Protocolo Western-blot

1. Lisar la muestra.
Centrifugar 5 minutos a 1500 rpm.
Recoger el suero. Congelar a -20C.
2. Aadir buffer de carga
200 microlitros de muestra
100 microlitros de buffer 3x
3. Sonicar.

4. Aadir DTT y betamercapto ( para que no se formen enlaces)

5. Guardar muestra a -20 C -80 C. Mantener a cuatro grados durante la

manipulacin.

6. Realizar gel de poliacrilamida. ( existen patrones estandarizados).

7. Hervir las muestras 5 minutos a 90 C y centrifugar.

8. Cargar el gel con las diferentes muestras a trabajar.

9. Realoizamos la electroforesis y corremos el gel con un buffer de tris-glicina a

una velocidad de 150-180 V.

10. Realizamos la transferencia havia la menbrena. Realizamos un electroblotting a

400 con hielo y un iman para enfriar el proceso.

11. Extraemos la membrana

12. Ralizamos un lavado de la membrana usando PBS TBS.

13. Bloqueamos la membrana con un suero de leche desnatada al 1 por ciento urante
una hora a 37C.

14. Aadimos el Ac primario durante el tiempo de incubacin deseado.

15. Lavamos con solucin de TBS durante treinta minutos.

16. Aadimos ac secundario.

17. Lavamos con solucin de TBS durante treinta minutos.

18. Revelamos con el medio utilizado en el laboratorio.