Verificacin de espectrofotmetros

Introduccin

Cuando un equipo fotomtrico esta calibrado se puede asegurar confiabilidad y

exactitud del mismo. Para que un espectrofotmetro funcione correctamente se debe
verificar: la linealidad, la sensibilidad y la calibracin.

Linealidad: son pruebas preliminares acerca de la exactitud del mtodo, se realiza un

anlisis de estndares de pureza conocida que abraca el rango de linealidad deseada y
tiene concentraciones en determinados puntos especficos, una vez analizados se grafica
la concentracin contra la media de los resultados y la linealidad se confirma cuando es
posible trazar una lnea recta a travs de los datos puntuales que forma un ngulo de
45 con los ejes y no se desvi en ninguno de los extremos antes de alcanzar el rango de
linealidad esperado.

Sensibilidad: es la probabilidad de una prueba positiva cuando est presente la

enfermedad que la prueba que se le realiza la pueda detectar.

Calibracin: es el uso de estndares de concentracin conocida que sirven para evaluar el

mtodo de anlisis. Se realiza una curva tipo de todos los metabolitos que se van
analizar y los parmetros que indican que la curva tipo que se realiza est correcta son:
coeficiente de relacin, desviacin estndar y la regla de la recta.

Resultados

Verificacin de calibracin y sensibilidad

LONGITUD
ABSORBENCIA
DE ONDA
CALIBRACION Y SENSIBILIDAD
450 0.358
460 0.415 0.7

470 0.459 0.6

480 0.496 0.5
490 0.556 0.4
500 0.593 0.3
510 0.569 0.2
520 0.501
0.1
530 0.403
0
540 0.285 450 460 470 480 490 500 510 520 530 540 550
550 0.184

Tabla y grafica 1. Verificacin de la calibracin y sensibilidad del espectrofotmetro,

utilizando una solucin de cloruro de cobalto (2.2% en HCl 1%).
 Verificacin de espectrofotmetros

Verificacin de la linealidad

[mg/dL] ABSORBENCIA (500nm) % de error

26.5 0.083 -83.4
53 0.169 -66.2
106 0.368 -26.4
159 0.54 8
212 0.731 46.2
265 0.895 79
318 1.123 124.6
371 1.285 157
424 1.453 190.6
477 1.613 222.6
530 1.804 260.8

Tabla 2. Lecturas de la absorbencia de las diferentes concetraciones de cloruro de

cobalto, y su porciento de error.

Linealidad
2
y = 0.1774x - 0.1497
1.8 R = 0.9981

1.6

1.4

1.2
absorbencia

0.8

0.6

0.4

0.2

0
0 2 4 6 8 10 12

Grafica 2.0. Linealidad del espectrofotmetro Spectronic genesys 20.

 Verificacin de espectrofotmetros

% de error
300

250

200

150

100
% de error
50

0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
-50

-100

-150

Grafica 2.1. Representacin del porciento de error de la linealidad de espectrofotmetro

Spectronic genesys 20.

Conclusiones

El espectrofotmetro mostro una absorbencia de 0.569 a 510nm con una solucin de

cloruro de cobalto, segn la literatura la absorbencia mxima que debe tener el cloruro de
cobalto es de 0.5 a 510nm. Podemos decir que nuestro espectrofotmetro tiene una
sensibilidad adecuada dado que la absorbencia mxima obtenida en la prctica fue muy
parecida a la absorbencia mxima conocida segn la literatura.

El espectrofotmetro esta calibrado ya que la absorbencia mxima fue parecida a la ya

establecida o conocida.

Nuestro aparato tiene linealidad ya que, la absorbencia es directamente proporcional a la

magnitud de la concentracin, por lo tanto cumple con la Ley de Beer. Se obtuvo una
R2=0.9981.
 Verificacin de espectrofotmetros

EXTRA:

CONTROL DE LINEALIDAD FOTOMTRICA

Mtodo:

La solucin de Rojo Congo diluda 1/5 ser tomada como la solucin madre al 100%
(0,060 mg/ml) A partir de sta hacer diluciones para obtener soluciones al 75; 50; 25 y
12,5% (0,045; 0,03; 0,015 y 0,0075 mg/ml respectivamente). Medir las absorbancias de
las soluciones al ptimo. Finalmente, graficar Abs = f(Cc), considerando como dato el
0%.

Calibracin con rojo Congo

Reactivos requeridos

Solucin de Rojo Congo 14 mg/L

HCl 2,5 N
NaOH 2,5 N

Procedimiento

1) Preparacin de las formas cida A y alcalina B del colorante.

Alicuotar con una misma pipeta 5 mL de solucin de Rojo Congo 14 mg/L en dos tubos de
ensayo rotulados A y B.
Solucin A: al tubo A agregarle 20 uL de la solucin de HCl 2,5 N
Solucin B: al tubo B agregarle 20 uL de la solucin de NaOH 2,5 N
Usar una nica micropipeta para dispensar los 20 uL.
Las soluciones A y B una vez preparadas son estables 1 hora a temperatura ambiente.
2) Realizacin del barrido espectrofotomtrico de las soluciones A y B entre 520 y 570
nm.
Se deber realizar el espectro de las soluciones A y B contra agua destilada. Se puede
trabajar a temperatura ambiente ya que el punto isosbstico es independiente de la
temperatura entre 4 y 45 C.
Se recomienda proceder de la siguiente manera:
2.1) Mtodo manual para espectrofotmetros con cubetas de caras paralelas de 1 cm de
espesor. (Mtodo que utiliza una cubeta)
Llenar una cubeta con agua destilada y ajustar el cero de absorbancia a 520 nm. El
regulador de absorbancias no se tocar ms durante toda la experiencia.
Leer y registrar las absorbancias a las longitudes de onda indicadas en la tabla provista.
Vaciar y llenar la misma cubeta con la solucin A repitiendo el mismo barrido.
Vaciar, enjuagar con agua destilada y llenar la misma cubeta con la solucin B repitiendo
el mismo barrido.
 Verificacin de espectrofotmetros

2.2) Mtodo manual para espectrofotmetros con cubetas de caras paralelas de 1 cm de

espesor. (Mtodo que utiliza tres cubetas)
Elegir 3 cubetas iguales, sin rayaduras y perfectamente limpias. Llenar una con agua
destilada y las otras con las soluciones A y B respectivamente. Ajustar el cero de
absorbancia a 520 nm con la cubeta que tiene el agua destilada. Retirar dicha cubeta y
medir la absorbancia de la solucin A, y luego de la solucin B registrando los valores en
la tabla directamente como Abs. netas. Seleccionar luego 525 nm y repetir los pasos
anteriores, es decir, ajustar primero el cero con agua destilada y luego leer las soluciones
A y B. Repetir estos pasos a cada una de las longitudes de onda indicadas en la tabla
adjunta, llevando a cero con la cubeta de agua destilada en cada longitud de onda.
2.3) Mtodo para los espectrofotmetros con microcubetas y bomba de succin.
Aspirar agua destilada y ajustar a cero de absorbancia a 520 nm. El regulador de
absorbancias no se tocar ms en toda la experiencia.
Mover el selector de longitudes de onda hacia los 570 nm realizando el espectro del agua
tal como se indica en la tabla adjunta, registrando todos los valores de absorbancia.
Vaciar la cubeta y aspirar la solucin A realizando el mismo barrido.
Vaciar la cubeta, enjuagar pasando agua destilada y aire y aspirar la solucin B
realizando el mismo barrido.
Nota: para realizar el barrido del agua destilada en los mtodos b1 y b3 se recomienda
empezar llevando a cero de absorbancia a 520 nm con el fin de tener todas las
absorbancias positivas. Si el espectro del agua da valores negativos comenzar a otra
longitud de onda de manera tal de no tener valores negativos de absorbancias ya que
finalmente ser restado el espectro del agua punto a punto del de las soluciones A y B.

Bibliografa
http://www.altillo.com/examenes/uba/farmaciaybioquim/fisica/fisica2006tpespectrof
otometria1.asp
http://www.scielo.org.ar/scielo.php?pid=S0325-
29572005000400014&script=sci_arttext