DYNA

http://dyna.medellin.unal.edu.co/

Measurement of proteins by photocolorimetry

Medición de proteínas mediante fotocolorimetría
Mauricio José Castro Glen a & Sebastián Moreno Otálvaro b
a
Facultad de Minas, Universidad Nacional de Colombia, Medellín, Colombia. majcastrogl@unal.edu.co
b
Facultad de Minas, Universidad Nacional de Colombia, Medellín, Colombia. semorenoot@unal.edu.co

Received: September 8th, 2017.

Abstract
A sample of albumin was prepared, in order to construct the spectra of absorption of albumin, and identify the length of wave where the
absorptivity was maximum, which was found to be 540 nm. Then, using that data, the calibration curve for albumin concentration was
constructed, by making samples at various concentrations of albumin, and measuring their absorptivity, in order to apply the Beer´s law.
The curve was made twice: one by using a conventional colorimeter, and the other with a digital colorimeter; it was found a better
correlation of the data by using the digital colorimeter. By using the first curve, the concentrations of some samples were found. Also,
other samples of albumin, globulin and serum were prepared; the globulin was isolated from serum by precipitation, using ammonia
sulphate and then the centrifuge. The concentration of globulin and albumin in the serum was found to be 7,4378 and 2,2486 %p/v,
respectively.

Keywords: albumin; globulin; serum; photocolorimetry; Beer´s law

Resumen
Se preparó una muestra de albúmina con el fin de construir el espectro de absorción de la albúmina, y determinar la longitud de onda a la
cual se logra la máxima absorbancia, encontrándose esta en 540 nm. Con esa longitud de onda, se construyó la curva de calibración para
la albúmina, preparándose varias soluciones de esta y midiendo su absorbancia, y así aplicar la ley de Beer. La curva se construyó dos
veces: una utilizando un colorímetro convencional y en otra utilizando un colorímetro digital; se encontró una mejor correlación de los
datos con el colorímetro digital. Utilizando la primera curva, se halló la concentración de unas muestras problema. Además, se
prepararon muestras de albúmina, globulina y suero sanguíneo; la globulina fue aislada a partir del suero, mediante precipitación con
sulfato de amonio y posterior centrifugación. Se encontró que la concentración de albúmina y globulina en el suero es de 7,4378 y 2,2486
%p/v respectivamente.

Palabras clave: albúmina; globulina; suero sanguíneo; fotocolorimetría; ley de Beer

1 Introducción complementarias a las transmitidas.

1.1 Fotocolorimetría

La fotocolorimetría es una técnica en la cual se mide la 1.2 Espectro de absorción

absorbancia por parte de una muestra coloreada, la cual está
contenida en una celda, de luz incidente con longitud de onda
generalmente dentro del rango del espectro visible (400-700 nm).
Esta técnica es utilizada para hallar concentraciones desconocidas
de soluciones, mediante curvas de absorbancia vs concentración.
Incluso es útil para soluciones no coloreadas; este problema se
soluciona añadiendo a la muestra un reactivo que permita la
coloración. Por otro lado, cuando se necesita detallar la cinética de
reacciones enzimáticas, la fotocolorimetría puede ser una técnica a
usar.
La absorbancia, como se mencionó antes, no sólo depende del
tipo de sustancia sino también de la longitud de onda de la luz
incidente. Por consiguiente, un espectro de absorción (Absorbancia
vs Longitud de onda, λ) puede ser construido para una muestra.
El espectro de absorción tiene un máximo global; asimismo
puede poseer otros máximos locales, dependiendo de la muestra.
El máximo global es el punto donde se da la mayor absorción en
una longitud de onda específica.

Cuando se incide luz visible en una solución coloreada, ésta 1.3 Curva de calibración: Ley de Beer Lambert
se puede reflejar, transmitir o absorber. Lo anterior depende de la
naturaleza de la sustancia y de la longitud de onda incidente. Cabe La ley de Beer es una relación empírica, enunciada por
mencionar que las longitudes de onda absorbidas son August Beer, en 1852, en la que se establece una relación de

© The authors; licensee Universidad Nacional de Colombia.

DYNA 81 (184). September, 2017. Medellín. ISSN 0012-7353 Printed, ISSN 2346-2183 Online
 Castro-Glen & Moreno-Otálvaro / DYNA 81 (184). September,2017.

proporcionalidad entre la intensidad de luz absorbida con la
concentración de una especie.
Esta relación puede escribirse como:
𝑨=𝜺×𝒄×𝑳 (1)
Donde A es la intensidad de luz absorbida, a una determinada
longitud de onda; ε es el coeficiente de absortividad molar, c es la
concentración de la especie; y L es la longitud de la placa a través
de la cual se mide la absorbancia.
A partir de esto, es posible determinar la concentración de
una especie que se desconoce, únicamente conociendo su
absorbancia a una determinada longitud de onda, la cual es
característica de cada sustancia.
separaron las globulinas; se tomó 1 ml de suero y se disolvió en 4
ml de agua destilada, luego se añadió sulfato de amonio, forzando
la precipitación de las globulinas (salting out), y posterior
centrifugación por 20 min. Se retiró el sobrenadante y el
precipitado se disolvió en solución salina hasta alcanzar 5 ml. Se
realizó la medición de absorbancia para 4 muestras, tomándose de
ellas 1 ml: un blanco (solución salina), solución patrón de
albúmina, la muestra de globulinas y la muestra de proteínas
totales; a todas las muestras se les agregó 4 ml de reactivo de
Biuret, se les agitó y dejó en oscuridad por 20 minutos. También,
se construyó otra curva de calibración con 6 muestras preparadas a
partir de la solución patrón de albúmina. En esta parte de la
práctica se utilizó el colorímetro digital.
3 Resultados y análisis de resultados

1.4 Aplicación a la cuantificación de proteínas 3.1 Espectro de absorción

La ley de Beer es aplicable a cualquier tipo de sustancia, En la siguiente tabla se detallan los datos de absorbancia
siempre que la longitud de onda a la cual se mide la absorbancia obtenidos para las longitudes de onda evaluadas. Cabe mencionar
sea la máxima. En el caso particular de las proteínas, la longitud de que hay datos que indican una absorbancia negativa, esto no
onda a la cual sucede esto no se encuentra dentro del espectro significa que la muestra no absorba luz, sino que su absorbancia es
visible, por lo que se hace necesaria la formación de un compuesto menor comparada con la absorbancia del blanco. El valor de
coloreado. Esta es la función del reactivo de Biuret, el cual absorbancia máximo, utilizado en las siguientes pruebas, se
contiene sulfato de cobre; las proteínas en presencia del cobre encontró a una longitud de onda de 540 nm.
forman un complejo coloreado para el cual, la longitud de máxima
absorbancia se encentra dentro del espectro visible, por lo que las Tabla 1. Absorbancia de la muestra a varias longitudes de onda
técnicas de fotocolorimetría son aplicables. Longitud de Longitud de
Absorbancia Absorbancia
onda [nm] onda [nm]
Se puede hallar la concentración a partir de la absorbancia de 400 0,108 560 0,130
420 0,066 580 0,110
dos formas: utilizando la ecuación de la recta que se obtiene al
440 0,052 600 0,078
hacer la regresión de los datos, o utilizando directamente la ley de 460 0,058 620 0,045
Beer. Si se tiene una muestra patrón de concentración conocida y 480 0,078 640 0,014
una muestra problema, si las condiciones de medición son iguales, 500 0,104 660 -0,013
se cumple que: 520 0,127 680 -0,031
540 0,139 700 -0,040
𝑨𝒑𝒂𝒕𝒓ó𝒏 𝑨𝒑𝒓𝒐𝒃𝒍𝒆𝒎𝒂 Fuente: Elaboración propia
= (2)
𝑪𝒑𝒂𝒕𝒓ó𝒏 𝑪𝒑𝒓𝒐𝒃𝒍𝒆𝒎𝒂
3.2 Primera curva de calibración
2 Metodología En la siguiente tabla se detallan las composiciones de las
muestras preparadas, así como, las absorbancias registradas.
El desarrollo de la práctica se dividió en dos partes:
Tabla 2. Muestras evaluadas para la primera calibración
En la primera parte se realizó el espectro de absorción de la Solución Reactivo
albúmina y la primera curva de calibración. Para realizar el Solución Solución
# salina de
patron problema Absorbancia
espectro de absorción se preparó un blanco, compuesto por Muestra 0,9% Biuret
[ml] [ml]
solución salina y reactivo de Biuret, y una solución de 1 ml de [ml} [ml]
albúmina, 1 ml de solución salina y 1 ml de Biuret. Se calibró el Blanco - - 2,0 4,0 0,000
equipo inicialmente en 400 nm, y se fue midiendo la absorbancia 1 0,1 - 1,9 4,0 0,014
de la muestra frente a cambios en la longitud de onda, aumentando 2 0,3 - 1,7 4,0 0,029
3 0,5 - 1,5 4,0 0,055
de a 20 nm hasta los 700 nm. Para realizar la curva de calibración 4 0,7 - 1,3 4,0 0,089
se tomaron muestras de una solución patrón de albúmina, de 5 0,9 - 1,1 4,0 0,117
concentración conocida, 0,32% p/v, y se diluyeron en solución 6 1,2 - 0,8 4,0 0,127
salina y reactivo de Biuret, agitándose y dejándose en oscuridad 7 - 0,5 1,5 4,0 0,040
por 20 minutos. Se prepararon 6 muestras a partir de la solución 8 - 1.0 1,0 4,0 0,081
patrón y con estas se construyó la curva de calibración, midiendo 9 - 1,2 0,8 4,0 0,105
la absorbancia de estas. También, se prepararon 3 muestras, no a Fuente: Elaboración propia
partir de la solución patrón, sino a partir de una solución problema,
con el fin de, a través de la curva de calibración construida, hallar La concentración de las especies de las muestras 1-6 fue
la concentración de ésta. En esta parte de la práctica se utilizó el hallada con la relación de dilución, tal como se muestra a
colorímetro convencional. continuación:

En la segunda parte se preparó una solución de proteínas 𝐶1 𝑉1 = 𝐶2 𝑉2 (3)

totales a partir de 1 ml de suero sanguíneo, disuelto en solución
salina hasta completar 20 ml. A partir del mismo suero se

2
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La concentración 1 representa la concentración de la solución Tabla 4. Muestras evaluadas para la segunda calibración
patrón, la cual es conocida, el volumen 1 el volumen añadido de Reactivo
# Solución Solución
esa solución patrón, y el volumen 2 el volumen de la solución de Biuret Absorbancia
Muestra patrón [ml] salina [ml]
preparada, el cual se asume como 6 ml (volúmenes aditivos). [ml]
Blanco - 2,0 4,0 -
1 0,3 1,7 4,0 0,038
Con esos datos se construyó la curva de calibración, la cual se 2 0,5 1,5 4,0 0,046
muestra a continuación: 3 0,7 1,3 4,0 0,065
4 1,0 1,0 4,0 0,093
5 1,2 0,8 4,0 0,117
Curva de calibración 1 6 1,5 0,5 4,0 0,145
0,15 Fuente: Elaboración propia

De manera similar a como se hizo anteriormente, se hallaron

Absorbancia

0,1 las concentraciones, esta vez expresadas en mg/ml, y se construyó

la curva de calibración, como se muestra a continuación:
y = 2,1298x + 0,0018
0,05
R² = 0,962
Curva de calibración 2
0,2
0 y = 0,1743x + 0,0035
0,15

Absorbancia
0 0,02 0,04 0,06 0,08 R² = 0,9898
Concentración %p/v 0,1
Figura 1. Curva de calibración 1 0,05
Fuente: Elaboración propia
0
Para las muestras problema, a partir de la ecuación de la línea 0 0,5 1
recta recién obtenida, es posible despejar el valor de la Concentración [mg/ml]
concentración 2, y aplicando la ec. (3), es posible hallar la Figura 2. Curva de calibración 2
concentración 1. Como se tienen tres datos, se realiza el promedio Fuente: Elaboración propia
de los datos.
3.4 Medición de absorbancia de las soluciones de proteínas
Se realizó el mismo procedimiento, utilizando la ec. (2) para
hallar las concentraciones, y luego la ec. (3) para hallar la En la siguiente tabla se muestra la absorbancia de las muestras
concentración de la muestra problema. Nuevamente se realizó un preparadas:
promedio de los datos.
Tabla 5. Absorbancia de las soluciones de proteínas
Tabla 3. Concentración de las muestras problema Muestra Absorbancia
Concentración muestra problema Blanco -
Método Solución patrón 0,146
línea 0,2152 0,2231 0,2423 Solución globulinas 0,208
recta Solución proteínas totales 0,224
Ley de Fuente: Elaboración propia
0,2201 0,2228 0,2407
Beer
Fuente: Elaboración propia Utilizando la ec. (3), y asumiendo que los volúmenes son
aditivos, es posible conocer la concentración de la muestra
Así, se reporta que la concentración de la solución problema es preparada a partir de la solución patrón. La solución patrón es la
de: misma utilizada anteriormente, de concentración 0,32% P/v; de
este modo la concentración calculada es de 0,064% p/v.
𝑐𝑝𝑟𝑜𝑏𝑙𝑒𝑚𝑎 = 0,23 ± 0,01 % 𝑝/𝑣
Conociendo esta concentración, es posible utilizar la ec. (2)
La concentración teórica es de 0,2066 %, por lo que se tiene un para determinar la concentración de globulinas y de proteínas
porcentaje de error del 9,81%, un valor bastante alto pero que entra totales. Como el objetivo es determinar la concentración de estas
en concordancia con el bajo coeficiente de correlación obtenido en en la solución original, es necesario aplicar nuevamente la ec. (3).
la regresión lineal. Finalmente, para hallar la concentración de albúmina real en el
suero sanguíneo, se realiza la resta de la concentración de
globulinas de las proteínas totales.
3.3 Segunda curva de calibración
Tabla 6. Concentraciones halladas mediante la ley de Beer
En la tabla 4 se muestran la composición de las muestras Muestra Concentración en Concentración real
preparadas, así como la absorbancia medida solución [%p/v] en el suero [%p/v]
Solución de globulinas 0,0899 2,2486

Solución proteínas totales 0,0969 9,6865

Albúmina 0,064 7,4378

. Fuente: Elaboración propia

3
 Castro-Glen & Moreno-Otálvaro / DYNA 81 (184). September,2017.

Asimismo, se puede calcular las concentraciones en solución

de las globulinas y proteínas totales a partir de la ecuación de la
recta de la Fig. 2. Es necesario extrapolar, ya que los valores de la
absorbancia están fuera de esta línea recta. Los resultados se
ilustran en la tabla 7

Tabla 7. Concentraciones halladas partir de la curva de calibración

Muestra Concentración en Concentración real
solución [%p/v] en el suero [%p/v]
Solución de globulinas 0,1173 2,9325

Solución proteínas totales 0,1265 12,650

Albúmina 0,082 9,7175

Fuente: Elaboración propja

Se tiene que el valor teórico para la concentración de proteínas

totales varía de 6-8 %p/v y la de albúminas entre 3.5-5 %p/v
(Busher, n.d.).

Se observa que los dos métodos que se utilizaron para hallar

las concentraciones no dieron un valor aceptable, pues los datos
encontrados se salen del rango teórico. Lo anterior se debe a que
cuando se calcularon estas concentraciones por la ley de Beer y
por la curva de calibración, se está suponiendo que la constante de
absortividad es igual tanto para la albúmina como para las otras
proteínas, lo cual no es cierto y puede ocasionar el error.

4 Conclusión

La fotocolorimetría es una técnica relevante y útil al momento

de querer hallar concentraciones desconocidas de muestras, ya sea
a partir de la ley de Beer o por medio de una curva de calibración.
Una aplicación del método se basa en la cuantificación de
proteínas en el suero sanguíneo, pudiéndose conocer la
concentración de albúminas y globulinas. Es importante destacar
que todas las mediciones de absorbancia que se requieran hacer, se
deben realizar en la longitud de onda de máxima absorción; por
tanto, es imprescindible proceder a hacer pruebas donde se calcule
tal longitud de onda.
Para obtener mejores resultados, se recomienda utilizar una
curva de calibración propia para cada proteína

5 Referencias

Busher, J. (n.d.). Serum Albumin and Globulin. In Clinical

Methods: The history, physical and laboratory examination
(3rd ed.).
Escuela de Química. (n.d.-a). Práctica 1. Fotocolorimetría.
Escuela de Química. (n.d.-b). Práctica 2- Cuantificación de
proteínas en el suero sanguíneo.