Manual Enfermedades Chagas PDF

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
MINISTERIO DE SALUD
SERIE DE NORMAS TCNICAS N 00

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE
LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO
DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA
(ENFERMEDAD DE CHAGAS)
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA
Instituto Nacional de Salud

Calle Cpac Yupanqui 1400, Lima 11, Per
Apartado Postal 471, Telfono: (0511) 471-9920 Fax: (0511) 471-0779 SERIE DE NORMAS TCNICAS N 00
Correo electrnico: revmedex@ins.gob.pe
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Lima, 2005
MINISTERIO DE SALUD
Ministerio de Salud
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL

DIAGNSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA
(ENFERMEDAD DE CHAGAS)
ELABORACIN:
Biloga Silvia Vega Chirinos
Doctor Csar Nquira Velarde
Laboratorio de Leishmaniosis y Chagas

Centro Nacional de Salud Pblica-INS
Catalogacin hecha por el Centro de Documentacin e Informacin del INS
Vega Chirinos, Silvia ; Nquira Velarde, Csar

Manual de procedimientos de laboratorio para el diagnstico de la
trypanosomiosis americana (enfermedad de Chagas) / Elaborado por Silvia
Vega Chirinos y Csar Nquira Velarde. 2. Ed. Lima : Ministerio de Salud,
Instituto Nacional de Salud, 2006.
106 p.: 14.5 x 21 cm. (Serie de Normas Tcnicas; 26)
1. TCNICAS Y PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO 2. ENFERMEDAD DE

CHAGAS
I. Nquira Velarde, Csar
II. Vega Chirinos, Silvia
III. Instituto Nacional de Salud (Per)
IV. Per. Ministerio de Salud
1. edicin, 1999
ISBN 9972 857 26 3 (O.C.)

ISBN 9972 857 30 1 (N26) (2da. ed.)
ISSN 1607 4904
Hecho el Depsito Legal N 1501132002-5854
Ministerio de Salud, 2006

Av. Salaverry cuadra 8 s/n, Jess Mara, Lima, Per
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Instituto Nacional de Salud, 2006

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Publicacin aprobada con R.J. N 164 2006 JOPD/INS
Portada: Observacin microscpica de formas mviles del Trypanosoma cruzi.

Aspectos de identificacin y diagnstico de la enfermedad de Chagas.
Se autoriza su reproduccin total o parcial siempre y cuando se cite la fuente.

CONTENIDO
Resolucin jefatural ................................................................................. 5

Presentacin ............................................................................................. 7
Introduccin ............................................................................................... 9
CAPTULO I
Trypanosoma cruzi ................................................................................... 11
CAPTULO II
Diagnstico de laboratorio ....................................................................... 21
CAPTULO III
Obtencin de la muestra sangunea ....................................................... 29
CAPTULO IV
Examen de la sangre: en fresco, gota gruesa, frotis .............................. 33
CAPTULO V
Tcnicas de concentracin: microconcentracin, concentracin
de Strout .................................................................................................... 37
CAPTULO VI
Hemocultivo .............................................................................................. 41
CAPTULO VII
Xenodiagnstico ....................................................................................... 47
CAPTULO VIII
Hemaglutinacin indirecta (HAI) .............................................................. 51
CAPTULO IX
ELISA ......................................................................................................... 57
CAPTULO X
Inmunofluorescencia indirecta (IFI) ......................................................... 63
CAPTULO XI
Control de calidad .................................................................................... 69
CAPTULO XII
Bioseguridad ............................................................................................. 73
Referencias bibliogrficas ...................................................................... 77
Anexo 1: Preparacin de reactivos y medios de cultivo ......................... 79
Anexo 2: Aislamiento y mantenimiento del Trypanosoma

cruzi en el laboratorio ............................................................................... 87
Anexo 3: Preparacin de antgenos ........................................................ 89
Anexo 4: Conservacin y envo de muestras

Examen de laboratorio solicitado segn tipo de muestra ..................... 93
Anexo 5: Solicitud para el diagnstico de laboratorio de

la enfermedad de Chagas
Anexo 6: Solicitud de control del diagnstico de laboratorio

de la enfermedad de Chagas
Anexo 7: Registro de muestras para investigacin y monitoreo

de casos de enfermedad de Chagas
Anexo 8: Protocolo para la deteccin de anticuerpos anti

Trypanosoma cruzi por ELISA
Anexo 9: Protocolo para la deteccin de anticuerpos anti

Trypanosoma cruzi por inmunofluorescencia indirecta (IFI)
MPR - INS - 002 6 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD

PRESENTACIN
La trypanosomiosis americana o enfermedad de Chagas es una infeccin

parasitaria producida por Trypanosoma cruzi y transmitida por insectos
hematfagos de la familia Reduvidae.
La presencia de estos insectos infectados ha sido demostrada en todo el
pas, por lo que la transmisin vectorial de la infeccin est establecida en
el territorio nacional.
Al lado de la transmisin vectorial ocurre la no vectorial, principalmente por
transfusin sangunea, en forma congnita y tambin por transplante de
rganos. Se sabe que las manifestaciones clnicas de la enfermedad no
son caractersticas, por lo cual muchos casos pasan desapercibidos.
Los mtodos de diagnstico incluyen pruebas tan simples como los ex-
menes de sangre en fresco, frotis, gota gruesa y ms complicadas como
el hemocultivo, el xenodiagnstico, las pruebas serolgicas y moleculares.
El presente manual hace una descripcin de los mtodos ms frecuentes
e incluye el fundamento, el procedimiento y la lectura de los resultados.
En el fluxograma se sealan las pruebas que pueden desarrollarse en los
laboratorios locales, intermedios y regionales de la Red Nacional de
Laboratorios en Salud Pblica, as como los canales de envo de muestras
e informacin.
Se han aadido los captulos de bioseguridad, control de calidad y anexos,
el cual se refiere a los reactivos y la preparacin requerida para los mto-
dos de diagnstico.
El manual est especialmente dirigido para ser usado en todos los labora-
torios de la red por el personal encargado del diagnstico parasitolgico y
serolgico de la trypanosomiosis americana o enfermedad de Chagas.
Cabe puntualizar que el avance en la bsqueda de mtodos ms especfi-
cos y sensibles, permitir disponer de tcnicas ms eficientes y que en su
oportunidad sern incorporados a los que usa la red.
El comit de redaccin


INTRODUCCIN
La enfermedad de Chagas o trypanosomiosis americana constituye un

problema de salud pblica en la mayora de pases latinoamericanos; es
endmica desde Mxico hasta el sur de Chile y Argentina. Se ha calculado
que por lo menos 90 millones de personas estn expuestas a contraer la
infeccin y que 18 millones estn infectadas (Organizacin Mundial de la
Salud, 1991).
Esta enfermedad metaxnica es causada por el protozoario flagelado,
Trypanosoma cruzi y transmitida al ser humano, al igual que a otros mam-
feros, por insectos hematfagos conocidos como triatominos. Afecta diver-
sos rganos, sistemas y aparatos, especialmente el corazn y tubo diges-
tivo. Otras formas de contraer la infeccin son la transfusin sangunea, la
va transplacentaria o transmisin congnita y el transplante de rganos.
En el Per, el mayor impacto en la salud de los pobladores, ocurre en la
zona sur occidental (Ica, Arequipa, Moquegua, Tacna, valles interandinos
de Ayacucho y Apurmac), con la presencia del vector Triatoma infestans,
comnmente conocido como "chirimacha", cuyo hbitat es domiciliario y
en la zona nororiental (Cajamarca, Amazonas, San Martn), con los vectores
de los gneros Triatoma, Pastrongylus y Rhodnius, de hbitat
peridomiciliario y silvestre.
En estas reas, se estima en 24 170 el nmero de infectados por T. cruzi,
de los cuales 1209 corresponden a formas agudas u oligosintomticas y
22 962 a formas crnicas de la enfermedad. Se calcula que 3142 casos
corresponden a nios menores de cinco aos. La infeccin por sexo es
equitativa y el grupo de edad ms afectado est entre los 20 a 50 aos
(MINSA,1998).
El presente manual tiene por objeto guiar al personal de la Red Nacional
de Laboratorios en Salud Pblica, en el diagnstico parasitolgico y
serolgico de la trypanosomiosis americana o enfermedad de Chagas,
utilizando procedimientos uniformes y comparables.
El manual desarrolla los procedimientos de obtencin, procesamiento,
envo de muestras y medidas de bioseguridad que deben seguirse durante
el trabajo en el laboratorio.


CAPTULO I
Trypanosoma cruzi
Trypanosoma cruzi agente causante de la enfermedad de Chagas, es un

protozoario flagelado que durante su ciclo de vida, utiliza dos hospederos:
insectos de la familia Reduvidae, que hacen las veces de vector, y mamfe-
ros, incluyendo al ser humano, como reservorio.
El parsito presenta tres formas evolutivas (figura 1):
a) Trypomastigote: Es la forma infectante para los mamferos y el insecto
vector. Se caracteriza por ser de aspecto fusiforme, mide 20 micras,
presenta ncleo central y cinetoplasto subterminal del cual emerge
una membrana ondulante que recorre el parsito en toda su longitud y
cuyo borde libre lleva un flagelo que emerge por el extremo anterior. Se
le encuentra en la sangre de mamferos y en las heces del vector. No
se divide.
b) Amastigote: Es la forma intracelular del parsito, se aloja principal-
mente en los tejidos del msculo cardaco y del sistema neurovegetativo
del tubo digestivo. Es de forma redondeada, mide de dos a cuatro
micras, posee ncleo y cinetoplasto. Se dividen y forman seudoquistes
conocidos como "nidos de amastigotes".
c) Epimastigote: Es la forma libre que se multiplica por fisin binaria en el
interior del tubo digestivo del vector. Es de aspecto fusiforme, mide 20-
30 micras, presenta ncleo y cinetoplasto ubicados en la parte central
del parsito, forma que tambin se desarrolla en medios de cultivo.
1.1. CICLO BIOLGICO

El ciclo biolgico del Trypanosoma cruzi (figura 2) se inicia cuando el
triatomino libre de infeccin se alimenta de sangre humana o de animales
infectados que contiene los trypomastigotes.
Los trypomastigotes se diferencian en epimastigotes en la parte anterior
del tubo digestivo del triatomino, los que se multiplican y mantienen en el
intestino medio durante toda la vida del insecto. En el recto del triatomino,
se transforman en trypomastigotes llamados metacclicos y son elimina-
dos con las heces.

AMASTIGOTE TRYPOMASTIGOTE EPIMASTIGOTE

(INTRACELULAR EN (EN SANGRE CIRCULANTE DEL (EN PARTE ANTERIOR DEL
EL MAMFERO) MAMFERO Y HECES DEL INSECTO) TUBO DIGESTIVO DEL INSECTO
Y EN CULTIVOS)
Figura 1

Figura 2

Cuando el insecto infectado pica o succiona la sangre al reservorio, defeca

y deposita sobre la piel las heces que contienen trypomastigotes
metacclicos, formas infectantes para el mamfero. Los trypomastigotes
atraviesan la piel erosionada por el rascado a causa de la picadura y en
ocasiones, por la conjuntiva.
Se introducen en las clulas adyacentes y se transforman en amastigotes;
despus de multiplicarse rompen la clula que los hospeda y se disemi-
nan en la sangre como trypomastigotes e invaden los tejidos de rganos,
sistemas y aparatos importantes como el corazn y plexos nerviosos del
tubo digestivo, donde se reproducen como amastigotes.
1.2. MECANISMOS DE TRANSMISIN
a) VECTORIAL
El principal mecanismo de transmisin se produce por contacto de la
piel abierta o mucosas con las heces de los triatominos infectados.
Generalmente esto ocurre en forma mecnica al rascarse despus de la
picadura del insecto. El perodo de incubacin es aproximadamente de
4 a 15 das.
En el Per todas las regiones naturales registran especies de
triatominos (figura 3). De las 19 especies descritas hasta el momento,
Triatoma infestans, Pastrongylus herreri (figura 4), Rhodnius
ecuadorensis, Triatoma carrioni y Pastrongylus chinai, seran los ms
importantes que han sido hallados infectados naturalmente (figura 5).
b) NO VECTORIAL
Otras formas de adquirir la infeccin son:
Transfusin sangunea.
Transmisin transplacentaria.
Transplante de rganos.
Accidentes en el laboratorio.

DISTRIBUCIN DE TRIATOMINOS EN EL PER
Fig. 3. Distribucin de los vectores de la enfermedad de Chagas.

Fuente: Lumbreras H. (1972), Caldern F.(1982), Guilln Z.(1992), Cceres et al.
(2002).

A B
Fig. 4. Triatominos vectores de la enfermedad de Chagas.

A) Triatoma infestans espcimen adulto (hembra).
B) Pastrongylus herreri espcimen adulto (hembra).
Fig. 5. Izq.: Epimastigotes en divisin en el intestino del triatmico infectado, se

observa el cinetoplasto anterior al ncleo y agrupados en colonias. Giemsa 1000 X.
Der.: Trypomastigote metacclico en heces de triatmico infectado. Se observa el
cinetoplasto en el extremo posterior, forma que infecta al hombre. Giemsa 1000 X.

1.3. ACCION PATGENA

Las formas clnicas ms conocidas de la efermedad de Chagas o
trypanosomiosis americana son:
Forma aguda
Se hace evidente despus de las primeras semanas de ocurrida la adqui-
sicin del parsito, con un cuadro febril y presencia o no del chagoma de
inoculacin como ndulo o lcera, generalmente en cara o miembros su-
periores. Ocasionalmente se observa el signo de Romaa, que consiste
en edema bipalpebral unilateral y ganglio preauricular aumentado en volu-
men (Figura 6).
Fig. 6. Paciente que presenta chagoma de inoculacin en el ojo izquierdo. Los

trypomastigotes invaden la piel periorbitaria o conjuntiva, produciendo el complejo
oftalmo-ganglionar conocido como signo de Romaa (cortesa Dr. A. Guilln).

Las manifestaciones generales ms importantes son concomitantes con

sntomas cardacos, alteraciones electrocardiogrficas e insuficiencia car-
daca secundaria a miocarditis aguda.
Menos frecuentes son las manifestaciones de otros rganos. En estas formas
son abundantes los trypomastigotes en sangre y los amastigotes en tejido
(Figura 7).
Figura 7. Arriba: Trypomastigote de Trypanosoma cruzi en sangre circulante. El ncleo

se observa en posicin central y el cinetoplasto subterminal. Giemsa 1000 X.
Abajo: Amastigote de Trypanosoma cruzi en corte histolgico del corazn.
Formas redondeadas muy pequeas, presentan ncleo y cinetoplasto. Se les
observa agrupadas en el interior de las fibras musculares (nidos de amastigotes).
Hematoxilina-Eosina 1000 X.

Forma crnica
Se hace evidente despus de meses o aos de ocurrido el ingreso del
parsito. Las manifestaciones ms frecuentes son de naturaleza cardaca
(insuficiencia cardaca), nerviosa y digestiva (megaesfago, megacolon).
En estas formas son escasos los trypomastigotes en sangre y amastigotes
en tejidos.
Forma indeterminada o de portador

Se trata de personas aparentemente sanas, en las que la inoculacin del
parsito y los sntomas de las formas agudas o crnicas no son reconoci-
dos por el portador del parsito. La situacin del portador se evidencia,
generalmente, cuando la persona desea donar sangre y el tamizaje de-
muestra serologa positiva para Trypanosoma cruzi. Un portador puede
ser asintomtico toda la vida o presentar manifestaciones clnicas aun
despus de muchos aos de haberse infectado. En esta forma, son muy
escasos los trypomastigotes en sangre y amastigotes en tejidos.
Forma congnita
Corresponde a nios que nacen infectados por pasaje del parsito a tra-
vs de la placenta de la madre. Se trata de nios prematuros que presen-
tan generalmente hepatoesplenomegalia con gran cantidad de
trypomastigotes en sangre y amastigotes en tejidos.

CAPTULO II
DIAGNSTICO DE LABORATORIO
Para realizar el diagnstico del laboratorio, existen distintos procedimientos

tcnicos. Los directos o parasitolgicos, que se basan en la demostracin de
la presencia del parsito en sangre circulante y excepcionalmente en biopsias
y los inmunolgicos, que detectan la presencia de anticuerpos anti-
Trypanosoma cruzi (figura 8).
2.1. TCNICAS PARASITOLGICAS PARA LA DEMOSTRACIN DIRECTA DE

LA PRESENCIA DEL PARSITO
Gota fresca.
Gota gruesa-frotis.
Concentracin de Strout.
Microconcentracin.
Hemocultivo.
Xenodiagnstico.
PCR.
Biopsia.
Su empleo est indicado principalmente cuando existe sospecha clnica o
epidemiolgica de la forma aguda. Durante las dos a ocho primeras sema-
nas despus ocurrida la infeccin, existe un gran nmero de trypomastigotes
circulando en el torrente sanguneo y pueden detectarse mediante el examen
en fresco, gota gruesa-frotis, microconcentracin, concentracin de Strout,
hemocultivo y xenodiagnstico. Se usan tambin en la investigacin de Chagas
congnito.
El xenodiagnstico es una tcnica bastante sensible que consiste en ha-
cer picar al posible portador del parsito con el vector libre de infeccin. Es
aplicable tanto en la forma clnica aguda y congnita como en la crnica-
portador y permite la multiplicacin del parsito in vivo el cual se detecta
examinando las heces del insecto a partir del 30. da de su alimentacin.
El PCR o reaccin en cadena de la polimerasa, es una tcnica que amplifica
fragmentos de ADN del parsito y se detecta mediante hibridacin con cebadores
(fragmentos de DNA) conocidos del Trypanosoma cruzi. Actualmente est siendo
ensayada por su alta sensibilidad y especificidad, principalmente en la forma
congnita de la infeccin y en el seguimiento del tratamiento.

La biopsia de msculo esqueltico, ganglio etc., permite la observacin de

los "nidos de amastigotes". Esta tcnica est limitada a casos especiales
de estudio por lo que no se desarrollar en el presente manual.
El resultado parasitolgico positivo confirma la infeccin, pero el resultado
negativo no la descarta.
2.2. TCNICAS INMUNOLGICAS PARA LA DETECCIN DE ANTICUERPOS

CONTRA Trypanosoma cruzi
Las tcnicas ms empleadas en nuestro medio son:
Hemaglutinacin indirecta (HAI).
Inmunofluorescencia indirecta (IFI).
Tcnicas inmunoenzimticas: ELISA.
Son de mayor aplicacin durante la forma clnica crnica-portador cuando
la parasitemia en el torrente sanguneo es baja o nula y las tcnicas direc-
tas no pueden evidenciar la presencia del parsito. Detectan anticuerpos a
partir de la segunda o tercera semana de iniciada la infeccin.
Las tcnicas inmunolgicas, adems de aplicarse en el dignstico indivi-
dual de la enfermedad, son de utilidad en la seleccin de donantes de
sangre, los estudios de prevalencia de anticuerpos especficos en pobla-
ciones para conocer la epidemiologa de la enfermedad y la evaluacin del
impacto de las medidas de control.
En la actualidad se estn ensayando fracciones antignicas del parsito
que permitirn la interpretacin del estadio clnico del paciente. As mismo,
tcnicas inmunocromatogrficas basadas en protenas recombinantes o
pptidos sintticos para un diagnstico rpido de la infeccin (18).
Los mtodos son seleccionados dependiendo de la forma clnica por in-
vestigar (Figura 9).

ALGORITMO PARA EL DIAGNSTICO DE LABORATORIO Y SU

SEGUIMIENTO
ANTECEDENTE EPIDEMIOLGICO
- TRANSMISIN VECTORIAL INFECCIN POCO

NO
- TRANSFUSIN SANGUNEA PROBABLE
- TRANSMISIN CONGNITA
- TRANSPLANTE DE RGANOS
ASINTOMTICO
SINTOMTICO
( PORTADOR)
SOSPECHA
FORMA AGUDA : FORMA CRNICA:

BSQUEDA DE TRYPANOSOMAS EN DETECCIN DE ANTICUERPOS EN
SANGRE SUERO
MTODOS PARASITOLGICOS : MTODOS SEROLGICOS: DIAGNSTICO

NEGATIVO NEGATIVO
EXAMEN EN FRESCO, GOTA GRUESA HEMAGLUTINACIN INDIRECTA IMPROBABLE
CONCENTRACIN DE STROUT INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
MICROCONCENTRACIN ENSAYO INMUNOENZIMTICO
HEMOCULTIVO , ELISA
XENODIAGNSTICO, PCR OTROS
POSITIVO EN DOS PRUEBAS
XENODIAGNSTICO SEGUIMIENTO
NEGATIVO
PCR CLNICO
POSITIVO
DIAGNSTICO
POSITIVO
CONFIRMADO
Figura 8

FORMAS CLNICAS DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS

TCNICAS DE
DIAGNSTICO CRNICA -
AGUDA CONGNITA
PORTADOR
GOTA FRESCA + - +
GOTA GRUESA ++ - ++
MICROCONCENTRACIN +++ - +++
CONCENTRACIN
DE STROUT
+++ - +++
HEMOCULTIVO +++ +/- +++

XENODIAGNSTICO +++ + +++
PCR ++++ ++ ++++
PRUEBAS SEROLGICAS - Al inicio IgG +: Ac de la madre
(HAI, ELISA, IFI) +++ IgM +: Ac del recin nacido
+++ Despus de 20 das hasta los seis meses
- : No til
+/- : Utilidad relativa
+ : Util
Ac : Anticuerpos
Figura 9. Utilidad de las tcnicas de diagnstico en las formas clnicas.
2.3. DIAGNSTICO DE LABORATORIO EN LA RED NACIONAL

Los laboratorios de la red pueden realizar la diferentes tcnicas segn sus
posibilidades (figura 10).
2.3.1. DIAGNSTICO SEROLGICO. Para el diagnstico de laboratorio de
la infeccin chagsica, con mayor frecuencia, se aplican las tcnicas que
detectan anticuerpos especficos contra el parsito ya que tienen la capa-
cidad de evidenciarlos a partir de la tercera semana de ocurrida la infec-
cin (figura 11).
Siguiendo las recomendaciones de la Organizacin Panamericana de la
Salud, que considera necesaria la deteccin de anticuerpos anti T. cruzi
con por lo menos dos tcnicas de principio diferente, empleamos las tc-
nicas de ELISA e IFI, la primera altamente sensible para el tamizaje de la
infeccin y la segunda de elevada especificidad que complemente y ratifi-
que el resultado reactivo obtenido en el tamizaje. En conjunto ambas prue-
bas alcanzan el 95-98% de sensibilidad y especificidad.

RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PBLICA

ACTIVIDADES POR NIVELES
LABORATORIO DE REFERENCIA NACIONAL
COMPONENTE PARASITOLGICO
MICROCONCENTRACIN , CONCENTRACIN DE STROUT,
HEMOCULTIVO
HAI, ELISA, IFI , INMUNOBLOT
CARACTERIZACIN BIOLGICA Y MOLECULAR DE T. cruzi
DESARROLO DE TCNICAS BIOMOLECULARES: PCR
COMPONENTE ENTOMOLGICO
XENODIAGNSTICO
CONFIRMACIN TAXONMICA DE LOS VECTORES
INVESTIGACIN DE INFECCIN NATURAL DE TRIATOMINOS
SUSCEPTIBILIDAD DE LOS TRIATOMINOS A LOS INSECTICIDAS
TCNICAS ALTERNATIVAS DE CONTROL VECTORIAL
INFORMACIN Y MUESTRAS
ESTUDIOS MORFOMTRICOS Y DE VARIABILIDAD GENTICA
RESULTADOS
CAPACITACIN CONTROL DE CALIDAD
LABORATORIO DE REFERENCIA REGIONAL
EXAMEN DE GOTA FRESCA , GOTA GRUESA - FROTIS
DE
CONCENTRACIN DE STROUT , MICROCONCENTRACIN
HEMOCULTIVO
HAI, ELISA, IFI
ENVIO
DE
COMPONENTE ENTOMOLGICO
IDENTIFICACIN TAXONMICA, INVESTIGACIN DE INFECCIN
NATURAL DEL TRIATOMINO
ENVIO
DETERMINACIN DE LA DENSIDAD POBLACIONAL DEL VECTOR E

NDICE TRIPANO - TRIATMINICO
CAPACITACIN CONTROL DE CALIDAD
LABORATORIO DE NIVEL LOCAL
EXAMEN DE GOTA FRESCA , GOTA GRUESA FROTIS

CONCENTRACIN DE STROUT , MICROCONCENTRACIN
OBTENCIN DE MUESTRAS PARA EL DIAGNSTICO SEROLGICO
RECONOCIMIENTO DEL HBITAT Y CAPTURA DE TRIATOMINOS
Figura 10. Fluxograma de estudio de la enfermedad de Chagas en la red

FLUXOGRAMA PARA EL DIAGNSTICO SEROLGICO DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS EN LA RED
MANUAL
LABORATORIO LABORATORIO REFERENCIA LABORATORIO REFERENCIA

LOCAL REGIONAL NACIONAL
MPR - INS - 002

ELISA
OBTIENE ELISA e IFI
(Tamizaje)
MUESTRA
SANGRE
REPORTA - -y- +y+ REPORTA

Resultados
NO Resultado REACTIVO
REGISTRA REACTIVO
INFORMACIN + Discordante
+y-
REPORTA
NO OTRA PRUEBA
IFI
26
REACTIVO (HAI o IB)
SEPARA EL
SUERO O
PLASMA
- - Resultado
Resultado
Enva muestra I
Enva muestra
+ +
REPORTA REPORTA
REACTIVO REACTIVO
- : No reactivo
+: Reactivo
+ y +: Reactivo en ELISA y reactivo en IFI
I NSTITUTO N ACIONAL
+ y -: Reactivo en ELISA y no reactivo en IFI
DE
Figura 11. Las muestras con resultado indeterminado, se vuelve a examinar. Si persiste el resultado se solicita y se examina una
nueva muestra.
S ALUD
DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA
FLUXOGRAMA PARA EL DIAGNSTICO E INVESTIGACIN DE LA FORMA

CLNICA AGUDA EN LA RED
LABORATORIO LABORATORIO LABORATORIO
LOCAL REFERENCIA REGIONAL REFERENCIA NACIONAL
OBTENCIN DE MUESTRA DIAGNSTICO

DE SANGRE SEROLGICO
(Persona con sospecha
clnica o epidemiolgica)
BIOLGICA Y
HEMOCULTIVO
MOLECULAR DE
TRYPANOSOMAS
GOTA GRUESA
MICROCONCENTRACIN
CONCENTRACIN STROUT
NO
- Resultado
+
SE CONFIRMA Resultado
EL CASO Enva muestra Enva cultivo
de sangre (5mL) +
Una prueba +
CASO AISLAMIENTO
CONFIRMADO DEL PARSITO
Figura 12. El resultado positivo en la gota gruesa o microconcentracin, confirma la

infeccin, pero el resultado negativo no asegura que est libre libre de ella; en este
ltimo caso, se examina una nueva muestra y simultneamente se investiga la pre-
sencia de anticuerpos (IgG) anti Trypanosoma cruzi.
2.3.2. DIAGNSTICO E INVESTIGACIN DE LA FORMA CLNICA CONGNITA

En el recin nacido, hijo de la gestante chagsica, proceder a examinar
simultneamente la presencia del parsito por las tcnicas de
microconcentracin o PCR y el nivel basal de anticuerpos (IgG) anti
Trypanosoma cruzi por ELISA e IFI (Figura 13).
Antes de los seis meses, no es posible distinguir si los anticuerpos (IgG)
especficos detectados son propios o adquiridos va transplacentaria de la
madre por lo que es de importancia realizar el seguimiento de la evolucin
del ttulo serolgico al tercer mes, a los seis meses y al ao de vida.
Si el examen parasitolgico en el recin nacido resulta negativo, la eleva-
cin o mantenimiento del ttulo de anticuerpos con relacin al nivel basal
certificara la infeccin, y, por el contrario, si este disminuye la descartara.
Por otro lado, si el examen parasitolgico en el recin nacido resulta posi-
tivo, el ttulo de anticuerpos permitir monitorizar el tratamiento.
La deteccin de anticuerpos IgM como respuesta de infeccin temprana
tiene baja sensibilidad.

GESTANTE
CHAGSICA
RECIN NACIDO
Bsqueda del parsito Basal de Ac IgG
+
MICROCONCENTRACIN ELISA e IFI
PCR
- Titulacin de suero
+
DIAGNSTICO
CONFIRMADO Control serolgico a
(Tratamiento) los 3, 6 y 9 meses
ELISA e IFI
Titulacin de suero
IgG < Basal

NO CONFIRMA
Resultado
EL CASO
IgG > Basal
DIAGNSTICO
CONFIRMADO
(Tratamiento)
Figura 13. Se considera gestante chagsica cuando presenta serologa reactiva en dos tcnicas
de principios diferente o cuando es positiva a alguna de las tcnicas que demuestren la presencia
del parsito.

CAPTULO III
OBTENCIN DE MUESTRA SANGUNEA

En el diagnstico de la enfermedad de Chagas, empleamos:
Sangre capilar para el examen directo en fresco, gota gruesa, frotis y
microconcentracin.
Sangre venosa total para el examen por concentracin de Strout y el
hemocultivo (aislamiento e identificacin del parsito).
Suero sanguneo para deteccin por HAI, ELISA, IFI.
Antes de iniciar el procedimiento de obtencin de la muestra de sangre:
a) Completar el formato de solicitud de diagnstico de laboratorio (anexo
5).
b) Colocar sobre la mesa de trabajo el material necesario para obtener la
muestra.
c) Lavarse las manos y colocarse los guantes.
d) Rotular el tubo donde se colectar la muestra con los siguientes da-
tos: nombre, cdigo y la fecha de obtencin de la muestra.
3.1. OBTENCIN DE SANGRE CAPILAR

3.1.1. Materiales
Guantes.
Algodn.
Alcohol.
Lancetas estriles descartables.
Lminas portaobjetos (examen en fresco, gota gruesa, frotis).
Laminillas cubreobjetos.
Capilares heparinizados (microconcetracin).
Plastilina.
Depsito para descarte de lancetas.
Leja al 3-5%.
Plumn indeleble.

3.1.2. Procedimiento
a) Sostener la mano izquierda del paciente con la palma hacia abajo y
seleccionar el dedo medio, hacer que el paciente extienda y flexione
los dems (en nios pequeos usar el dedo pulgar del pie o taln).
b) Limpiar el dedo con una torunda de algodn ligeramente humedecida en
alcohol para desinfectar, retirar la suciedad y la grasa de la yema del dedo.
c) Pinchar directamente la yema del dedo con una lanceta estril. Hacer-
lo con un movimiento rpido.
d) Desechar la primera gota de sangre, limpiando el dedo con una torun-

da seca de algodn.
e) Colectar gotas de sangre para la gota gruesa, frotis y examen en fres-
co en lminas portaobjetos.
f) Colecta en tubos capilares heparinizados para microconcentracin:
acercar el capilar al lugar de la puntura en posicin horizontal y dejar
que la sangre ingrese por capilaridad y llene el tubo. Sellar con plastilina
uno de los extremos del capilar y mantenerlo en posicin vertical hasta
su procesamiento, que deber ser inmediantamente o dentro de las
tres horas posteriores para asegurar el rendimiento de la prueba. Ob-
tener la muestra de sangre en tres o cuatro capilares heparinizados.
Para rotular los capilares se recomienda sujetarlos con cinta adhesiva
a una lmina portaobjeto o cartn, que servir como soporte y brindar
espacio para anotar el nombre, procedencia y fecha.
3.2. OBTENCIN DE SANGRE VENOSA

La muestra sangunea se puede obtener mediante el empleo de jeringa
descartable o tubos al vaco. Se recomienda su uso de vacutainers para
conservar la esterilidad de la muestra y por medidas de seguridad.

3.2.1. Materiales
Jeringas y agujas descartables 21 1/2 G
Tubos de ensayo o tubos al vaco sin anticoagulante (serologa).
Tubos de ensayo o tubos al vaco con /EDTA (hemocultivo).
Ligadura de jebe 2,5 mm de dimetro.
Algodn.
Alcohol.
Guantes.
Leja al 3-5%.
Depsito de metal o vidrio para descarte de agujas y jeringas.
Plumn indeleble.
a) Solicitar al paciente que se siente y coloque el brazo sobre la mesa de
trabajo, con la palma de la mano hacia arriba.
b) Colocar la ligadura dos dedos por encima de la flexin del codo, ajustar-
la lo suficiente para aminorar la corriente sangunea y dilatar las venas,
sin apretarla tanto, de modo que reduzca el paso de sangre por las
arterias.
c) Pedir al paciente que abra y cierre la mano varias veces, para favorecer
la dilatacin de las venas.
d) Con el dedo ndice de la mano izquierda palpe la vena en la que intro-
ducir la aguja.
e) Desinfectar la zona de la piel donde se realizar la puncin con un
pedazo de algodn embebido en alcohol.

f) Introducir la aguja insertada en el tubo al vaco en el centro de la vena

(1 a 1,5 cm aproximadamente) y extraiga la sangre.
g) Si usa jeringa: Aplique una porcin seca de algodn sobre la parte
donde se encuentra oculta la punta de la aguja. Retirar la aguja con
movimiento rpido por debajo de la pieza de algodn.
h) Si usa tubo al vaco:Retirar el tubo primero,y luego proceder a sacar la
aguja con movimiento rpido por debajo de la torunda de algodn.
I) Si la muestra no va a ser sembrada inmediatamente despus de la
extraccin, conservarla en refrigeracin (4-8 C). Si no se cuenta con
los materiales y condiciones de esterilidad adecuadas, trasladarla in-
mediatamente al laboratorio de referencia regional de su jurisdiccin
(figura 10).
3.3. OBTENCIN DE SUERO SANGUNEO

Una vez extrada la sangre, ya sea con jeringa descartable o tubo al vaco
sin anticoagulante:
a) Dejarla en posicin vertical aproximadamente 30 minutos a tempera-
tura ambiente para que la sangre coagule.
b) Centrifugar la muestra a 2000-2500 rpm por 15 minutos.
c) Separe el suero y depostelo en un frasco o vial estril con tapa.
d) Rotular el vial con los siguientes datos:
Nombre/Cdigo.
Fecha de obtencin de la muestra.
e) Conservar el suero hasta el momento de uso de la siguiente manera:
En refrigeracin (4-8 C) hasta cinco das.
En congelacin (-20 C) ms de cinco das.
3.4. REGISTRO DE MUESTRAS

Los datos de las fichas de diagnstico deben registrarse en el cuaderno
de laboratorio o base de datos.

CAPTULO IV
EXAMEN DE SANGRE: FRESCO, GOTA GRUESA, FROTIS
4.1. EXAMEN DE SANGRE EN FRESCO

Consiste en examinar directamente con el microscopio una gota de san-
gre de la persona con sospecha de infeccin. Es la prueba ms sencilla,
rpida y econmica que permite demostrar la presencia del parsito en la
forma aguda o congnita de la enfermedad de Chagas.
El rendimiento del examen es bueno,y la prueba es til cuando la
parasitemia es elevada.
4.1.1. Materiales
Guantes.
Lanceta estril.
Algodn.
Alcohol corriente.
Lminas portaobjetos limpias y desengrasadas.
Laminillas cubreobjetos.
Cmara hmeda (Anexo 1).
a) Rotular tres lminas portaobjetos.
b) Obtener la muestra de sangre capilar en lmina, segn 3.1.
c) Colocar una gota de sangre sobre cada lmina portaobjeto rotulada.
d) Cubrir la muestra con una laminilla.
e) Conservar las preparaciones en cmara hmeda hasta su lectura.
4.1.3. Lectura
Observar al microscopio con objetivo de 10X y 40X reduciendo la abertura
del condensador. Buscar formas mviles (trypomastigotes) del parsito. Si

el resultado es negativo repetir el examen interdiario por lo menos durante

una semana.
Algunas veces no se puede observar al parsito, sin embargo el movi-
miento de los glbulos rojos indica su presencia, por lo que se recomien-
da hacer lminas con gota gruesa y frotis en forma simultnea y colorear
con Giemsa para la confirmacin.
4.2. GOTA GRUESA

La gota gruesa consiste en concentrar y defibrinar la gota de sangre de la
muestra, la que posteriormente ser deshemoglobinizada y teida con
Giemsa durante 30 minutos.
Obtener la muestra de acuerdo con lo indicado en 4.1
a) Colocar una gota de sangre sobre la superficie limpia de una lmina
portaobjetos.
b) Empleando la esquina de otra lmina, realizamos movimientos circula-
res, desde el centro de la gota, de modo que la sangre se distribuya
uniformemente (en un rea de 1cm2).
c) Dejar secar a temperatura ambiente.
d) Colorear con Giemsa.
4.2.2. Coloracin Giemsa
4.2.2.1. Materiales
Solucin Giemsa stock (Anexo 1).
Solucin amortiguadora (Anexo 1).
Probeta 10 mL.
Varilla de coloracin.
4.2.2.2. Procedimiento
a) Colocar las lminas sobre la varilla de coloracin.
b) Preparar el volumen necesario de solucin Giemsa diluida, aproxima-
damente 2 mL por lmina.

En la probeta colocar 0,1 mL (2 gotas) de solucin Giemsa stock por

cada mL de solucin amortiguadora.
Homogeneizar la solucin colorante.
c) Cubrir la muestra con la solucin Giemsa diluida, (figura 14).
d) Dejar actuar el colorante durante 30 minutos.
e) Lavar con agua corriente y dejar secar a temperatura ambiente.
Figura 14. La coloracin Giemsa, facilita la identificacin del parsito en base a sus
caractersticas morfolgicas tintoriales.
4.3. FROTIS
El frotis es el extendido de una gota de sangre en una lmina portaobjetos
seguida de la fijacin de la muestra y posterior tincin con Giemsa (Figura 15).
Obtener la muestra de acuerdo con lo descrito en el tem 3.1.
a) Colocar una gota de sangre en el extremo de la superficie de una
lmina portaobjetos limpia.
b) Acercar a la muestra el borde de otra lmina portaobjetos,
posesionndola de tal manera que formen un ngulo de 45 y dejar
que la muestra se distribuya en el borde de la lmina.
c) Conservando el ngulo de 45, deslizar la lmina auxiliar sobre la su-
perficie de la lmina con la muestra. El extendido de sangre o frotis
debe ser una pelcula fina.
d) Dejar secar a temperatura ambiente.

e) Fijar la muestra con metanol absoluto P.A durante un minuto

f) Colorear con Giemsa.
4.4. LECTURA DE LA GOTA GRUESA Y FROTIS

Enfocar con el objetivo de 10X, luego, colocar una gotita de aceite de inmer-
sin sobre la muestra y examinar con el objetivo de inmersin 100X.
Examinar toda la lmina en el microscopio.
Resultado
Informar la presencia o ausencia de formas trypomastigotes de
Trypanosoma cruzi.
Figura 15. Trypomastigote de Trypanosoma cruzi en pre-

paraciones de frotis y gota gruesa de sangre circulante. Se
observa el cinetoplasto posterior al ncleo central, la mem-
brana ondulante y el flagelo.

CAPTULO V
TCNICAS DE CONCENTRACIN
5.1. MICROCONCENTRACIN
La tcnica consiste en concentrar los parsitos de una muestra de sangre
colectada en tubos capilares heparinizados por centrifugacin. Los ele-
mentos de la sangre se separan por gradiente de densidad, concentrn-
dose los glbulos rojos en la parte inferior del capilar, sobre ella se ubica
un anillo blanquecino de 1 mm de altura conformado por los glbulos
blancos y en la parte superior lquida transparente constituida por el plas-
ma. Los tripanosomas presentes en la muestra se ubicarn entre los gl-
bulos blancos y el plasma.
Figura 16. Separacin de los elementos sanguneos por gradiente de densidad.
5.1.1. Equipos y materiales

- Microscopio con objetivos de 10X y 40X.
- Microcentrfuga o centrfuga.
- Tubos capilares heparinizados.
- Lminas portaobjetos.
- Laminillas cubreobjetos.
a) Obtener la sangre en los capilares heparinizados segn tem 3.1.2.
b) Centrifugar la muestra durante un minuto a 5000 rpm.

c) Sujetar el capilar a una lmina portaobjetos con cinta adhesiva (Figura

16) .
d) Conservar el capilar en forma vertical hasta el momento de la lectura.
5.1.3. Lectura
Observar directamente en el microscopio la zona del plasma aproximada-
mente a 10 mm de los glbulos blancos. Focalizar inicialmente con el
objetivo de 10X de aumento y luego buscar las formas trypomastigotes
mviles del parsito con el objetivo de 40X (Figura 17).
Figura 17. Microconcentracin.
Tambin se puede realizar la lectura colocando la muestra entre la lmina

y laminilla, para ello, con el borde de una lmina portaobjetos hacer una
marca en la zona donde se ubican los parsitos y luego quebrar el capilar
con cuidado. Dejar caer la muestra sobre un portaobjetos, cubrirla con una
laminilla y observar el microscopio.
5.1.4. Resultado
Positivo: Se observan formas flageladas mviles de trypomastigotes de
Trypanosoma cruzi.
Negativo: No se observan formas de trypomastigotes de Trypanosoma cruzi.

5.2. CONCENTRACIN DE STROUT

Esta tcnica se basa en la concentracin de los parsitos en la muestra
sangunea por centrifugacin y examen del sedimento al microscopio en
busca de trypomastigotes mviles de Trypanosoma cruzi. Es una tcnica
simple y de buena sensibilidad en casos agudos de enfermedad de Chagas
y en el seguimiento de congnitos.
El suero se debe conservar para ser examinado por tcnicas inmuno-
lgicas.
5.2.1. Equipos y materiales

- Microscopio.
- Centrfuga.
- Jeringa hipodrmicas estril o sistema de tubos al vaco sin
anticoagulante.
- Tubos de ensayo de 13 x 100 mm.
- Tubos de centrfuga.
- Asas microbiolgicas.
a) Extraer 5-10 mL de sangre venosa en un tubo sin anticoagulante, se-
gn tem 3.3.
b) Dejar a temperatura ambiente hasta que se coagule.
c) Separar el suero.
d) Centrifugar este suero a 160g (800 rpm) durante dos minutos para
descartar los glbulos rojos.
e) Centrifugar nuevamente el sobrenadante a 300-600 g (2000-2500 rpm),
durante diez minutos.
f) Separar el sobrenadante (suero) y conservarlo a 4 C para el anlisis
serolgico.

g) Colocar una alcuota del sedimento obtenido en una lmina

portaobjetos.
h) Cubrir la muestra con una laminilla y proceder a la lectura.
5.2.3. Lectura
Observar en el microscopio la presencia de trypomastigotes mviles de
Trypanosoma cruzi, con objetivos de 10X 40X de aumento.
Es aconsejable observar cuidadosamente varias preparaciones en busca
de formas mviles del parsito.

CAPTULO VI
HEMOCULTIVO
Consiste en sembrar una muestra de sangre en medio de cultivo artificial

o celular, con la finalidad de amplificar el nmero de parsitos presentes y
confirmar el diagnstico. Presenta una sensibilidad alta en los casos agu-
dos y congnitos. El cultivo en medio artificial es factible de realizar en
cualquier laboratorio bacteriolgico, no as en medio celular que requiere
de laboratorio mejor equipado.
La limitacin de la prueba est en el prolongado tiempo de incubacin que
se requiere (hasta dos meses) para emitir el informe del resultado.
El cultivo en medio artificial requiere:
6.1. EQUIPO
- Estufa 28 30C.
- Centrfuga.
- Microscopio ptico 10x, 40x, 100x de aumento y ocular 10x.
- Cabina de flujo laminar o cubculo.
- Balanza.
- Refrigerador.
- Micropipeta 5 50 uL, 50 1000 uL.
6.2. MATERIALES Y REACTIVOS (Figura 18)

- Tubos al vaco heparinizados.
- Agujas para tubos al vaco.
- Portaobjetos.
- Cubreobjetos 22 x 22 mm.
- Gradillas para tubos de ensayo.
- Asa de siembra.
- Puntas amarillas y azules estriles.
- Tubos con medio de cultivo agar sangre (Anexo 1).
- Solucin salina estril (Anexo 1).
- Solucin de antibiticos (Anexo 1).

Figura 18. Materiales y reactivos empleados en el hemocultivo.
6.3. MUESTRA. 5 mL de sangre de la vena del brazo obtenido en tubo

heparinizado segn 4.2.
6.4. PROCEDIMIENTO (Figura 19)

Trabajar en condiciones de esterilidad bajo la cabina de flujo laminar o en
un cubculo con luz UV o mechero.
a) Retirar los tubos conteniendo medio de cultivo del refrigerador.
b) Rotularlos con un marcador tinta indeleble la fecha y cdigo de mues-
tra. Cinco tubos por cada muestra.
c) Adicionar la solucin salina estril (0,5 mL) a cada tubo.
d) Sembrar 1 mL de la sangre heparinizada en cada tubo.
e) Colocar los tubos en estufa graduada a 28 C. Agitarlos una vez al da.
f) A los siete das revisar el cultivo. Con el asa de siembra extraer una gota
del cultivo, colocarla entre lmina y laminilla y observar al microscopio
con objetivo de 10 X.

HEMOCULTIVO
SANGRE
OBTENCIN DE
MUESTRA
CONCENTRACIN POR
CENTRIFUGACIN
5 MIL rpm x 15minutos
CULTIVO
EN FRESCO
28 C LECTURA
Observacin al microscopio
7 DA 10 x 40 x
Formas mviles del parsito
15 DA
COLORACIN GIEMSA
Formas tpicas, con citoplasma,
azul claro, ncleo y cinetoplasto
de color azul violeta
SUBCULTIVO
CADA 15 DIAS
28 C LECTURA FINAL
60 DA
EN FRESCO
Observacin al microscopio
10 x 40 x
Formas mviles del parsito
COLORACIN GIEMSA
Formas tpicas, con citoplasma,
azul claro, ncleo y cinetoplasto
de color azul violeta
Figura 19. Pasos para el hemocultivo.

6.5. LECTURA
a) El movimiento caracterstico de los epimastigotes (figuras 20 y 21) per-
mite detectarlos con facilidad, sin embargo, es necesario colorearlos
para confirmar su morfologa.
b) Realizar un extendido con el asa de siembra, luego fijar con metanol
durante tres minutos y colorear con Giemsa.
c) Observar en el microscopio la forma tpica, el ncleo de color azul viole-
ta y el cinetoplasto ms denso y oscuro. Se les visualiza aislados o
agrupados a manera de rosetas.
d) Si no se observan formas mviles continuar la incubacin a 28 C y
repetir la lectura a los siete das.
e) Cada 15 das repicar 0,5 mL de los cultivos negativos en medio fresco.
(resiembra a ciegas).
f) El tiempo que se requiere para demostrar la positividad del cultivo,
depende de la densidad parasitaria de la muestra sembrada y de la
adaptabilidad del parsito al medio. Generalmente esto ocurre des-
pus de uno a dos meses.
g) Antes de realizar la lectura final, centrifugar el sobrenadante del cultivo
y observar en el sedimento, la presencia o ausencia del parsito.
Figura 20. Observacin directa de epimastigotes de Trypanosoma

cruzi en alcuota de cultivo positivo. Se caracterizan por ser de
aspecto fusiforme y presentar movimiento ondulante (1000X).

Figura 16. Epimastigote de Trypanosoma cruzi en medio de cultivo. Giemsa 1000 X.
6.6. RESULTADO
Cultivo positivo: Se observa la presencia de epimastigotes de Trypanosoma
cruzi.
Cultivo negativo: No se observa la presencia de epimastigotes de
Trypanosoma. cruzi.


CAPTULO VII
XENODIAGNSTICO
Es una tcnica que permite la multiplicacin del parsito in vivo y consiste

en hacer picar a la persona sospechosa de infeccin por el vector libre de
infeccin, de preferencia la especie de triatomino de mayor importancia en
la regin.
Es aplicable tanto en la forma clnica aguda como en la crnica portador.
7.1. Equipos
Microscopio con objetivo de 20X de aumento.
7.2. Material biolgico

Ninfas de III o IV estadio de triatominos que proceden de criaderos en
laboratorio.
7.3. Materiales
- Cajas de madera o plstico apropiadas (Figura 22).
- Tul.
- Bandas elsticas.
- Sujetadores de tela.
- Pollos para alimentacin de triatominos.
- Pinzas punta fina.

Figura 22. Caja para xenodiagnstico.
7.4. Procedimiento
a) Colocar en cada caja de cinco a diez ninfas de triatominos del III y IV
estadio, los que deben estar en ayuno por lo menos 15 das.
b) Cubrir la caja con tul, asegurndolo con una banda elstica.
c) Rotular la caja con el nmero de muestra, nombre y fecha de aplicacin.
d) Sujetar la caja sobre el brazo del sospechoso de infeccin mediante
una venda de tela, permitiendo que los triatominos se alimenten por
20 minutos o hasta observar que las ninfas hayan aumentado su volu-
men por la sangre ingerida (Figura 23).
e) Conservar la caja con los triatominos a temperatura del laboratorio
25-30 C y 70% de humedad relativa.
f) Alimentarlos cada 15 das, sujetando las cajas con las ninfas sobre la
piel desnuda de un ave (pollo, paloma u otro).
g) A los 30 das, examinar en el microscopio una muestra de heces de
los triatominos. Obtener la muestra sobre una lmina portaobjetos por
presin del abdomen del insecto con una pinza.
h) Cubrir la muestra con una laminilla para examinarla en el microsco-
pio. Se puede realizar el examen individual de cada triatomino o una
alcuota del pool de las muestras fecales.
i) De ser negativo, examinar otra alcuota del contenido digestivo del
triatomino a los 60 das.

Se aconseja la aplicacin de por lo menos cuatro xenodiagnsticos para

alcanzar su mayor sensibilidad en los casos de infeccin crnica o porta-
dor.
Figura 23. Aplicacin del xenodiagnstico.
7.5. Lectura
Examinar la muestra en el microscopio (objetivo de 20X de aumento), bus-
cando formas mviles: epimastigotes o trypomastigotes metacclicas del
parsito que son identificadas por el movimiento ondulante caracterstico
(Figura 24).
Figura 24.

7.6. Resultado
Xenodiagnstico positivo: Se observan formas trypomastigotes o
epimastigotes de Trypanosoma cruzi.
Xenodiagnstico negativo: No se observan tripanosomas o epimastigotes.
De ser la prueba positiva, se puede realizar el aislamiento del parsito
sembrando la muestra en medios de cultivo o inoculando experimental-
mente en ratones (anexo 2) para posteriores estudios de caracterizacin e
identificacin.

CAPTULO VIII
HEMAGLUTINACIN INDIRECTA (HAI)
La hemaglutinacin indirecta emplea glbulos rojos de carnero, previa-

mente tratados con cido tnico, como soporte de extractos solubles del
parsito (antgeno). Es una prueba altamente sensible y especfica. En la
figura 17 se muestra un diagrama de la prueba.
Los kits comerciales simplifican la ejecucin de la tcnica, proporcionan-
do el antgeno absorbido a los glbulos rojos.
8.1. MATERIALES Y REACTIVOS

Placas de poliestireno con fondo en U.
Micropipeta de 5 a 50 L.
Micropipeta multicanal de 5 a 50 .
Puntas para micropipeta.
Solucin Alsever (Anexo 1).
Sangre de carnero.
Suero fisiolgico (Anexo 1).
Buffer fosfato salino pH 7,2 (Anexo 1).
cido tnico (Anexo 1).
Solucin diluyente (Anexo 1).
Suero control positivo a Trypanosoma cruzi.
Suero control negativo a Trypanosoma cruzi.
Antgeno de Trypanosoma cruzi (Anexo 3).
8.2. MUESTRA: Suero problema.

8.3. SUSPENSIN DE GLBULOS ROJOS

a) Obtener sangre estril de carnero mediante puncin de la vena yugular
en un recipiente tambin estril que contiene igual volumen de Alsever.
b) Lavar los glbulos rojos por tres veces con suero fisiolgico,
centrifugando a 3000 rpm durante diez minutos.
c) Preparar una suspensin de glbulos rojos al 2,8% buffer fosfato pH
7,2. Ej: para preparar 5 mL de suspensin de glbulos rojos, tomar
0,14 mL del sedimento de glbulos rojos y resuspenderlo en 4,86 mL
de buffer fosfato pH 7,2.
8.4. ADSORCIN DE ANTICUERPOS HETERFILOS

a) A 0,1 mL de suspensin de glbulos rojos, adicionar 0,5 mL del suero
problema.
b) Incubar 30 minutos a 37 C (bao Mara).
c) Mantener durante dos horas a 4C.
d) Centrifugar por diez minutos a 2000 rpm Separar el suero absorbido
de los glbulos rojos.
8.5. TANIZACIN DE LOS GLBULOS ROJOS

a) Mezclar 5 mL de suspensin de glbulos rojos con 5 mL de cido
tnico diluido 1/20 000 e incubar por 10 minutos a 37 C.
b) Centrifugar durante siete minutos a 2000 rpm.
c) Descartar el sobrenadante.
d) Resuspender el sedimento en 10 mL de buffer fosfato pH 7,2.
e) Centrifugar durante siete minutos a 2000 rpm.
f) Descartar el sobrenadante.
g) Resuspender el sedimiento en 5 mL de solucin salina.
8.6. SENSIBILIZACIN
a) Tubo N. 1: Colocar 5 mL de Antgeno (diluido 1/20 en buffer fosfato pH
6,4). Adicionar 5 mL de suspensin de glbulos rojos tanados. Tubo
N. 2 (Control): Colocar 5 mL de buffer pH 6,4. Adicionar 5 mL de sus-
pensin de glbulos rojos tanados.

b) Incubar los tubos durante 20 minutos a 37 C.

c) Centrifugar por siete minutos a 2000 rpm.
d) Eliminar el sobrenadante.
e) Lavar el sedimento con 10 mL de solucin diluyente.
f) Centrifugar por siete minutos a 2000 rpm.
g) Descartar el sobrenadante.
h) Resuspender el sedimento en 5 mL de solucin diluyente.
HEMAGLUTINACIN INDIRECTA
TANIZACIN
CIDO
+ TNICO
HEMATES
HEMATES
TANADOS
SENSIBILIZACIN
HEMATES ANTGENO DE HEMATES

TANADOS T. cruzi SENSIBILIZADOS
DESAROLLO DE LA PRUEBA
HEMATES ANTICUERPOS
SENSIBILIZADOS ESPECFICOS
HEMAGLUTINACIN
Figura 25

8.7. PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA

a) Rotular una placa de microtitulacin para realizar diluciones de los
sueros a evaluar al doble, incluyendo los sueros controles positivo y
negativo. Iniciar en la dilucin hasta 1/512. Seguir el esquema ad-
junto (Figura 26).
b) Se recomienda colocar la placa de microtitulacin sobre un papel,
toalla o franela humedecida para prevenir el efecto de la electricidad
esttica.
c) Colocar en los pozos de la fila A, 75 uL de la solucin diluyente y 50 uL
en los pozos de las filas B, C, D, E, F, G y H.
d) Agregar a cada pozo de la fila A, 25 uL del suero a evaluar, homogenei-
zar aspirando y expeliendo varias veces con la pipeta.
e) Luego realizar diluciones sucesivas al doble. Con la ayuda de una
micropipeta multicanal tomar 50 uL de la dilucin de cada suero por
evaluar y verterlo en los pozos de la fila siguiente, homogeneizar y repetir
igual con la siguiente fila.
f) Agregar 50 uL de la suspensin antignica en cada pocillo.
g) Agitar con suaves golpes en los bordes de la placa.
h) Dejar la placa en reposo sobre una superficie plana.
i) Realizar la lectura despus de una hora y a las 24 horas.
Cuando se evalan muchos sueros (Figura 27) es apropiado, primero,
realizar el tamizaje con la dilucin de valor diagnstico (). De esta mane-
ra, seleccionar los positivos y, en un segundo ensayo, proceder a titularlos
realizando las diluciones correspondientes.
8.8. LECTURA (Figuras 26 y 27).

La falta de reactividad (negativo), se manifiesta por la sedimentacin del
antgeno en forma de botn.
La reactividad del suero (positivo), se manifiesta por la formacin de una
malla de bordes irregulares que cubre al 50-100% del fondo del pocillo.
Se considera positiva la muestra a partir de la dilucin y se informa con
el ttulo de la ltima dilucin positiva.

8.9. RESULTADO
Reactiva: Se detecta la presencia de anticuerpos contra Trypanosoma
cruzi. Ttulo: segn lectura.
No reactiva: Ausencia de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi.
DILUSIN DEL SUERO
Figura 26

Tamizaje de sueros en la dilucin de valor diagnstico 1/4
CP: SUERO CONTROL POSITIVO A T. cruzi

CN: SUERO CONTROL NEGATIVO A T. cruzi
CGR: CONTROL DE GLBULOS ROJOS
En esta placa los pozos D4, G12 y H12 corresponden a sueros reactivos (positivos)
Figura 27

CAPTULO IX
ELISA
La tcnica ELISA emplea antgenos solubles de Tripanosoma cruzi, adhe-

ridos a soportes inertes (placa de microtitulacin) y antiglobulinas huma-
nas conjugadas con enzimas, como detectores de la reaccin antgeno-
anticuerpo (Figura 28).
Es un mtodo de gran sensibilidad, pero cuya especialidad est sujeta a la
calidad de los antgenos y reactivos empleados por lo que exigen una
rigurosa estandarizacin.
Los kits comerciales contienen las placas con antgeno y reactivos.
La reaccin suele hacerse positiva despus de 20 das de infeccin.
9.1. EQUIPOS E INSTRUMENTOS

Estufa de incubacin 37 C.
Reloj.
Balanza de precisin.
Refrigeradora.
Lector ELISA.
Lavador de placas ELISA.
Micropipeta de 0,5 a 10 L y 10 a 100 L.
Micropipeta multicanal de 50-200 L.
Potencimetro.

Placas con fondo plano, sensibilizadas con antgeno de Trypanosoma
cruzi (ver anexo 3).
Antigammaglobulina G humana conjugada con peroxidasa (titulado).
Suero control interno.
Perxido de hidrgeno 30%.
Buffer fosfato salino (PBS) pH 7,2 (Anexo 1).
Buffer de lavado. PBS pH 7,2 - Tween 20 al 0,05% (Anexo 1).

Solucin de bloqueo (PBS pH 7,2 - BSA 3%) (Anexo 1).

Solucin diluyente (PBS pH 7,2 - BSA 1%) (Anexo 1).
Solucin estabilizadora para el sustrato.
Cromgeno: Orto-phenilendiamina (OPD).
cido sulfrico 2,5 M.
ELISA
MTODO INDIRECTO PARA LA DETECCIN Y MEDICIN DE ANTICUERPOS
ANTI Trypanosoma cruzi
Figura 28

9.3. PROCEDIMIENTO (Figura 28).

9.3.1. Retirar del refrigerador la placa sensibilizada con el antgeno y dejar
que tome la temperatura ambiente.
Lavar los pozos adicionando a cada uno de ellos 300 L de PBS -
Tween 0,05%. Repetir el lavado por tres veces.
En el ltimo lavado eliminar por completo el lquido residual, invir-
tiendo la placa sobre papel absorbente (aplicar golpes firmes).
9.3.2. Bloqueo de sitios inespecficos mediante la adicin de 100 L de
PBS - BSA 3% en cada pozo.
Dejar una hora a temperatura ambiente.
Lavar al igual que en 9.3.1.
9.3.3. Incubacin de los sueros:
Rotular la placa de acuerdo con el esquema de distribucin de sue-
ro (Figura 29). Se aconseja realizar duplicados.
Incluir en cada ensayo dos controles positivos y tres controles ne-
gativos, un control interno y un blanco de reactivos.
Colocar 100 L por pocillo, de las diluciones de los sueros (1/100).
Mezclar aplicando suaves golpes en las paredes laterales de la placa.
Incubar 30 minutos en estufa a 37 C, con la placa tapada para evitar
la evaporacin.
Retirar el lquido de los pozos con la ayuda de una micropipeta y
descartar dicho lquido en un recipiente que contenga hipoclorito de
sodio al 5%.
Lavar los pozos al igual que en el punto 9.3.1.
9.3.4. Incubacin del conjugado:
Colocar 100 L por pozo del conjugado preparado de acuerdo con
el ttulo obtenido previamente.
Incubar 30 minutos en estufa a 37 C.
Lavar al igual que en 9.3.1.
9.3.5. Reaccin con el sustrato:
Preparar minutos antes de su uso la solucin del sustrato ms
cromgeno (OPD) ver anexo.
Colocar 100 L en cada pozo.
Dejar en oscuridad y a temperatura ambiente durante 15 minutos.
Detener la reaccin adicionando 100 L de cido sulfrico 2,5 M, por
pozo.

9.4. REACTIVOS COMERCIALES (KITS)

En caso de usar kits, seguir estrictamente las instrucciones del inserto
contenido en la caja tanto en el procesamiento, como para determinar la
validez del ensayo y calcular el valor de corte.
9.5. LECTURA
Para que el examen tenga validez, los controles positivo, negativo y control
interno deben reaccionar como tales, es decir que la absorbancia de cada
uno de ellos corresponda al valor predeterminado.
9.5.1. Con lector de ELISA

La presencia o ausencia de anticuerpos anti Tripanosoma cruzi se determina,
relacionando la absorbancia de la muestra a 450 nm respecto al valor del corte.
Se ha definido el valor del corte (VC) como el punto de cruce entre el prome-
dio de las lecturas de los sueros controles no reactivos y reactivos ms
dos desviaciones estndar (DS).
VC = CN + 2 DS
El valor de corte promedio encontrado en nuestro laboratorio es de 0,320
Reactivo: Muestras con absorbancias mayores de 0,384.
No reactivo: Muestras con absorbancias menores de 0,256.
Indeterminado: Se consideran as aquellas cuyas absorbancias caen
entre 20% del valor de corte. Estas muestras deben ser ensayadas
nuevamente, si el resultado persiste solicitar una nueva muestra luego de
un mes, tiempo suficiente para que el nivel de anticuerpos sea mayor en
caso de tratarse de una infeccin reciente.
9.5.2. Lectura visual: Si se opta por este mtodo de interpretacin debe

considerarse:
Reactiva: Muestra con coloracin netamente amarillo-naranja.
Colores tenues mayores que el del control negativo, requieren la interpre-
tacin instrumental.
No reactiva: Toda muestra que no presente coloracin o que sta sea
igual que la de los controles negativos.
9.5.3. Titulacin
Para obtener el ttulo de las muestras reactivas en el tamizaje, se realiza dilucio-
nes dobles de los sueros a partir de 1/100 y se procede de acuerdo con el
punto 9.3.

9.6. INFORME E INTERPRETACIN DE RESULTADOS

Reactivo: Se detecta anticuerpos (lgG) anti Trypanosoma cruzi. Ttulo: el
ttulo de la muestra es la dilucin del suero en la que la absorbancia
resulta mayor o igual que el valor de corte.
No reactivo: No se detecta anticuerpos (lgG) anti Trypanosoma cruzi.
Figura 29


CAPTULO X
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)
La tcnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI), emplea como antgeno

epimastigotes de Trypanosoma, obtenidos de cultivo y fijados en lminas
sobre las que se realiza la reaccin antgeno-anticuerpo. La formacin de
este complejo es evidenciada por una antiglobulina humana marcada con
fluorescena (Figura 30).
Los kits comerciales proporcionan la lmina preparada y los reactivos.
Prueba altamente sensible y especfica.
10.1. EQUIPO
Microscopio para fluorescencia.
Estufa graduada a 37 C.
Balanza de presicin.
Potencimetro.
Reloj.
Refrigerador.
Secadora o ventilador.

Placas para microtitulacin, fondo en U.
Couplin o recipientes para lavado de lminas.
Puntas de 10-100 L y de 0,5-10 L.
Pizetas.
Papel, toalla o secante.
Laminillas cubreobjetos de 24 x 48 mm.
Cmara hmeda.

Solucin de azul de Evans.

Lminas IFI impregnadas con Trypanosomas (Anexo 3).
Conjugado Anti lgG humana - FITC, titulado (Anexo 1).
Glicerina tamponada pH 8,5 (Anexo1).
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
PRIMERA ETAPA
ANTGENO DE ANTICUERPO COMPLEJO Ag-Ac

TRYPANOSOMA
SEGUNDA ETAPA
COMPLEJO Ag-Ac ANTIGLOBULINA COMPLEJO Ag-Ac

MARCADA CON MARCADO
FLUORESCEINA
Figura 30

10.3. PROCEDIMIENTO
Elaborar el protocolo de trabajo en el fomato del anexo 9, asignar un casi-
llero para cada suero por evaluar y anotar en l su cdigo.
En cada corrida se debe incluir el control positivo (CP), control negativo

(CN), control interno para IFI (CI) y control de reactivos o blanco (B).
a) Retirar del congelador las lminas IFI fijadas con Trypanosomas y de-
jarlas secar a temperatura ambiente o con la ayuda de un ventilador o
secador.
b) En una placa para microtitulacin, realizar la dilucin 1/32 de cada sue-
ro y de los controles. Para ello, dispensar en cada pozo 155 L de buffer
diluyente y 5 L de cada suero por evaluar.
c) Homogeneizar el suero diluido absorbiendo y expeliendo con la
micropipeta varias veces, luego siguiendo el protocolo elaborado, dis-
pensar 15 uL de la dilucin 1/32 de cada suero sobre el rea del crculo
correspondiente en la lmina IFI.
d) Colocar la lmina en una cmara hmeda y llevarla a incubar a la estu-
fa 37 C durante 30 minutos.
e) Retirar la lmina de la estufa y lavarla por tres veces consecutivas con
PBS-Tween 80 al 1% de la siguiente manera: la primera vez con la
ayuda de una pizeta retirar los sueros de la lmina, la segunda y tercera
vez en un frasco Coplin mantenido en agitacin suave durante ocho
minutos cada vez.
f) Colocar la lmina sobre papel secante y dejar secar a temperatura
ambiente o con la ayuda de un ventilador o secador.

g) Agregar 15 uL del conjugado Anti IgG humano marcado con fluorescena

(titulado), en cada rea circular e incubar a 37 C por 30 minutos.
h) Retirar la lmina de la estufa y lavar al igual que en el tem e, despus
del ltimo lavado, enjuagar con agua destilada y dejar secar al igual
que en el tem f.
i) Agregar 15 uL de la solucin diluida de azul de Evans en cada pocillo y
dejar durante cinco minutos a temperatura ambiente.
j) Enjuagar la lmina con agua destilada, empleando una pizeta. Luego,
dejarla secar a temperatura ambiente.
k) Colocar una gotita de glicerina tamponada y sobre ella una laminilla
cubreobjetos
l) Conservar la lmina en oscuridad hasta la lectura, se recomienda que
sea el mismo da del procesamiento para evitar la prdida de fluores-
cencia.
10.4. LECTURA
La lectura se realiza en microscopio para fluorescencia, con objetivo de
20X.
Primero revisar los controles, en el control positivo debe observarse la
superficie y el flagelo de los parsitos de un color verde manzana fluores-
cente. (Figura 31) y en el control negativo al igual que en el blanco de
reactivos, debe observarse el parsito de color rojizo opaco, sin fluores-
cencia.
Si los controles responden como tales, la corrida es vlida y se continua
con la lectura de las muestras examinadas
De acuerdo con la intensidad o ausencia de fluorescencia que muestran
los trypanosomas se registran las lecturas como:
REACTIVO (+). Cuando la superficie o los bordes de los parsitos fluorescen
francamente de un color verde manzana.
NO REACTIVO (-). Si los parsitos se observan opacos entre rojizos y ma-
rrones oscuros
INDETERMINADO (I), se observa una dbil fluorescencia no homognea en
los parsitos.

Figura 31: Epimastigotes de T. cruzi en la prueba de Inmunofluorescencia

Indirecta. a) Suero Reactivo, b) Suero No reactivo
10.5. INFORME E INTERPRETACIN DE DE RESULTADOS

El ttulo de valor diagnstico en el laboratorio es 1/32
REACTIVO: Se detectan anticuerpos IgG anti Trypanosoma cruzi.
NO REACTIVO: No se detectan anticuerpos IgG anti Trypanosoma cruzi.
INDETERMINADO: No concluyente. Es necesario repetir el ensayo y de per-
sistir el resultado se debe evaluar una nueva muestra, obtenida tres sema-
nas despus de la primera, tiempo necesario para que el nivel de
anticuerpos sea mayor y detectable en caso la infeccin sea reciente.
10.7. TITULACIN DE SUERO REACTIVO

Realizar la titulacin del suero reactivo 1/32, de acuerdo con el esquema
siguiente.
DILUCION 1 2 3 4 5 6
SUERO 1/32
S6 1/64 1/128 1/256 1/512 1/
1024
S6 CN B CI CP
7 8 9 10 11 12
CP: SUERO CONTROL POSITIVO A T. cruzi CI: SUERO CONTROL INTERNO
CN: SUERO CONTROL NEGATIVO A T. cruzi B: BLANCO (control de reactivos)

Efectuar el procedimiento de la tcnica IFI evaluando cada suero en dilu-

ciones seriadas al doble a partir de 1/32
Se considera el ttulo a la mayor dilucin que presente franca fluorescencia
en la superficie del parsito.
10.8. INVESTIGACIN DE ANTICUERPOS IgM

Para investigar la presencia de anticuerpos IgM anti T. cruzi, se seguir el
procedimiento descrito en 9.3, 9.4 y 9.5, seguir los mismos pasos, la dife-
rencia est en el uso, en este caso, de conjugado anti IgM humano.

CAPITULO XI
CONTROL DE CALIDAD
La evaluacin de la calidad del diagnstico de laboratorio o proceso de

aplicacin de medidas de control de calidad interno y externo, permiten
determinar la fiabilidad de los resultados que emite el laboratorio.
CONTROL DE CALIDAD INTERNO

El objetivo del control de calidad interno es asegurar que los procesos se
ejecutan correctamente, desde que la muestra ingresa al laboratorio hasta
la emisin de los resultados y que los equipos e instrumentos usados
tengan ptimo desempeo.
Una de las actividades del control de calidad interno en el diagnstico
serolgico de la enfermedad de Chagas, consiste en la inclusin de un
Suero Control Interno (CI), en el trabajo diario, adems de los habituales
controles positivos y negativos.
El CI es un suero caracterizado como reactivo dbil a la deteccin de
anticuerpos (IgG), anti Trypanosoma cruzi, con ttulo conocido y cercano al
valor de corte, es especfico para cada tcnica o kit y debe ser tratado al
igual que las dems muestras por examinar. Permite monitorizar la cali-
dad del procedimiento ya que su resultado refleja objetivamente las varia-
ciones ocurridas en cada ensayo y facilita la toma de decisin oportuna
para corregir fallas o errores.
Las lecturas diarias de absorbancia del CI se anotan en la grfica de Levey
Jennings y se analizan e interpretan de acuerdo con las reglas de Shewart (9).
(Figura 32).
Cuando la lectura de absorbancia del suero control interno cae fuera de los
lmites permitidos (+/- 2 desviaciones estandar), se debe repetir el ensayo
y si se reitera el resultado se proceder al anlisis para detectar las posi-
bles causas de error.
Recomendaciones generales
Las muestras de suero por procesar no deben presentar hemlisis ni
contaminacin (turbidez). Deben estar rotuladas con el cdigo y fecha
de obtencin de muestra y ser conservadas en refrigeracin (4-8 C),
hasta su procesamiento.

Valores de Absorbancia / Valor de Corte DO/VC
+ 3 ds
+ 2 ds
0,3 x
- 2 ds
- 3 ds
Ensayos
1 4 8 12 16 20
Figura 32. Grfico de Levey y Jennings.

X : media
ds: desviacin estndar
No usar reactivos o kits con fechas vencidas.

Emplear equipos e instrumentos en ptimas condiciones, con mante-
nimiento y calibracin (balanza, potencimetro, lector ELISA, lavador de
placas, microscopio para inmunofluorescencia, micropipetas).
Seguir los instructivos de uso de cada equipo. Tener en cuenta la rutina
bsica de mantenimiento requerido por cada equipo (8). Chequear los
filtros del lector ELISA antes de iniciar los ensayos y llevar el registro de
tiempo de uso de la lmpara del microscopio para inmunofluorescencia.
Realizar el control diario de la temperatura ambiente del laboratorio y
de los siguientes equipos: refrigerador donde se conservan los kits,
estufa empleada para los pasos de incubacin 37 C y congeladora
donde se conservan los sueros controles y otros reactivos.
En el procesamiento de las muestras se debe seguir estrictamente las
instrucciones descritas en el manual de procedimientos o en los inser-
tos proporcionados por el fabricante de reactivos comerciales (kits), en
uso.
Incluir en cada ensayo el CI adems de los controles positivo, negativo,
y blanco de reactivos propio de cada tcnica.

Analizar la validez del ensayo considerando los parmetros estableci-

dos en el kit y el resultado del control interno.
CONTROL DE CALIDAD EXTERNO O EVALUACIN EXTERNA DEL

DESEMPEO
La participacin en programas de evaluacin externa, permite evaluar el
desempeo del laboratorio, esta actividad la desarrolla el Laboratorio de
Referencia Nacional del Instituto Nacional de Salud mediante un panel de
sueros caracterizados, remitidos a los laboratorios de la red nacional anual-
mente.
A su vez, el Laboratorio de Referencia Nacional del INS, participa en progra-
mas de evaluacin externa internacional.
CONTROL DE CALIDAD INDIRECTO

Para fines de control indirecto del diagnstico parasitolgico y serolgico
de la enfermedad de Chagas, los laboratorios de referencia regionales,
envian al Laboratorio de Referencia Nacional, todas las lminas positivas
y sueros reactivos examinados durante el trimestre y 10% de las lminas
negativas y sueros no reactivos, seleccionados aleatoriamente. Es indis-
pensable adjuntar el formato de solicitud de control de diagnstico (Anexo
N 6), con los datos y resultados de las muestras y reactivos empleados.


CAPTULO XII
BIOSEGURIDAD
Las medidas de bioseguridad son indispensables para proteger la salud

y seguridad del personal que trabaja en laboratorios donde se manipulan
productos biolgicos.
Sangre, suero sanguneo, biopsias y material fecal de triatominos, son
productos biolgicos que se procesan en las pruebas de diagnstico
parasitolgico e inmunolgico de la enfermedad de Chagas.
Los laboratorios que procesan las muestras mencionadas, son de nivel
de bioseguridad 2, es decir, se trata de laboratorios que cuentan con c-
maras de bioseguridad y otros dispositivos para la proteccin personal.
12.1. DEL PERSONAL DE LABORATORIO

Toda persona que manipula sangre o sus derivados, debe estar vacunada
contra el virus de la hepatitis B.
Al momento de extraer la sangre:
Vestir mandil, usar guantes, jeringas y agujas descartables o tubos al
vaco. Nunca extraer sangre solamente con la aguja.
El cabello largo debe conservarse sujetado o usar gorro.
No usar brazaletes ni collares.
El personal que va a manipular al parsito ya sea cultivo, material fecal de
triatominos infectados o sangre de individuos infectados, debe:
Inicialmente trabajar bajo supervisin cercana.
Conocer aspectos biolgicos del parsitos.
Someterse a evaluacin serolgica por lo menos una ves al ao.
Practicar las normas de bioseguridad y conocer el procedimiento que
se debe seguir en caso de accidente.

12.2. DEL AMBIENTE DEL LABORATORIO

a) Las paredes deben ser lisas, preferiblemente enchapadas con may-
lica y los pisos de marmolina o cemento. Esto facilitar la limpieza con
soluciones desinfectantes.
b) Los pisos deben limpiarse todos los das con soluciones desinfectan-
tes (pinesol, cresol, etc.). No se debe barrer en seco ni encerar.
c) Al sistema de desague, slo se debe eliminar los agentes biolgicos
o qumicos, previamente descontaminados, neutralizados o
inactivados.
d) El ambiente debe estar adecuadamente ventilado e iluminado y los
servicios de agua, luz y gas deben funcionar satisfactoriamente.
e) Las mesas de trabajo deben estar confeccionadas de material slido,
con superficies lisas, impermeables de fcil limpieza resistentes a las
sustancias corrosivas.
Uso de cabinas de seguridad: Clase I y II:

Cabina clase I: Son de frente abierto, presin negativa y con filtros
HEPA (alta eficiencia en filtrado de partculas). Se puede usar con ven-
tanas a medio abrir.
Cabina clase II: Son de flujo laminar vertical, similar a la anterior, pero
con aire filtrado por HEPA circulando.
12.3. MANIPULACIN Y ELIMINACIN DE SANGRE Y SUS PRODUCTOS

a) La extraccin, centrifugacin y separacin de suero debe hacerse usan-
do guantes.
b) Las agujas usadas no deben devolverse al capuchn de plstico. An-
tes de ser eliminadas colocarlas junto con las jeringas usadas en un
recipiente que resista la esterilizacin en autoclave o hervido.
c) El operador es el responsable de desinfectar el rea de trabajo antes
y despus de su uso con fenol al 5%, cresol al 3% u otro desinfectante,
dejndolos actuar durante 30 minutos.
d) El cogulo y suero innecesarios deben eliminarse en un recipiente
con leja.
e) Los tubos de prueba, pipetas y lminas de microscopio pueden
descontaminarse sumergindolas en mezcla sulfocrmica o leja an-
tes de lavarlas.

12.4. EN CASO DE ACCIDENTES

La forma celular infectante de Trypanosoma cruzi al hombre es el
trypomastigote, ste se encuentra en la sangre de los pacientes
chagsicos y de animales infectados experimentalmente en el laboratorio,
en las heces de los triatominos y en cultivos de parsitos. El personal que
trabaja con estos materiales est expuesto a infecciones accidentales.
Los mecanismos son variables, entre ellos tenemos la autoinoculacin
con agujas, ingesta de aerosoles o gotitas en mucosas, ojos o piel.
12.4.1. Inoculacin accidental, cortes o abrasiones, quemaduras

pequeas
La persona accidentada debe lavarse la zona afectada con jabn, al-
cohol o desinfectante.
Informar el accidente al jefe inmediato y concurrir al servicio mdico
ms cercano.
Solicitar el examen de una muestra de sangre (microconcentracin) en
busca de parsitos a partir del quinto da de producido el accidente.
En caso de resultar negativo solicitar el examen de nuevas muestras
de sangre cada semana durante dos meses, asmismo la evaluacin
serolgica para la deteccin o el seguimiento del nivel de anticuerpos
contra Trypanosoma cruzi.
Si la probabilidad de adquirir la infeccin es alta, el accidentado debe
recibir tratamiento preventivo inmediato con Nifurtimox o Benznidazol.
12.4.2. Ingestin de material peligroso

Acudir al servicio mdico ms cercano para el tratamiento adecuado.
12.4.3. Contacto con material infectado con virus de la hepatitis B o virus

del VIH (sangre, suero, fluidos corporales)
a) Se debe lavar la zona afectada con agua y jabn. En caso de herida,
favorecer el sangrado de la lesin y, si es necesario, cubrir la herida
con un apsito.
b) Se concurrir al servicio mdico ms cercano para determinar la grave-
dad del caso e informar del accidente a las autoridades competentes.
c) Se tomar una muestra de suero del accidentado para descarte de
infeccin de hepatitis B y VIH. Tambin debe examinarse la muestra
del paciente, posible contaminante.

d) Si la muestra es negativa para VIH, este examen debe repetirse men-

sualmente hasta el sexto mes. La continuidad negativa de la muestra
indica que el trabajador no se ha contaminado.
12.5. DESINFECCIN, LIMPIEZA Y ESTERILIZACIN
12.5.1. Desinfeccin
a) Los procedimientos para eliminar elementos causantes de infeccio-
nes virales, bacterianas, micticas y parasitarias, dependern de la
naturaleza del agente presente en el material de vidrio u otro.
b) Los ms comunes son: agentes qumicos en estado lquido (mezcla
sulfocrmica, leja, etc.) y los agentes fsicos como el calor, hervido,
autoclave, irradiacin ultravioleta, etc.
12.5.2 Lavado
Despus de la eliminacin de los agentes infecciosos (desinfeccin), el
material de vidrio sucio debe ser lavado, recomendndose el uso de
detergentes.
12.5.3.a Autoclave (vapor saturado a presin)

Permite controlar la temperatura (121 C) y la presin (15 atmsferas). Se
usa para soluciones, material de goma, plstico, vidrio o metal. Material de
vidrio con medio de cultivo. Se puede emplear tambin una olla a presin
provista de una rejilla.
12.5.3.b Horno (calor seco)

Suele ser elctrico y permite el control de la temperatura (180-200 C) Por
este sistema no puede esterilizarse papel, material plstico, de goma,
etc.).
12.5.3.c Agentes fsicos

Para reactivos biolgicos degradables por calor seco o hmedo, se em-
plean membranas de filtracin (0,22 m).

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ANEXO 1
PREPARACIN DE REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO
1. COLORACIN GIEMSA
1.1. Solucin Giemsa stock

Colorante Giemsa en polvo, certificado ................................... 0,75 g
Metanol puro (sin acetona) ........................................................ 65,00 mL
Glicerina pura ............................................................................. 35,00 mL
En un frasco mbar que contiene perlas de vidrio, mezclar los reactivos
agitndolos vigorosamente varias veces al da. Generalmente el colorante
est listo al tercer da cuando, en el ensayo de tincin, los parsitos mues-
tran los colores apropiados. Filtrar la solucin Giemsa stock con papel de
filtro y conservarla en frasco oscuro a temperatura ambiente.
1.2. Solucin diluyente (agua amortiguada)

Fosfato disdico anhidro (Na2HPO4) ........................................ 4,0 g
Fosfato monopotsico (KH2PO4) ............................................... 5,0 g
Mezclar las sales a homogeneidad.
Diluir un gramo de la mezcla de sales en un litro de agua destilada, agua
de lluvia o de cao. El rango de pH apropiado oscila entre 6,6 y 7,2.
1.3. Solucin Giemsa diluida

Preparar el volumen necesario en una probeta.
Colorante Giemsa stock ............................................................ 0,10 mL
Solucin diluyente ..................................................................... 0,90 mL
Otra forma de preparar la solucin Giemsa diluida es agregando dos go-
tas de Solucin Giemsa stock por cada mililitro de solucin diluyente.

2. CULTIVO
2.1. Solucin de estreptomicina: (500 mg/mL)

Diluir 5 gr de sulfato de estreptomicina en 10 mL de agua destilada estril.
La concentracin final del antibitico en el medio de cultivo o solucin
salina debe ser 500 g/mL. Ejemplo: Para 100 mL de medio de cultivo
agregar 0,1 mL de la solucin de estreptomicina.
2.2. Solucin de penicilina G sdica : (200 000 UI/mL)

Diluir 1 milln de unidades de penicilina en 5 mL de agua destilada estril.
La concentracin final del antibitico en el medio de cultivo o solucin
salina debe ser 200 000 UI/mL. Ejemplo: Para 100 mL de medio de cultivo
agregar 0,1 mL de la solucin de penicilina.
2.3. Solucin de 5-fluorocitosina (500 mg/mL)

Diluir 5 gr de 5-fluorocitosina en 10 mL de solucin salina estril.
Concentracin final: 500 g de 5-fluorocitosina por cada mililitro de medio
de cultivo o solucin salina. Ejemplo: Para 100 mL de medio de cultivo
agregar 0,1 mL de la solucin de 5-fluorocitosina.
Nota: Esterilizar las soluciones por filtracin (0,22 de porosidad).
2.4. Obtencin de sangre desfibrinada de conejo
2.4.1. Materiales y reactivos

Conejo adulto.
Matraz o baln que contenga perlas de vidrio (estril).
Aguja N. 18 y jeringa de vidrio de 50 mL (estril).
Tijeras.
Alcohol yodado y algodn.
Mechero Bunsen o de alcohol.

a) Sujetar al conejo en posicin cbito dorsal.
b) Ubicar la zona de puncin (latido cardaco), cortar con una tijera el
pelaje y desinfectar con alcohol yodado el rea elegida.
c) Obtener por puncin al corazn de 20 a 40 mL de sangre.
d) Muy cerca al mechero, para conservar la esterilidad de la sangre, va-
ciar la sangre a un matraz o baln estril, el cual contiene perlas de
vidrio.
e) Agitar suavemente con movimientos rotatorios para desfibrinar la san-
gre durante cinco minutos.
2.5. Medio de cultivo agar sangre
2.5.1. Materiales y reactivos

Medio base para agar sangre ................................................... 4 g
Agua destilada ........................................................................... 100 mL
Solucin de estreptomicina ...................................................... 0,1 mL
Solucin de penicilina ............................................................... 0,1 mL
Sangre desfibrinada de conejo ................................................ 15 mL
Tubos de prueba de 13 x 100
a) En un baln de 500 mL diluir el agar (bao Mara 80 C) en 100 mL de
agua destilada y autolavar a 121 C por 15 minutos.
b) Dejar enfriar a temperatura ambiente hasta, aproximadamente, 46 C y
aun estando el agar licuado, agregar 15 mL de sangre desfibrinada de
conejo, en ambiente de esterilidad.
c) Agregar las soluciones de antibiticos 0,1mL de la solucin de
estreptomicina y 0,1 mL de penicilina.
d) Revertir 1,5 mL del medio en tubos de prueba con tapa rosca.
e) Controlar la esterilidad del medio a 37 C durante 18 horas.
f) Guardar a 4 C hasta el momento de uso.

3. HEMAGLUTINACIN INDIRECTA
3.1. Solucin de Alsever

Glucosa anhidrida ..................................................................... 18,66 g
Cloruro de sodio ........................................................................ 4,18 g
Citrato de sodio .......................................................................... 8,00 g
cido ctrico ................................................................................ 0,55 g
3.2. Solucin salina tamponada - buffer fosfato salino (PBS) 0,15 mL

Preparar: Solucin 1:
KH2PO4 ...................................................... 2,04 g
H2O destilada .................... 100 mL
Solucin 2:
NA2HPO4 .................................................. 2,13 g
H2O destilada .................... 100 mL
REACTIVOS PBS ph 7,2 PBS ph 6,4
Solucin 1 7 mL 18,4 mL
Solucin 2 18 mL 6,7 mL
NaCI 2,1 g 2,1 g
Agua destilada 250 mL 250 mL
3.3. Solucin diluyente

Suero humano negativo al 1% en PBS pH 7,2
Ejemplo: 0,5 mL suero humano
45 mL de PBS pH 7,2

3.4. cido tnico solucin stock al 1%

cido tnico ................................................................................ 10 mg
Solucin salina .......................................................................... 1 mL
Solucin de trabajo 1/20 000

cido tnico solucin stock ....................................................... 100 L
Solucin salina .......................................................................... 20 mL
4. ELISA
4.1. Buffer fosfato salino (PBS) pH 7,2
KCI .............................................................................................. 0,2 g
Na2HPO4 anhidro ....................................................................... 1,148 g
Na H2PO4 anhidro ...................................................................... 0,2 g
NaCI ............................................................................................ 8,0 g
Conservar a 4 C.
4.2. Buffer de lavado

Buffer fosfato salino + Tween 20 al 0,05%.
4.3. Solucin de bloqueo

Buffer fosfato salino + seroalbmina bovina al 3%
4.4. Solucin diluyente

Buffer fosfato salino + seroalbmina bovina al 1%
4.5. Conjugado Antiinmunoglobulina humana marcada con peroxidasa

Para determinar el ttulo del conjugado ejecutar el procedimiento de la
tcnica ELISA con sueros controles positivo (con ttulo conocido), negativo
y control de inespecificidad y evaluar diluciones dobles del conjugado ma-
yores y menores a la dilucin propuesta por el laboratorio fabricante.

Considerar como ttulo del conjugado a la mayor dilucin con la que se

obtiene la lectura de la absorbancia esperada en los sueros control.
4.6. Solucin estabilizadora para el sustrato pH 6

cido ctrico ................................................................................ 3,0 g
Na2HPO4 anhidro ....................................................................... 10,7 g
Ajustar el pH a 6
Antes de su uso, diluir la solucin estabilizadora del sustrato (8 mL) con
agua destilada (17 mL).
4.7. Solucin del sustrato

Solucin estabilizadora para el sustrato .................................. 25 mL
Orto-phenilendiamine ............................................................... 10 mg
Perxido de hidrgeno al 30% .................................................. 10 L
4.8. cido sulfrico 2,5 M

cido sulfrico ............................................................................ 1,4 mL
Agua destilada ........................................................................... 8,6 mL
5. INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)
5.1. Buffer fosfato salino (PBS) 0,001 M pH 7,4

Para preparar un litro de PBS, pesar:
NaCI ............................................................................................ 8,1g
Na2HPO4 12 H2O ........................................................................ 2,6 g
Na2HPO4 1 H2O ........................................................................... 0,3 g
Diluir las sales en 900 mL de agua destilada.
Ajustar el pH a 7,4 utilizando NaOH 1 M

En una probeta, enrasar a un litro con el agua destilada.

Conservar en refrigeracin (4 C).
5.2. Buffer diluyente (PBS + tween 80 al 1%)

PBS ............................................................................................. 99 mL
Tween 80 .................................................................................... 1 mL
5.3. Solucin de azul de Evans

Preparar la solucin stock de la siguiente manera:
Azul de Evans ............................................................................. 100 mg
PBS - tween 80 ........................................................................... 100 mL
Conservar en refrigeracin (4 C)
Preparar la solucin de trabajo antes de usarla

Solucin stock ............................................................................ 1 parte
PBS tween 80 ............................................................................. 9 partes
5.4. Buffer carbonato - bicarbonato 0,5 M pH 8,5

Solucin A
Na2CO3 ........................................................................................................................................................ 5,3 g
Agua destilada c.s.p. ................................................................. 100 mL
Solucin B
NaHCO3 ..................................................................................................................................................... 4,2 g
Agua destilada c.s.p. ................................................................. 100 mL
Mezclar 0,4 mL de la solucin A con 10 mL de la solucin B.
Verificar o ajustar el pH a 8,5. Utilizar la solucin A si est por debajo de 8,5
y la solucin B si est por encima de este valor.

5.5. Glicerina tamponada

Buffer carbonato - bicarbonato 0,5 M, pH 8,5 ........................... 1 mL
Glicerina bidestilada .................................................................. 9 mL
5.6. Titulacin del conjugado antiinmunoglobulina humana asociada a

isocianato de fluorescena
El fabricante estima el ttulo del conjugado, sin embargo, antes de su uso
corroborarlo o determinarlo evalundolo en diluciones dobles mayores y
menores al ttulo indicado. Emplear en la evaluacin un suero control posi-
tivo de ttulo conocido y un suero control negativo.
Elaborar el protocolo de trabajo siguiendo el esquema siguiente y efectuar
el procedimiento de la tcnica IFI,
TTULO RECOMENDADO
CONJUGADO 1/50 1/100 1/200 1/400 1/800
1 2 3 4 5 6
CP 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 B
CN 1 /32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 B
7 8 9 10 11 12
CP : SUERO CONTROL POSITIVO A T. cruzi CI: SUERO CONTROL INTERNO
CN : SUERO CONTROL NEGATIVO A T. cruzi B: BLANCO (control de reactivos)
El ttulo del conjugado es la mayor dilucin del conjugado en la que

fluoresce el suero positivo en su ttulo conocido.
Titular cada lote nuevo del conjugado; asimismo, cuando se cambia el lote
de antgeno, los controles o alguno de los reactivos de la batera IFI.

ANEXO 2
AISLAMIENTO Y MANTENIMIENTO DE Trypanosoma

cruzi EN EL LABORATORIO
1. AISLAMIENTO
El parsito se puede aislar a partir de:
1.1. Pacientes, por hemocultivo o xenodiagnstico
1.1.a. Hemocultivo:
Sembrar la muestra de sangre heparinizada de un paciente chagsico
agudo en medio de cultivo bifsico agar sangre - suero fisiolgico.
Proceder igual que en el hemocultivo para el diagnstico.
Generalmente, la parasitemia en sangre circulante es baja por lo que,
a mayor volumen de sangre sembrada, mayor posibilidad de xito en
el aislamiento.
1.1.b. Xenodiagnstico:
Aplicar el xenodiagnstico a un paciente chagsico agudo.
Seguir el procedimiento que se detalla para el aislamiento a partir de
los vectores.
1.2. Vectores
Procedimiento:
Desinfectar el insecto positivo a la infeccin por T. cruzi sumergindo-
lo durante un minuto en una solucin alcohlica al 70%.
Cortar la parte terminal del abdomen del insecto con la ayuda de unas
pinzas y tijeras finas desinfectadas retirar el tubo digestivo y colocarlo
sobre una lmina porta objetos.
Sembrar el material fecal y el tubo digestivo en medio de cultivo bifsico
agar sangre-suero fisiolgico e incubar a 28 C.

2. MANTENIMIENTO
2.1. En medio de cultivo

Los parsitos aislados se mantienen en cultivo por repiques semana-
les en nuevos tubos con agar sangre. Es recomendable mantener dos
tubos del mismo cultivo y manipular solamente uno de ellos, esto per-
mitir continuar los cultivos en caso de contaminacin.
2.2. En animales
La inoculacin en animales de experimentacin es otra forma de ais-
lar y mantener el parsito. Se usa ratones jvenes y el control se reali-
za examinando peridicamente la parasitemia en una gota de sangre,
en fresco, obtenida por corte en la porcin terminal de la cola.
El traspaso de animal a animal se hace por inoculacin intraperitoneal de
sangre positiva. As se conserva la capacidad de infeccin del parsito.
2.3. Criopreservacin
Es la conservacin de los parsitos a -80 C, este procedimiento man-
tiene las caractersticas nativas del parsito. Se realiza colocando una
suspensin de parsitos procedentes de cultivo en medios de conser-
vacin con glicerol a diferentes concentraciones.

ANEXO 3
PREPARACIN DE ANTGENOS
1. ANTGENO PARA LA INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA

Las lminas empleadas para la prueba de inmunofluorescencia indirecta,
se preparan con epimastigotes de Trypanosoma cruzi obtenidos en medio
de cultivo y tratados con formol.
Se emplean cultivos de cuatro das (fase exponencial del crecimiento). Los
parsitos deben estar aislados para fijarse en las lminas, evitar las rosetas.
1.1. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS

5 mL de cultivo de epimastigotes.
Tubos de centrfuga 10 mL, 1,5 mL con tapa.
Lminas para inmunofluorescencia.
Buffer fosfato salino (PBS) 0,01 mL pH 7,4 (Anexo 1).
Solucin formolada: PBS + formol al 2% V:V.
Acetona.
Centrfuga.
Cmara de Newbauer
1.2. PROCEDIMIENTO PARA OBTENER LA SUSPENSIN DE PARSITOS

a) Filtrar el cultivo a travs de una capa fina de gasa o lana de vidrio.
b) Centrifugar el cultivo a 4000 rpm durante diez minutos.
c) Retirar el sobrenadante, en el sedimento se encuentran los parsitos
d) Lavar los parsitos por tres veces de la siguiente manera:
- Resuspender los parsitos en 5 mL de PBS, 0,01 M pH 7,4.
- Centrifugar a 4000 rpm por diez minutos.
- Retirar el sobrenadante.
- Repetir el lavado.

e) Resuspender el sedimento en 0,50 mL de PBS 0,01 M pH 7,4.

f) Adicionar 0,50 L de solucin formolada y dejarlo durante una hora en
refrigeracin (4%C). Luego proceder al lavado al igual que en el punto d.
g) Resuspender el sedimento en 0,25 mL de PBS 0,01 M pH 7,4.
h) Colocar una alcuota de la suspensin de parsitos en una cmara de
Newbauer y realizar el contaje de parsitos en el microscopio a 40X.
i) Diluir la suspensin con PBS hasta obtener de 25 a 40 parsitos por
campo microscpico a 40X.
1.3. FIJACIN DE LOS PARSITOS A LAS LMINAS

Depositar 25 L de la suspensin diluida de parsitos sobre el rea
de los crculos de la lmina IFI.
Dejar secar a temperatura ambiente o con la ayuda de un secador o
ventilador.
En un frasco couplin que contiene acetona fra, sumergir las lminas para
fijar el parsito. Mantenerlo en refrigeracin (4 C) durante diez minutos.
Las lminas fijadas envolverlas en papel aluminio o guardarlas en
una caja portalminas, sellando los bordes con esparadrapo para
evitar la humedad.
Conservarlas en congelacin (-4 a -20C) hasta el momento de su uso.

1.4. RECOMENDACIONES
Emplear lminas limpias, libres de grasa, para facilitar la fijacin uni-
forme de la suspensin de parsitos a la lmina y para evitar los arte-
factos que dificultan la lectura.
Proceder de la siguiente manera para la limpieza:
- En un frasco couplin o frasco con tapa, que contiene alcohol -
acetona V:V, sumergir las lminas IFI nuevas, durante 1 a 24 ho-
ras. Secarlas con una gasa limpia y conservarlas envueltas con
papel hasta el momento de su uso.
- Las lminas IFI usadas, lavarlas previamente con detergente y
luego proceder al igual que con las nuevas.
- Los cubreobjetos dejarlos en un recipiente que contenga alcohol
al 70% durante 30 minutos, luego secarlos con gasa limpia una a
una. Conservarlas en su caja o en una placa Petri hasta su uso.
2. ANTGENO PARA LA HEMAGLUTINACIN INDIRECTA

El antgeno es un extracto acuoso de epimastigotes de Tripanosoma cruzi,
obtenido de cultivo in vitro.
2.1. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS

50 mL de cultivo de epimastigotes.
Tubos de centrfuga, 50 mL y 10 mL con tapa.
Buffer fosfato salino pH 7,4 (PBS) (Anexo 1).
Solucin NaCL 1,7%.
Merthiolate 1:10 000.
Solucin salina estril.
Gasa.
Centrfuga.
Congeladora -20 C.
Bao Mara.

2.2. PROCEDIMIENTO
a) Filtrar el cultivo a travs de una capa de gasa o lana de vidrio.
b) Centrifugar el cultivo a 4000 rpm durante 10 minutos.
c) Retirar el sobrenadante, en el sedimento se encuentran los parsitos.
d) Lavar los parsitos de la siguiente manera:
-Resuspender el sedimento en 5 mL de PBS.
-Centrifugar a 4000 rpm por 10 minutos.
-Retirar el sobrenadante.
e) Repetir el lavado.
f) Resuspender los parsitos en agua destilada (1:10).
g) Congelar (-70 C) y descongelar (37 C) por seis veces sucesivas.
h) Agregar un volumen igual de solucin Nacl al 1,7%.
i) Centrifugar durante 30 minutos a 4000 rpm y 2 C.
j) El sobrenadante constituye el antgeno. Agregar la solucin de
Merthiolate al 1:10 000.
k) Conservar en congelacin (-4 a -20 C) hasta el momento de su uso.
3. ANTGENO PARA ELISA

El antgeno es un extracto soluble acuoso de epimastigotes lisados mec-
nicamente (por presin o congelamiento y descongelamiento sucesivo), o
por ultrasonido (sonicacin).
Los epimastigotes son obtenidos de preferencia en medio lquido LIT; el
cual contiene infusin de cerebro y corazn, caldo de infusin de hgado,
extracto de levadura y como suplemento hemina, suero fetal bovino.
La suspensin antignica alicuotada se conserva a -20 C hasta su uso.

ANEXO 4
CONSERVACIN Y ENVO DE MUESTRAS
El laboratorio enviar las muestras de sangre o suero y la ficha correspon-

diente (anexo 5) al laboratorio del nivel inmediato superior para realizar el
estudio de lminas, el hemocultivo o el examen serolgico, cuando lo con-
sidere necesario.
Al realizar el embalaje, considerar las temperaturas adecuadas de conser-
vacin de las muestras:
Suero en congelacin (<0 C).
Sangre en capilares y en tubos en fro (4-8 C).
Procedimiento:
a) Colocar las muestras en una bolsa plstica, luego acondicionarlos en
un contenedor secundario (recipiente de cartn grueso o plstico, ro-
deado con hielo seco o cubos de hielo).
b) El recipiente secundario debe ser colocado en una caja de tecnoport
(poliestireno) u otro material que conserve las temperauras bajas. In-
cluir la ficha de solicitud de examen en bolsa plstica sellada.
c) Cerrar y sellar hermticamente la caja trmica.
d) Rotular la caja trmica con los siguientes datos: destino direccin y
nombre del laboratorio al que se envia las muestras, ejemplo.
URGENTE
MATERIAL BIOLGICO PERECIBLE
DESTINO: INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
DIRECCIN: CALLE CPAC YUPANQUI 1400
JESS MARA - LIMA 11
TELEFONOS: 471-9920 / 471-2529
ATENCIN: LABORATORIO DE LEISHMANIOSIS Y CHAGAS

Anotar en lugar visible la temperatura de conservacin de la muestra, refri-

geracin (4-8 C) o congelacin (0 - 20 C). Colocar una flecha indicando la
posicin en la que debe mantenerse la caja.
La va de transporte debe ser la ms rpida posible.
En caso de contar con contenedores prefabricados, seguir las instruccio-
nes que indica el envase.
MUESTRA
EXAMEN DE
LABORATORIO OBTENCIN CARACTE- PROCESA-
TIPO DE SANGRE CANTIDAD CONSERVACIN TRANSPORTE
RSTICAS MIENTO
Sangre Temperatura Temperatura

GOTA GRUESA En lminas 2 Lminas Homognea ambiente Inmediato ambiente
capilar
Evitar las Temperatura

MICRO- Sangre En capilares 4 - 6 tubos burbujas ambiente Antes de las
con EDTA Con refrigerante
CONCENTRACIN capilar capilares de aire y en posicin cuatro horas
en el vertical
capilar
CONCENTRACIN Refrigeracin Inmediato o

Sangre En tubo
STOUT Y vacutainer 5 mL Esteril antes de Con refrigerante
venosa (4 - 8 C )
HEMOCULTIVO sin siete das
anticoagulante
Hasta 5 das:
ELISA
Suero o Refrigeracin
IFI En tubo No hemolizado 4-8 C
plasma vacutainer 1 - 2 mL Mediato Con refrigerante
HAI No contaminado
sanguneo sin Mayor de 5 das:
IB Congelacin
anticoagulante
-20 a - 80 C

Anexo 5
Solicitud para diagnstico de laboratorio de la enfermedad de Chagas
Establecimiento de salud Direccin Regional de Salud Banco de sangre

No S
I. DATOS PERSONALES Fecha _____/_____/_____

Da Mes Ao
Apellidos y Edad Sexo

Nombres Aos Meses Fem Masc
Direccin
Calle y N Localidad Distrito Provincia Departamento
II. ANTECEDENTES
Diagnstico clnico Aspectos epidemiolgicos
Sintomtico Asintomtico Presencia de chirimachas en su
vivienda No S Hubo Dnde Cundo
Agudo Signo de Romaa

Vivienda rociada con insecticida
Chagoma de inoculacin No S Hace cunto tiempo Cdigo de vivienda
Fiebre
Familiar con Dx . de Chagas
Manifestaciones cardiacas No S Quin
Crnico Insuficiencia cardiaca Vivi o visit rea endmica

Disfagia No S Lugar / Hace cunto tiempo
Estreimiento
Recibi transfusin sangunea
Megaesfago No S Hace cunto tiempo
Megacolon Antecedente de Uta o Espundia
(Leishmaniosis )
Aumento de ganglios No S Hace cunto tiempo
Congnito
Prematuro
Gestante
Hepato-esplenomegalia No S Fecha ltima regla Fecha probable parto
Resultados anteriores de laboratorio y tratamiento recibido

No S Fecha Donde se realiz el dx . Tcnica empleada /Nombre reactivo
Valor de
Parasitemia positiva Abs. corte
Serologa reactiva ELISA:
OTRA:
Complet el
Recibi medicamento
tratamiento
No S Hace cuanto tiempo Nombre del medicamento No S
III. EXMENES DE LABORATORIO SOLICITADO
Diagnstico Confirmacin del diagnstico Seguimiento del tratamiento
Examen parasitolgico Examen serolgico

Fecha obt . Fecha recep. Fecha obt. Fecha recep. V. de C
Resultado Resultado Abs.
muestra muestra muestra muestra Ttulo
Gota gruesa - frotis ELISA
Microconcentracin HAI
Concent. Strout IFI
Hemocultivo
IB
Xenodiagnstico
Responsable de solicitud de diagnstico Responsable del diagnstico
Nombres y apellidos Firma Nombres y apellidos Firma

INSTRUCTIVO DE LA SOLICITUD PARA DIAGNOSTICO DE LABORATORIO
DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS
Llenar los casilleros con los datos solicitados.
I. DATOS PERSONALES
En el casillero direccin, anotar el lugar de residencia habitual
II. ANTECEDENTES
Diagnstico clnico
Sintomtico: marcar con X si hay alguna sintomatologa compatible con la enfermedad. En caso
de infecciones agudas o crnicas, identificar con una X el casillero correspondiente a los
sntomas presentes.
Asintomtico o indeterminado: marcar con una X cuando no hay sintomatologa pero hay
antecedentes epidemiolgicos que hacen sospechar de la infeccin.
Aspectos epidemiolgicos
Llenar o marcar con una X los casilleros correspondientes. Precisar en lo posible las fechas de los
datos solicitados.
reas endmicas: Arequipa, Moquegua, Tacna, Ica, Cajamarca, Amazonas y San Martn.
Resultados anteriores de laboratorio y tratamiento recibido
Marcar el casillero que corresponda. Anotar la fecha, el nombre del establecimiento que realiz el
diagnstico, la tcnica y nombre del kit usado, en caso de ELISA absorbancia (Abs) de la muestra
y el valor de corte (Vc) correspondiente.
III. EXAMEN SOLICITADO
Los exmenes solicitados sern los apropiados para confirmar el diagnstico presuntivo y
estarn de acuerdo a la situacin clnica de la persona: agudo, crnico portador, congnito.
Marcar con una X el casillero confirmacin del diagnstico, en caso de tener resultados de
laboratorio anteriores y el de seguimiento cuando se solicita el examen de laboratorio de persona
con tratamiento.
Debe colocarse las fechas segn el momento del proceso: al obtener la muestra y al ingresar al
laboratorio que efectuar el examen.
Dejar en blanco los casilleros de resultados hasta el momento de emitirlos.
El solicitante ser el responsable del laboratorio local o regional.

Anexo 6
Solicitud de control del diagnstico de laboratorio

de la trypanosomiosis americana
DIRECCIN REGIONAL DE SALUD
ESTABLECIMIENTO DE SALUD
RESPONSABLE DEL DIAGNSTICO
ACTIVIDAD EN CONTROL Vigilancia Diagnstico Proyecto de

Otro
serolgica de laboratorio investigacin
NOMBRE DE LA ACTIVIDAD (Lugar)
PERIODO N Muestras N Muestras

evaluadas Reactivas/Positivas
Resultados Laboratorio Referencia Regional

N. Cdigo Nombres y Apellidos Observaciones
Laboratorio Gota HAI ELISA IFI
gruesa Abs . V.c. 1/32
Nombre de reactivos o kits empleados por el laboratorio de referencia regional:
NOTA: Enviar todas las lminas o sueros positivos y 10% de los negativos examinados en el trimestre (lminas coloreadas con Giemsa de
exmenes de sangre por gota gruesa, concentracin). Adjuntar el presente formato con la informacin solicitada empleando una hoja para
cada actividad y el formato de solicitud de diagnstico de las muestras positivas o reactivas
.
Lugar y fecha Nombres y apellidos del responsable del laboratorio Firma

ANEXO 7
REGISTRO DE MUESTRAS PARA INVESTIGACIN Y MONITOREO DE CASOS DE ENFERMEDAD DE CHAGAS
CDIGO DE SOLICITA EXAMEN DE LABORATORIO
N. FECHA LABORATORIO NOMBRES Y APELLIDOS EDAD SEXO PROCEDENCIA (*) OBSERVACIONES
GG CONC. CULT. HAI ELISA IFI
(*) D : Diagnstico GG : Gota gruesa HAL : Hemaglutinacin indirecta
CD : Confirmacin diagnstico CONC. : Concentracin ELISA : Ensayo inmunoenzimtico
M : Monitoreo o seguimiento de caso CULT. : Cultivo IFI : Inmunofluorescencia indirecta
ANEXO 8
DETECCIN DE ANTICUERPOS ANTI Trypanosoma cruzi POR ELISA
Ejecutor del ensayo Fecha
Nombre del kit Valor de corte
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
B 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
C 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
D 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
E 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
F 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
G
H 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
NOMBRE DEL KIT
Fecha de
Lote N
vencimiento
Da Mes Ao
CONJUGADO
Fecha de
Ttulo
vencimiento
CONTROLES Cdigo N Lectura (Abs)

Suero control negativo a T.cruzi CN
Suero control positivo a T. cruzi CP
Suero control positivo a T. cruzi CP
Suero control interno CI
Blanco de reactivos B
S No
VALIDACION DE LA CORRIDA
CALCULO DEL VALOR DE CORTE Valor de corte (Vc):
OBSERVACIONES
Firma
Responsable del control interno Fecha
Da Mes Ao
ANEXO 9
DETECCIN DE ANTICUERPOS ANTI Trypanosoma cruzi POR IFI
Ejecutor del ensayo Fecha
1 2 3 4 5 6
1 1 1 1 1 1
7 8 9 10 11 12
1 2 3 4 5 6
1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1
7 8 9 10 11 12
1 2 3 4 5 6
1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1
7 8 9 10 11 12
OBSERVACIONES
ANTIGENO IFI
Fecha de
Lote N
vencimiento
Da Mes Ao
CONJUGADO
Lote N Ttulo
CONTROLES
Cdigo N Ttulo Lectura
Suero control positivo a T.cruzi CP 1/
Suero control negativo a T.cruzi CN 1/
Suero control interno CI 1/
Blanco de reactivos B Sin suero -
LECTURA E INTERPRETACIN
Ttulo de valor diagnstico: 1/32 Validez de la corrida S No
Leyenda de lecturas: Leyenda de resultados:
Fluorece francamente + Reactivo R
No fluorece - No reactivo NR
Fluorece dbilmente +/- Indeterminado I
OBSERVACIONES
Firma
Responsable del control interno Fecha
Da Mes Ao
CEPREDIM
SE TERMIN DE IMPRIMIR
POR ENCARGO DEL INS
EN EL MES DE ABRIL DE 2006,
EN LOS TALLERES GRFICOS DEL
CENTRO DE PRODUCCIN EDITORIAL E IMPRENTA DE
LA UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
JR. PARURO 119. LIMA 1.
TELFONO: 619-7000, ANEXO: 6009 / FAX: 6015
E-MAIL: CEPEDIT@UNMSM.EDU.PE
TIRAJE: 1000 EJEMPLARES

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INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

SERIE DE NORMAS TCNICAS N 00

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

Instituto Nacional de Salud

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL

Laboratorio de Leishmaniosis y Chagas

Vega Chirinos, Silvia ; Nquira Velarde, Csar

1. TCNICAS Y PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO 2. ENFERMEDAD DE

ISBN 9972 857 26 3 (O.C.)

Ministerio de Salud, 2006

Instituto Nacional de Salud, 2006

Publicacin aprobada con R.J. N 164 2006 JOPD/INS

Portada: Observacin microscpica de formas mviles del Trypanosoma cruzi.

Se autoriza su reproduccin total o parcial siempre y cuando se cite la fuente.

Resolucin jefatural ................................................................................. 5

Referencias bibliogrficas ...................................................................... 77

Anexo 1: Preparacin de reactivos y medios de cultivo ......................... 79

Anexo 2: Aislamiento y mantenimiento del Trypanosoma

Anexo 3: Preparacin de antgenos ........................................................ 89

Anexo 4: Conservacin y envo de muestras

Anexo 5: Solicitud para el diagnstico de laboratorio de

Anexo 6: Solicitud de control del diagnstico de laboratorio

Anexo 7: Registro de muestras para investigacin y monitoreo

Anexo 8: Protocolo para la deteccin de anticuerpos anti

Anexo 9: Protocolo para la deteccin de anticuerpos anti

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La trypanosomiosis americana o enfermedad de Chagas es una infeccin

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La enfermedad de Chagas o trypanosomiosis americana constituye un

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Trypanosoma cruzi agente causante de la enfermedad de Chagas, es un

1.1. CICLO BIOLGICO

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AMASTIGOTE TRYPOMASTIGOTE EPIMASTIGOTE

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Cuando el insecto infectado pica o succiona la sangre al reservorio, defeca

1.2. MECANISMOS DE TRANSMISIN

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DISTRIBUCIN DE TRIATOMINOS EN EL PER

Fig. 3. Distribucin de los vectores de la enfermedad de Chagas.

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Fig. 4. Triatominos vectores de la enfermedad de Chagas.

Fig. 5. Izq.: Epimastigotes en divisin en el intestino del triatmico infectado, se

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1.3. ACCION PATGENA

Fig. 6. Paciente que presenta chagoma de inoculacin en el ojo izquierdo. Los

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Las manifestaciones generales ms importantes son concomitantes con

Figura 7. Arriba: Trypomastigote de Trypanosoma cruzi en sangre circulante. El ncleo

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Forma indeterminada o de portador

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Para realizar el diagnstico del laboratorio, existen distintos procedimientos

2.1. TCNICAS PARASITOLGICAS PARA LA DEMOSTRACIN DIRECTA DE

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La biopsia de msculo esqueltico, ganglio etc., permite la observacin de

2.2. TCNICAS INMUNOLGICAS PARA LA DETECCIN DE ANTICUERPOS

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ALGORITMO PARA EL DIAGNSTICO DE LABORATORIO Y SU

- TRANSMISIN VECTORIAL INFECCIN POCO