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Tesis98 PDF
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Bogotà D.C
2008
EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTAGONISTA “in vivo” DE
AISLAMIENTOS DE Trichoderma spp FRENTE AL HONGO
FITOPATOGENO Rhizoctonia solani
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al titulo de
Bogotà D.C
Enero 2008
NOTA DE ADVERTENCIA
“La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velarà por que no se publique nada
contrario al dogma, y a la moral católica y por que las tesis no contengan
ataques personales contra persona alguna, antes bien se ve en ellas el anhelo
de buscar la verdad y la justicia.”
EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTAGONISTA “in vivo” DE
AISLAMIENTOS DE Trichoderma spp FRENTE AL HONGO
FITOPATOGENO Rhizoctonia solani
_____________________________
JOSE SALVADOR MONTAÑA MSc.
DIRECTOR.
Bogotà D.C
Enero 2008
EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTAGONISTA “in vivo” DE
AISLAMIENTOS DE Trichoderma spp FRENTE AL HONGO
FITOPATOGENO Rhizoctonia solani
______________________________ ________________________
Gerardo Moreno Durán MSc. Luis David Gomez MSc.
JURADO JURADO
Bogotà D.C
Enero 2008
“A dios por darme la libertad de vivir, A mi madre Mery quien con
su hermoso ejemplo de honestidad y fortaleza alienta siempre mi
corazòn, por su amor de madre y comprensión infinita, a mi padre
Julio Cèsar, por su incondicional apoyo, por sus invaluables
consejos que fortalecieron mi alma y encaminaron mi vida, y a
Angèlica Maria y Jairo Humberto por su aliento de hermanos y por
el hermoso regalo de existir en mi vida “.
AGRADECIMIENTOS
Trichoderma (T3, Tsp5, Tv1, Tc1, Ti1 y T235), frente a Rhizoctonia. solani, un
fitopatògeno causante de muchas enfermedades en plantas. Se empleo para
ello la técnica de cultivo dual, donde los aislamientos T235 Y T3 mostraron los
mayores valores de crecimiento libre desde las 24h y los mas altos porcentajes
de inhibición micelial PIM Curiosamente el aislamiento comercial Tc1 presento
la menor tasas de crecimiento.
1. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………...…….. 1
2. MARCO TEÒRICO Y ESTADO DEL ARTE …………………………………… 3
2.1 BIOLOGIA DE Trichoderma ……………………………………………….. 5
2.2 Mecanismos de biocontrol de Trichoderma……………………………….. 6
2.2.1. Biocontrol por competencia………………………………………………. 7
2.2.2 Competencia por nutrientes……………………………………………… 8
2.2.3 Antibiosis……………………………………………………………………..8
2.2.4 Micoparasitismo…………………………………………………………….. 9
2.2.5 Sinergismo……………………..…………………………………….…......10
2.2.6 Biofertilización y mecanismos de defensa en plantas……………….. 10
2.2.7 Modificación de la rizosfera . …………………………………………… 10
2.3 Trichoderma en el biocontrol…………………………………………….….13
2.4 Trichoderma como biofertilizante………………………………….………. 15
2.5 Rhizoctonia solana……………………………………………………….…..16
2.5.1 BIOLOGÌA de Rhizoctonia solani……………………………………….. 17
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN……………...………20
4. OBJETIVOS………………………………………………………………………..22
4.1. Objetivo General……………………………………………………………. 22
4.2 Objetivos específicos……………………………………………………….. 22
5. MATERIALES Y METODOS……………………………………………………. 23
5.1 Diseño de la investigación………………………………………………….. 23
5.1.1 Ubicación…………………………………………………………………….23
5.1.2 Microorganismos……………………………………………………………23
5.1.3. Material vegetal …………………………………………………………... 24
5.1.4. Elaboración del banco de trabajo de aislamientos de Trichoderma... 24
5.1.5 Preparación del inoculo de aislamientos de Trichoderma …..……….. 25
5.1.6 Preparación del inóculo de Rhizoctonia solani………..……………….. 25
5.1.7 Prueba de antagonismo in-vitro …………………..…………………….. 26
5.1.8 Elaboración de la prueba de antagonismo…….……………………… .26
5.2 Evaluación de la capacidad antagonista “in vivo”……….……………….. 27
5.3 Diseño experimental ……….……………………………………………….. 28
5.4 Variables de estudio…………………………………………………. ..…… 29
6. RESULTADOS Y DISCUSIÒN………………………………………………….30
6.1 Evaluaciòn Macro y Microscòpica de aislamientos de Trichoderma ….. 31
6.2 Crecimiento libre de aislamientos de Trichoderma……………………... 33
6.3 Evaluaciòn de crecimiento del patógeno R. solani ……………………… 34
6.4 Actividad antagonista de las cepas de estudio ………………………….. 35
6.5 Evaluaciòn del antagonismo in vivo de aislamientos de Trichoderma …38
7. CONCLUSIONES ……………………………………………………………...…59
8. BIBLIOGRAFIA ……………………………………………………………….…. 61
INDICE DE FIGURAS
Figura 20. Evaluación del peso seco total de esquejes de clavel en respuesta
a la aplicación de Trichoderma spp posterior a la infección con R. solani…... 52
División: Eumycota
Subdivisión: Deuteromycotina
Clase: Hypomicetes
Orden: Hyphales
Familia: Monilaceae
Género: Trichoderma
Especie: Harzianum, hamatum, viride, longibranchiatum, entre otras.
2.2.3 Antibiosis
2.2.5 Sinergismo
Asi mismo existen algunos principios básicos de vital importancia para el éxito
del control biológico con ciertos hongos como Trichoderma. Esto incluye la
importancia de un propágalo efectivo ( jóven, hifa de activo crecimiento ) en
tenencia a una base de alimento, edad de la preparación, habilidad de los
hongos de biocontrol a invadir y tener una base de alimento ocupada por el
patógeno; la consideración de la cantidad de preparación y el tiempo de
aplicación, y prevalencia de las condiciones ambientales, durante y después de
la aplicación. ( Lewis and Papavizas ). Varios Autores han realizado estudios
tendientes a evaluar la capacidad antagonista in vivo de Trichoderma frente a
R. solani. Rodriguez, en 2002 evaluó la eficiente acción inhibitoria de la
utilización de cepas de Trichoderma y Pseudomonas Como antagonistas
contra R.solani, mediante pruebas in vitro y comparadas con su capacidad
biocontroladora en un cultivo de tomate en invernadero.
Este proceso representa una alternativa viable para producción tanto industrial
como artesanal de un inoculante biológico de buena calidad a base del
Trichoderma; con buenos resultados en campo. Estudios preliminares indican
que al aplicar este hongo a las semillas, sustrato en vivero, plantas en vivero,
recién transplantadas o plantas establecidas, produce efectos positivos en el
crecimiento y desarrollo de las mismas.
Hongo superior
Subdivisión: Deuteromycotina
Clase: Agonomycetes
Orden: Agonomycetales (Myceliales)
Género: Rhizoctonia
3.2 Justificación
Comparar los resultados obtenidos en las pruebas de antagonismo “in vivo” con
resultados obtenidos en condiciones “in vitro”
5. MATERIALES Y METODOS
5.1.1 Ubicación
5.1.2 Microorganismos
El peso seco total, de la parte aérea y de raíz del material previamente medidio,
se determinó mediante secado en un horno sin flujo de aire a 55Oc durante 48
horas.
La humedad del suelo fue mantenida en el 60 % de la capacidad de campo,
durante todo el ensayo.
El ensayo de antagonismo “in Vitro” se realizó por triplicado para cada uno de
los tratamientos.
Control
8 Trichoderma Trichoderma Tsp -------------
9 control Ccto -------------------- ------------
5.4 VARIABLES DE ESTUDIO
Altura de la planta
Longitud parte aérea
Longitud raíz
Incidencia de la enfermedad (% plantas vivas)
Síntomas: Amarillamiento, marchitamiento, necrosis de tejidos.
Peso fresco total
Peso seco parte aérea
Peso seco de raíz
Peso seco total
Con los valores obtenidos durante el estudio para las variables medibles se
llevó a cabo un análisis de varianza ANOVA y la comparación entre los
tratamientos mediante la prueba de tukey, tanto para los análisis “ in Vitro
como para los “ in vivo “.
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En general todos los tratamientos con Trichoderma, a excepción de Tsp5,
muestran una buena apariencia, calidad en los esquejes, un mayor crecimiento
aéreo y radicular, así como ausencia de signos o síntomas de la enfermedad
por R .solani. Estos resultados confirman los obtenidos en las pruebas de
antagonismo in vitro ( Figura 4-5), que demuestran la excelente actividad
antagonista ejercida por las especies de Trichoderma sobre el hongo R.solani.
Estos son indicativos favorables de la actividad del hongo como promotor del
crecimiento y agente antagonista en campo, sobre R.solani en esquejes de
clavel variedad Everest. El aumento de vigor observado en las plantas
inoculadas con Trichoderma, se ve reflejado en el crecimiento de la parte aérea y
radicular en el control con Trichoderma, el cual muestrà un crecimiento de 16,1
cms y 6,1 cms respectivamente, si se compara con los obtenidos con el control
con el patógeno el cual mostrò para estas mismas variables, resultados de 15,3
cm y 4,9 cms respectivamente ( Figura 13 -14) ( Anexo 1). Estos resultados
coinciden con los descritos por López et al., 1999, el cual establece que
Trichoderma produce sustancias estimuladoras del crecimiento y desarrollo de las
plantas, que actúan como catalizadores o aceleradores de los tejidos
meristemáticos primarios ( los que tienen potencial de formar nuevas raíces) en
las partes jóvenes de éstas, acelerando su reproducción celular, logrando que las
plantas alcancen un desarrollo más rápido que aquellas plantas que no han sido
tratadas con dicho microorganismo.
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Vale la pena resaltar que entre los días 19 y 23, se encuentran los resultados
de mayor relevancia respecto al aumento en el crecimiento. Se observa que
para los tratamientos Control Trichoderma, T3 y T235, se encontraron
aumentos cercanos al 43%, 40% y 39% respectivamente (Anexo 1C), mucho
mayores al encontrado en el control del patógeno que mostró un rendimiento
negativo a nivel de crecimiento para este tiempo. Estos resultados son
concordantes a los encontrados para la variable de peso fresco, que mostraron
aumentos de 35,7%, 32% y 34% para el control con Trichoderma, T3 Y T235
respectivamente. Por otra parte los resultados obtenidos para peso fresco en
el Control de crecimiento y control R.solani 20% y 11.7% respectivamente,
fueron mucho menores a los encontrados en los aislamientos con el hongo de
Trichoderma. Estos resultados confirman aún más la acción promotora del
crecimiento vegetal en esquejes de clavel por parte de las diferentes
aislamientos de Trichoderma, así como el efecto antagonista ejercido por el
hongo, sobre el fitopatógeno R .solani. Benitez et al., 2004; Sunil et al., 2005,
determinan que la productividad de cultivos en campo puede incrementarse
cerca del 300% después de la adición de Trichoderma hamatum o Trichoderma
koningii.
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El peso seco de la parte aérea y de las raíces de las plantas inoculadas con
Tc1 y el control con Trichoderma, se diferenció claramente de las inoculadas
sólo con el patógeno, observándose un desarrollo significativo de raíces y parte
aérea en presencia de estos tratamientos( Figuras 17-18) ( Anexo 1,Tabla 1E-
1F). Harman et al., en 1998, determina que la promoción del crecimiento
vegetal por parte de Trichoderma se manifiesta como una potenciación de la
germinación de las semillas, una floración más abundante y temprana y
aumentos de altura y peso de las plantas ( Vhang y Baker, et al.,1986).
Por otra parte el Control con R.solani evidenció la presencia activa del
patógeno sobre la base del tallo, asi como procesos de amarillamiento,
marchitamiento y valores de mortalidad alta sobre los esquejes de clavel
( Figura 19-21).
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En los tratamientos con el control con Trichoderma, asi como con los
aislamientos T3 Y T235 se obtuvo una mayor respuesta en cuanto a niveles de
crecimiento de la parte aérea y radicular de los esquejes de clavel, comparado
con el control de crecimiento y con el control de infecciòn ( Figura 9 ) ( Figura
23). Se pudo evidenciar entonces, el alto grado de biocontrol ejercido por parte
de las cepas de Trichoderma sobre el hongo R. solani, excepto el aislamiento
Tsp5. Esto se confirmò por la apariencia saludable de las plantas, ausencia de
síntomas de la enfermedad y valores superiores de las variables de longitud de
la parte aérea y peso evaluadas, con relación a los tratamientos control de
crecimiento y control de infección hacia el dìa 23 del ensayo. Algunos autores
han demostrado el efecto inductor en el crecimiento y desarrollo de las plantas
por parte de Trichoderma spp., es así como Yossen et al.,en 2003 demostraron
que al incorporar T. harzianum (TL 98) en germinadores de lechuga, además
de reducir el daño causado por R. solani, el antagonista promovió el
crecimiento de las plantas. Igualmente Inbar et al., en 1994., observaron que
aplicando T. harzianum en semilleros de pepino y de pimentón se incrementó
significativamente el crecimiento de las plántulas, comparadas con aquellas
que no recibieron la adición del hongo antagonista. Estos trabajos muestran el
beneficio de aplicar hongos, como Trichoderma, para obtener plantas vigorosas
y sanas ( Castro 2005).
. (
Se pudo determinar que las plantas con mayor peso seco fueron aquellas que
crecieron en los diferentes aislamientos con Trichoderma, especialmente con
el control de Trichoderma y T235 (Figura 20) ( Anexo 1G). Ahora bien, La
evaluación del nivel de daño radical, mostró que este fue menor en presencia
de los tratamientos con el hongo antagonista, que en el tratamiento con el
control de infecciòn (Figura 20-22). Un ensayo realizado sobre pasto Estrella
demostró que la ganancia en peso seco con algunos aislamientos de
Trichoderma es cercana al 23%, en longitud de las raíces y de estolones este
incremento fue de un 30% ( www.infojardin.com/foro/showthread.php).
.
Benitez et al., 2004, Yedidia et al., 2000 establecen que el rápido desarrollo y
colonización de Trichoderma de las zonas adecuadas para la infección, como
áreas de necrosis, heridas o partes concretas de la planta, impiden físicamente
el acceso y establecimiento del patógeno en su hospedador.
Bajo las condiciones evaluadas, los aislamientos control Trichoderma, asi como
T235 y T3 pueden ser considerados los de mayor importancia en la promoción
del crecimiento vegetal y en pro del control biològico del hongo fitopatógeno R
.solani y la reducción de los síntomas de la enfermedad en esquejes de clavel
variedad Everest en condiciones de invernadero.
Realizar pruebas entre las especies del hongo Trichoderma con otros
fitopatógenos de importancia agrícola, para identificar las posibles
interacciones y antagonismos.
ANEXOS
ANEXO 1
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ANEXO 2
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ANEXO 3.
ANALISIS ESTADISTICO
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