valor mayor. Si se mide la transferencia de oxigeno por el método dindmieo, al cortar el suministro de aire y variar el ndimero de revoluciones por minuto se puede ‘encontrar el valor de la aeraciGn por superficie. La relacion superficie}volumen Fuchs e¢ al24 investigeron los efectos de la aeracion por superficie en el cycalamiento. de fermentaciones. Sus volimenes variaron de 1 a 51000 1 y kya.de superficie = P/V)! 8) (ee) = (IN? io donde ¢ es la pendiente de la curva de kya de superficie y P/V a flujos de aire Gotablecidos, Ves el volumen del fermentador y j la escala de formentadores Te gura 6-4 presenta algunos valores de ky 2 superficial y su contribucisn-al ig total, Se puede deducir de Ta informacion que a uit eseala mayor de 4001 “Tos. sfactos de seracinn je son despreciables. Para fermentadores Tewores, de 400.1 la transferencia de oxfgeno superficial es importante y almentaa-medidaque_disminuye 1a escala..Lo anterior explica, 0 por To snenos justifiea, lo observado en la figura 6.3. En la figura 6:4 apareven dos Tasos que indican lo que sucede al escalar el ky 2 superficial con P/V constante © VVM constante y kya total constante. Los valores de kya superficial son del forden de 50-200 h~? en la oscala de 10 a 500 litros “ Los métodos de determinaciOn de ka varian bastante por lo que a la trmnferencia de oxigeno. se refiere. Se considera que en general los kya eterminados por oxilacion de sulfito son 2 6 3 veces mayores que el real. Sin embargo, exitien otros problemas que afectan la determinacion de kya, ¥ aunque ya han sido mencionados vale la pena enumerarlos de nuevo: tiempo de respuesta del electrodo, aeracion superficial, concentracion celular. Emplear G1 método. dindmico en’ fermentadores grandes es dificil porque existen eriodos de transiion antes de que se establezca un-periodo libre de burbujas Pina poder determinar Qo,x y después volver a restablecer el burbujeo de Tire, Por no tratarse de un tanque perfectamente apitado se necesitan de 80 a 120 seg para eliminar las burbujas residuales. En termentadores de escala industrial, el gradiente de concentraciones promedio de la ecuaciin (1] varia de acuerdo con la profundidad del iquido, or lo que se recomienda usar un promedio logaritmico del gradiente, como s© face en los casos de transferencia de calor. Otros problemas de escalamiento, La ubicacion del electrode de oxigeno disuclto es importante, pues al-no ser los fermentadores grandes, tangues perfectamente agitados, deberd colocarse Criterios de escatamiento ie 0 200 % 160 3 BAP sant = 0 age 100 & 2 Soa. { te = soon ‘ a OF vans ete 2 50S 2 Pv = awh = om aT eT TT oT Volumentitros) Figura 6.4. Contribucién de ta seraciin superficial «la tansfrencia total de oxigeno.24 en una posicién en que mila ta eoncentracion de oxigeno disuelto det volumen “activo”, Se regomienda no colocarla cerca de Ia superficie ni en el fondo del tanque; tampovo es una posicion adecuada detras de los bafles. Calderbank?5 propuso la siguiente ecuacién basada en experimentacion y rlacionando, /told up (H), 0 fraccion volumétrica del aire on la dispersion, con Ia velocidad lineal del aire (V,), la velocidad terminal de las burbujas (V;), PIV y propiedades del fluido (densidad y tension superficial) iy vit) °° esate WNC 4 X as + omic [OM (22) +, 1 ‘operarse a N menores, el coeficiente de transferencia también dismint | Método de traslacion de operacion a la misma escala Hasta ahora solo se ha mencionado como pasar de una eseala a otra y los ti— 108 Escalamiento de fermentaciones 7 ie © 16litros 5 @ 68.000 litras ey 945000 litroe > are a> 2 1 9 E OTT GHENT 20 Holdup He (%) ‘Figura 6.3. Relaciin ent ol holdup, Ia potensia por unidad volumen utiliza y el jo de lve para cl iatema agua a diferentes esealas.26 problemas que implica. Se in puesto énfasis en que los culivos vseoios 0 Inicllles son mis dificiles de esalary en que los criteios pliados soa muy divers, 7.15, 16 Recientemente Fewkes y Wang?7 han presentaéo un nuevo método para rasatar upetaciones a ana misma c2eala con uaa ésito en la produccién de novobiocina con Streptomyces niveus. Las Hguras 6.6, 6.7, y 6.8 representan ‘thquemdteamente el procedimiento y los resultados obtenidos, La figura 6.6 muestra cémo se felaciona el cosfciente de transfeencia de masa, J (p de Orie decdlulashs de sauracién) con la tasaespeifica de consumo de oxigeno yi concentracion critica de oxigeno disueto. Mientras mayor sea J, Ia tse Zepecifca de consumo de oxigeno aumentars en respuesta a un aumento dela Q, = ste. —ce) “Tas espettica de vonsume ce oxigano ‘Conceniracién de oxigene diuelto CL. Faure 6.6. Representacibn exuemitin de I dopendencla dete trnifernsi de masa {el impulsor: J eambia con N? i ll Ejemplos detallados de escalamiento concentraciin de oxigeno diselto. La concentracion critica C*, queda representada fisicemente por la posicién de la Iinea que relaciona el consumo de oxigeno y la concentracién de oxigeno disuelto. Si C*, es grande, mayor Ueberd ser la concentracién de oxigeno disuelto antes de que la tasa especifica de consumo aumente sustancialmente. El coeficiente J se puda correlacionar perfectamente con un pardmetro det flujo del impuslor ND#h, un producto de la velocidad del impulsor, el cubo del didmetro del mismo y un factor que considera la altura del aspa, Los resultados indican una relacién lineal entre J y el parimetro, como se puede ver en la figura 6.7. Se hicieron expetimentos con impulsores de dos tamanios y tres velocidades de agitacién. En la prictica el flujo del impulsor puede felacionarse con la velocidad del medio, tiempo de circulacién 0 tiempo de mezclado. Se establecid una relacién entre la concentracién critica de oxigeno disuelto y un pardmetro del esfuerzo cortante y del flujo, definido como N/D,. La figura 6.8 muestra que C¥, vari6 entre 3.5 y 30% de saturacion dentro del rango investigado. La C*, ‘mis baja se obtuvo con el impulsor mis ppequefio a la velocidad mis alta Las correlaciones anteriores pueden ser itiles al evaluar la operacion de fermentadores con cultivos micelles. El coeficiente J tal vez deba ser dividido por el volumen para tenerlo en uns base volumétrica, y el pardmetro de fesfuerzo cortante/flujo puede servir para estimar otros procesos dependientes del esfuerzo cortante. EJEMPLOS DETALLADOS DE ESCALAMIENTO Desafortunadamente en {a literatura aparecen muy pocos ejemplos que presen- 2 020 a5 ag i? oe ESarg aE 2 5 8 mee ey ae des pombe ot impor NOP es" Figura 6.7. Efecto del homeo del impulsor sobre el coefciente de transfereneia de masa ‘entree guido y el stido.27my 7 0 Escalamionto de fermentaciones O02, 04 oe a, 10, Relacién de esluarzo cortantaltluo NID; fem se0h* Figura 6.8. Efecto dele relacién esfuero cortante/fujo sobre Ia eoncentracion criti de oxigeno disuelto, C2. ten Jos criterivs, elas, geometrias y rosultadoe del escalamiento. Cada compatia tiene su propio método y ha llegado a él a través de métodos tempiticos y gastos en investigacion, "A continuacin se presentan tres ejemplos que offecen bastante informa ign y sobre todo indican escalas de operacion. |A, Escalamiento de un tanque agitado® Hl criterio que se siguié para el escalamiento considerd la tasa de transferencia de oxigeno constante; se muestran dos casos; en el primero hay similitud geométrica y en el segundo no. ioe | are Aion wa SS | ee ; fs i 1 3 1 Mi Conviene senalar que en ambos casos disminuyd ky a pero la transferencia ee “OR Ejernpios detallados de escalamien to m {otal fue 1a misma al ser mayor el AC en los tanques de 25 000 gal. El cambio fn el tamafio del impulsor hizo que el consumo de energia/volumen disminu- Vera, pero que el esfucrzo cortante aumentara, Lo anterior puede ser lmportante en procesos que dependen del esfuerzo cortante, como ya ha sido explicado,8, 9, 1, 16,17, 27 1B, Escalamiento de la fermentacion de acido glutimico?® Las bases consideradas para el escalamiento fueron una geometria similar y ur ‘oeficiente de transferencia de masa similar. Las ecuaciones utilizadas son: kya VE (PIV! NP? DIP + = i) suponiondo que la tasa de Aujo volumétrico de aire por unided de volumen de Hiquido es constante. La tabla 64 presenta correlaciones encontradas en la literatura y motificadas de acuerdo con Ia ecuacion [11]. Para el escalamiento debe seguirse la siguiente relacion: Ny pee = Ngo Dye + & 2) Dy a 13 af (3) Los resultados obtenidos son muy buenos, pues a escala mayor la concentra ‘cin del producto es igual. No se da ningiin valor de P/V, pero sf se men aque la agitacién de los fermentadores es mediante turbina.?8 Fermentador Volumen (m*) Nim) Didmetro (my) A 930. ap a 16 125 a a 166. ica que el cociente 36/28+.a es muy similar para todos los métodos, y este procedimiento, aunque sencillo, puede aplicarse si va acompafiado’ del conosimiento de las caracteristicas individuales de cada fermentaci6n. C. Escalamiento de biomasa producida a partir de n-parafinas En este caso se mantuvo P/V constante asf como la celacion de Dy/D; se uusaron datos experimentales de 2m? para predecir ky en un yolumen de 200 m*, Varias ecuaciones fueron utilizadas para presecir kya, escogiéndose la ecuacion de Westertep ef al23 aunque moditficando Tos valores de lasa 2 Escatamiento de fermentaciones ‘TABLA 64 Modifieacién de las corre Jones de kya de acuerdo a la ecuacién [8] Tro las correlaciones estén basadas en oxidacion de sulftto, sou ct le én oP Referencia G Carlson de Kye eitndin ira RP 6 Tene Add, 0) c Ky=cVy Re wep 120-0) D, Sp ml d a A nyse wep) ee) ' pacevernnt Ryeee ones NADI ee) ; corer a Re ; Deca wih eae nia | a P. ry snowing" VED wi? or 200 a) Bt * N we ve 130-08) x, Pe ere F enw put wide vr ins eeencias Pe 4 antes, Esta deci se basen que hacia una prdiclén conseryaors: et ¥, constants. Est dei nor valores de ks, Las ial en due operaron Q 1 ee Gorham el oratorio, en pina plot de 200 1s 2 met % fecron de cis de 10 a 20 mY en comer d¢ 200 3 1 000 mat 4 plant, snttercacia de oxigeo fueron hata de 15 On/1-h . a de tansere soiancia se modiicd a ceuacién.de Michel y Miles re one are cuaion {14}, a tomar en ecnsidrcion ls poscon del i come nti al areaorY 1 laciondiametoalur del awe: Pa xy may penpi] ~ cxy po | |~ Fi Re fa x. Ys on constantes ren agtador tenia dos impulsores tipo turbine con sis spas 4° geometria estindar TABLA GS i Vetoes te kya etd y medidas part un fermentaor de 200 ri? (Unidades arbitrarias)?6 113, [NOMENCLATURA constante ‘oficentracion critica de oxigeno disuelto (ppm. g/l) concentracién de] oxigeno disuelto en equilibrio con el oxigeno dels fase gaseoss (B/l, ppm) concentracion del oxigeno disuelto (ppm) 1 Miliaacién por calor ha sido estudiada por muchos investigadores, enite Jos que destacan “Aiba ef a,6 Deindoerfer? y Humphery® por haber fropuesto.dversos modos de apicacién considerando ¢! punto de vista de Ingenieria Prat se tratard ef concepto bésico de mortalidad térmica, de los nieroorgnismos ¥ después Tos aspectos tebricos y pricticos de su apieacton, asi como algunos problems encontrados. -MORTALIDAD TERMICA DE LOS MICROORGANISMS. Se han planteado muchas teor‘as para explicar el mecanismo de la ina Sesion térmica de los orpanismos, pero aqui s6lo se tratard su aspecto cinétic® ion Mtreecton de los microorganismos depende de muchas variables: pH del medio, estado vexetativo’ dé las células, iones metilicos© En la figura sib aparecen 3 tipos de curva de tasas de mortalidad. La Curva A represents iiss vepetativas en ana solucién buffer; la curva B es tipiea de spores. céluls Seeeteristica de organiamos daiados 0 particularmente sensibles al vase Sue asss de mortalidad también varian, siendo comstaites para las Stal vegetativas A: para B la tasd es menor al prinespio del tratamiento pi1® cammenta cog. cl tiempo, Eni/aii/casy |) una, sem alimingaue [os celles Jefectuoses o sensibles, las sobrevivientes tienen una tasa similar als de A. Ley logaritmica de mortalidad a-destmuecion de. microorganismos es en general, similar a una reaccion * tinplicaaplicactn industrial «scala preparatv ‘Mortalidad térmica de fos microorganismos Ww quimica de primer onden es desir la tas de destruclin en eudauier tempo I i ale le das visa una temper expect Cra dela ngura 71). Matemdticamente se expresa as on aN. aN rn Fe eohers te GG vim onloketpeenon: | tema y ions sei a p12 ae cor ae lineal entre el logaritmo del nimero de células L N Ui Reds eagyie etspite Aci ea Sono yin 6 ni SN eae cuteness et einocrts tniento diferente al indicado por la ecuacién (1 “ ne Expresiones para la tasa de esterliza Eniven varias formas de expresir la mortal de los microorgaismos, pricpamento porque hace tempo, la inroxjeon algunos msrbilogos y Some pica quedaron consiaaas "Rota de invert termoa (a temperatrs minima requeida pata dstrur todas las oélulas en 10 minutos). Es una medida prictica eaalamaad de ise Gondiiones partes, parasueson de evactitud Geben dare ss ondcionesexpermentales Ty tempo Ge muerte txmice (tiempo requeido pare esti a todas ln 3 Namero de sobrevivientes (escala logar! Tiempo Tosa de mortalidad > Tiemeo Figura 7.1. Curvas que ihustan el prooeso de destruccibn microbiana A, ella vertativas 1, esporas;C, organisms daado, ;ue “Métodos de esterilizacon dol medio de cultivo y del aire 10 10 10) 104 wo vo obi 234 8 8 Ft Tiere (rin) ‘ula vives (blues Pique 72, Bosassiintxmica de Bel sii a aitentes tempera éiuias una temperatura dade). Depende. del, microorgnismo y ¢e les ‘condiciones experimentales. me atodo del porcentaje. Express la desruceion por esteriizacion ott al uucentaje de. edule vivas sobrevivientes a la exposcton al cor Por ‘unidad Ge tiempo. {) Tempo de reduccién al décimo, £1 TRD es el. Hempe, ae tarda on rR, cul en reducire al 10% de si nimero inka al exponeras al un atmmciabién se Te conoce como el valor D. Si integramos Ia ecuacion entre Fea céluls vvas en el t=0, y N, células vivas en tempo t=¢ = Gene N In (8) =k) 2 lo = kt fe ahora si No/N= 10, se tiene: t= 23k =D (61 Si se consideren 2 suspensiones de Jas mismas esporas somes 2 S Borsturh, Ty > Th, © eneventra que un asmento ef Is, empershist de alentamiento disminuye la-constante D (ver figure 7.2); Efecto dela temperatura ena constante de velocidad de esterilizcion, k Teoria de Arrhenius sha cormprobado experimentaments quel efesto de ta empersturs en Ke puede expresarse como tna ecuacion de Arrhenius: Mortalided térmica delcamicrcommmmemmmimm it a k= Ap oot onde ests tnperstureabsluta CHO, R el constant de os ess de aneapia de actnncion yA el factor de frecuencia. La figura 7.3 confirma la Wier we ta ecuacion [7], De manera similar se han obtenido k para Uiferentes miroorganismos¥ stances Teoria Ovo Se expresa el efecto de [a temperatura en reacciones quimic x 11 reacciones quimicas como una felacign entre ky. (la constante de velocidad de reaccién a T°K) y ky_yo (a Constante de velocidad de reaceion a T~10 °K). Se puede demostrar que: kr E 10 Q=—t tee (g |e ewer alee lye aan Cali de ts dos teoras rogues el gonocinient de fos valores de, 1 elon rngos de temperaturas en que Son apne, La tabla 7.1 presenta gine sjenplon Mv Ew enna eve 50) 100 inal coc cain Vgetatvas expos, mientins ue pate enaimes 0 vitaminas sm del orden de 2 a 20 Keal/mol, ve i iy Temperatura 115, 110106, “0 2 10 e ed ss 3 3 228 eT 7 dL eK) x10? Figura 7.3. Constante de wl (dd de esteiizacion (k) 2. temperatura