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2004
Iram Pablo Rodrguez Snchez / Hugo A. Barrera Saldaa
LA REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA A DOS DCADAS DE SU
INVENCIN
Ciencia UANL, julio-septiembre, ao/vol. VII, nmero 003
Universidad Autnoma de Nuevo Len
Monterrey, Mxico
pp. 323-335
LA REACCIN EN CADENA
DE LA POLIMERASA A DOS DCADAS
DE SU INVENCIN
P
ocos descubrimientos del complejo Pero la PCR no es
mundo cientfico actual pueden ser slo una tcnica exqui-
considerados realmente revoluciona- sitamente especfica,
rios. Sin embargo, cuando ocurren sino tambin muy sen-
se transforma el modo en que se piensa y trabaja en sible, pues en principio
el laboratorio. para practicarla basta-
Aunque el progreso en las diferentes ramas de la ra una sola molcula,
ciencia parece ser lento y su evolucin resulta una por ejemplo, del geno-
letana de paso a paso, en el caso de la biologa ma humano (~6 pico-
molecular ha sucedido lo contrario. Esta disciplina gramos), aunque habi- Fig. 1. Kary B. Mullis. Este sin-
ha sido afortunada con grandes cambios en tiem- tualmente se emplean gular empleado de la compa-
pos relativamente cortos. a Cetus Corporation, en
cantidades excesivas Emeryville, California, se hizo
Una poca nutrida de dichos cambios fue la d- de ste (en el orden de acreedor del Premio Nobel en
cada de 1970, en la que se produjo un gran nme- hasta microgramos). 1993 por la invencin de la
ro de descubrimientos, como el de las enzimas de Adems, por si es- PCR, tcnica utilizada para
restriccin, la clonacin de genes en plsmidos y tos atributos fueran multiplicar millonariamente in
fagos, y las tcnicas de hibridacin en filtro para pocos, la tcnica es tan vitro fragmentos especficos de
ADN y ARN, conocidas como Southern y Northern robusta que puede usar cualquier ADN. Fuente: Archi-
blot, respectivamente; as como las invenciones de vos de la ULIEG.
como substrato para la
las tcnicas de secuenciacin qumica y enzimtica reaccin al ADN, sin
para el ADN.1 tener que purificarlo de su fuente natural, y es co-
Otro salto tecnolgico ocurri en 1983, cuando mn emplear productos biolgicos diversos como
Kary Mullis (figura 1) desarroll una nueva tcnica tejidos embebidos en parafina, semen recuperado
que hizo posible la sntesis de grandes cantidades de escenas de violacin, lavados bronquiales,
de un fragmento de ADN sin tener que clonarlo: la exudados de mucosas, races de cabellos o cejas,
reaccin en cadena de la polimerasa (conocida sangre, extendidos citolgicos, etc.; muchas veces
como PCR por sus siglas en ingls). Esta tcnica es basta una simple ebullicin de la muestra para lisar,
considerada la ms revolucionaria del ltimo cuar- liberar y de paso desnaturalizar el ADN, dejndolo
to del siglo XX.2 Con sta se consigue copiar millo- listo para la reaccin.
nes de veces, en un par de horas, una secuencia
predeterminada, dentro de una mezcla de ADN tan
compleja como el propio genoma humano, donde
*Unidad de Laboratorios de Ingeniera y Expresin Genticas, De-
la secuencia de inters representa tan slo una diez- partamento de Bioqumica, Facultad de Medicina de la Universi-
millonsima parte.3 dad Autnoma de Nuevo Len.
suelen usarse degenerados, y en realidad son una se separa de la mezcla de reaccin mediante filtra-
mezcla de cebadores de la misma longitud con cier- cin o centrifugacin. A continuacin se repite el
tas diferencias de secuencia en posiciones especfi- procedimiento para unir otro nucletido. Se invier-
cas, de tal forma que se abarque un intervalo am- ten aproximadamente 40 minutos en aadir un
plio de posibles secuencias blanco.13 nucletido a la cadena y es posible sintetizar cade-
En estos casos se debe procurar que la degene- nas con una longitud de hasta 100 nucletidos.15
racin sea mnima en el extremo 3', puesto que en Como ya se dijo, estos iniciadores no deben ser
ste, las bases desapareadas se extienden con poca complementarios entre s, para que no se hibriden
eficiencia. Ambos iniciadores deben tener una tem- entre ellos. Y deben flanquear los extremos de la
peratura de fusin o Tm similar y, por ende, un con- porcin de ADN que se desea amplificar, debiendo
tenido semejante en G+C. La frmula ms utiliza- de formar puentes de hidrgeno con dicho ADN a
da para calcular la Tm de un iniciador es: Tm = ambos lados de la regin de inters.
(2C) (# de A+T) + (4C) (# de G+C). 2
La distancia que separa los sitios donde se Diseo de los cebadores
aparean los cebadores dentro del ADN molde de-
termina el tamao del producto de amplificacin. El Para la eleccin de los iniciadores existe una serie
tamao ideal depende de la aplicacin: los produc- de normas que pueden ayudar, aunque hay que in-
tos largos se amplifican con menor eficiencia, mien- dicar tambin que existen programas de cmputo
tras que los productos muy cortos pueden confun- que facilitan esta tarea (ADNsis, Primer3, Oligo, etc.).
dirse con dmeros de los iniciadores y limitan mucho Deben evitarse tramos largos de una sola base y
la posibilidad de caracterizarlos posteriormente. que el extremo 3 tenga una estructura secundaria
Existen diferentes programas computacionales importante. Tambin se debe procurar en lo posible
que ayudan en el diseo de cebadores y calculan que las ltimas bases del extremo sean G o C, para
sus Tms, estructuras secundarias y posibles interac- que le brinden mayor estabilidad al punto de inicio
ciones entre ellos.14 de la etapa de extensin.17
Los cebadores se sintetizan en el laboratorio Como ya se dijo, se debe evitar la complemen-
mediante un proceso escalonado en el que se van tariedad entre la pareja de iniciadores para minimi-
aadiendo nucletidos libres al extremo de la cade- zar la posibilidad de que se creen dmeros de
na en crecimiento. El extremo 3 del nucletido ini- cebadores.
ciador de la futura cadena se fija a un soporte sli- Normalmente deben tener un tamao de 18-30
do como una partcula de gel de slice. Un sintetiza- nucletidos, y que ste sea similar para ambos
dor de ADN o mquina de genes realiza la sntesis cebadores. La temperatura de hibridacin de los
en fase slida, aadiendo paso a paso cada cebadores al molde se ajusta para que sea, cuando
nucletido en una serie de etapas (figura 5). Al final mucho, 5C menor que la temperatura calculada
de cada ciclo de adicin, la cadena en crecimiento segn la frmula arriba citada.
Enzima
ADN
Alineamiento
Extensin
Con el ADN molde de cadena sencilla, excepto en
los sitios donde los iniciadores se aparean, la poli-
merasa empieza a copiar la hebra, incorporando
desoxirribonuclesidos monofosfatos en direccin
53 (figura 8). Esta etapa debe realizarse a una
temperatura alta, que es la que coincide con la
mxima actividad de la polimerasa (72C) para evi-
Fig. 9. Conclusin de la PCR. Tericamente entre ms ci-
tar alineamientos inespecficos de los iniciadores.
clos de reaccin integren el programa de amplificacin, ms
El tiempo de extensin depende del tamao de productos idnticos se generarn. Pero al aumentar los ci-
la amplificacin, debiendo estimar 1 min. para alar- clos tambin se aumenta proporcionalmente la posibilidad
gar 1000 nucletidos. Es comn que al finalizar to- de agregar errores en las nuevas secuencias.
la muestra una vez que el resto de factores han sido culares Duchenne/Becker.35
optimizados (normalmente de manera emprica). Esta tcnica ha tenido un impacto maysculo en
Es importante evitar un nmero alto de ciclos, ya la medicina forense, campo en el que se est utili-
que pueden dar lugar a la amplificacin de produc- zando en investigacin criminal como parte de la
tos no deseados originados por hibridaciones ines- tecnologa de la huella digital del ADN. Gracias a
pecficas. su aplicacin, es posible excluir o incriminar a sos-
Hay que tener en cuenta que la enzima sufre el pechosos utilizando muestras extremadamente pe-
efecto meseta que describe la atenuacin en la tasa queas de material biolgico encontrado en la es-
de la acumulacin del producto, reflejndose esto cena del crimen.36
en que despus de un nmero determinado de ci- En microbiologa, la PCR permite identificar al
clos la amplificacin deja de comportarse de mane- agente infeccioso independientemente de su respues-
ra exponencial, volvindose aritmtica, y finalmente ta serolgica, lo que representa una gran ventaja
llega a una fase estacionaria. Afortunadamente, en casos donde los anticuerpos aparecen luego de
cuando el efecto meseta se presenta, la cantidad de un largo perodo de infeccin y a veces en forma
ADN sintetizado es suficiente para su posterior utili- impredecible. Tambin en aquellos numerosos ca-
zacin.26,27 sos donde se quiere distinguir si la presencia de an-
ticuerpos es seal de infeccin antigua o activa,
Evolucin de la tcnica como ocurre ante el hallazgo de anticuerpos contra
el virus de la hepatitis C, y la necesidad de precisar
La tecnologa de la PCR est experimentando conti- si el virus est presente o no.37
nuas mejoras.28,29 Por ejemplo, y como ya se hizo Tambin es de gran utilidad en el diagnstico de
referencia arriba, ahora es posible utilizar enfermedades virales neonatales, donde el diagns-
eficientemente el ARN como substrato, ya que la ADN tico serolgico de la infeccin es generalmente en-
polimerasa rTth tambin posee actividad de retro- mascarado por la presencia de anticuerpos mater-
transcriptasa, y, por ende, convierte el ARN a ADNc, nos circulantes.38
y acto seguido lo amplifica.23 Otra de sus aplicaciones es en el estudio del com-
Como se ha mencionado anteriormente, el ADN plejo mayor de histocompatibilidad que determina
blanco que se va a amplificar suele tener una longi- los antgenos conocidos como molculas HLA de
tud mxima a las 3000 bases. Pues bien, ya es co- clase II, que son las que establecen la compatibili-
mn emplear la tcnica de PCR larga, capaz de dad en transplante de rganos.39
amplificar secuencias de hasta 40,000 bases de lon- La PCR permite estudiar no slo organismos vi-
gitud, lo cual facilita el desarrollo de proyectos vos, sino tambin sus restos fsiles, congelados o
genmicos.30,31 momificados. Incluso se puede partir de ADN de
Otro claro ejemplo de la sofisticacin de esta especies diferentes, y mediante el empleo de inicia-
reaccin es su versin en tiempo real, que permite dores consenso lograr la amplificacin de secuen-
cuantificar con una alta confiabilidad la concentra- cias gnicas de una especie cuya secuencia del gen
cin de hasta mltiples substratos presentes de una de inters es an desconocida.40
reaccin, en virtud de que cada cadena copiada Tambin puede servir para medir la expresin de
genera una seal fluorescente de longitud de onda un determinado gen. Para ello se extrae ARN men-
distinta que es medida al instante por el mismo sajero, se le practica una retrotranscripcin con la
termociclador de tiempo real.32 que se obtiene un ADNc, y ste se utiliza como ma-
terial de partida para la amplificacin. Al partir de
Aplicaciones ARNm en vez de ADN genmico, se est estimando
la expresin de un determinado gen que incluso pude
Las aplicaciones de la PCR son mltiples, abarcando llegar a realizarse de una manera semicuantitativa.41
desde la evolucin hasta la clnica, pasando por la
gentica, la biologa molecular y la biotecnologa; Diagnstico de enfermedades
amn de aplicaciones en la agricultura y la ganadera. hereditarias
La PCR es especialmente til en la deteccin de
enfermedades genticas tales como la fibrosis Un fragmento obtenido por PCR puede ser utilizado
quistica,33 la hemofilia clsica34 y las distrofias mus- directamente para clonacin, para ser secuenciado,
en la que muchas veces el tratamiento emprico tie- hasta millones de aos de antigedad), extrayendo
ne que iniciarse antes del diagnstico definitivo, el ADN de piezas que se encuentren en los museos
apoyndose hasta hace poco nicamente en el cua- (figura 11). 68
dro clnico.60 Tambin se han realizado estudios de evolucin
Mediante el PCR es posible amplificar secuen- entre poblaciones humanas, llegando a la conclu-
cias correspondientes al virus o a la bacteria de una sin del origen africano de nuestra especie, gracias
manera especfica y muy sensible, pudiendo llegar a al estudio del ADN mitocondrial.69
detectar un microbio entre 106 clulas infectadas con
agentes infecciosos como el del SIDA,61 hepatitis B,62 Biotecnologa y ciencias agropecuarias
tuberculosis,61 herpes,63 brucelosis,64 malaria,65 etc.
Dentro del campo del SIDA se est utilizando para La PCR tambin ha facilitado la obtencin y, de paso,
el diagnstico prenatal, y para cuantificar la carga y la modificacin (va oligonucletidos mutagnicos)
la actividad viral mediante la obtencin de ADNc y de secuencias gnicas para su integracin en vecto-
amplificacin de secuencias especficas del virus. Esto res de expresin, dndole mayor versatilidad a las
ltimo se utiliza para dar seguimiento del xito de tcnicas de ingeniera gentica que han hecho posi-
los tratamientos. ble la biotecnologa moderna.71 Igualmente, es la
base de mtodos para diferenciar variedades vege-
Estudios de evolucin molecular tales, as como para identificar si un organismo, ya
sea animal o vegetal, corresponde a uno gentica-
La PCR ha sido utilizada para generar secuencias mente modificado.72
de genes a lo largo de la evolucin y establecer el Pero quiz el mayor impacto en las ciencias
grado de relacin entre especies y poder construir agropecuarias se ha dado en el campo diagnsti-
as rboles filogenticos.66,67 La homologa se mide co, donde la PCR es la base de innumerables mto-
comparando cambios nucleotdicos en el mismo gen dos de deteccin de plagas73 y parsitos.74
entre diferentes especies o por comparacin de ge- Finalmente, tambin se ha visto cmo en aos
nes mitocondriales que no se recombinan durante recientes, mtodos de PCR para determinar la huella
la meiosis y tienen un alto porcentaje de puntos de gentica en humanos, son ahora aplicados con
mutacin. Incluso se pueden estudiar especies ex- xito en el ganado.75
tintas o fsiles (se ha logrado amplificar ADN de
Recomendaciones
Hasta aqu todo parece un camino sin obstculo
alguno, en el que la PCR ha podido sustituir a mu-
chas tcnicas dando mayor especificidad y sensibili-
dad. Pero precisamente esto ltimo es su principal
problema. Su gran sensibilidad se ha vuelto en su
contra, pues, por pequea que sea la menor conta-
minacin de la muestra inicial, puede tener serias
consecuencias. Si el ADN de partida se contamina,
se amplificarn tambin estas contaminaciones. Una
fuente de contaminacin importante puede ser el
ADN del propio operario o el disperso en el am-
biente. As, se han dado casos en ensayos de anli-
sis de sexo en que el propio operario varn ha con-
taminado la muestra o en anlisis de fsiles donde
ha aparecido ADN humano; lo mismo en anlisis
forenses donde la muestra se ha contaminado. Pero
la principal fuente de contaminacin son los pro-
Fig. 11. Estudios de evolucin. Los fsiles encontrados se pios productos de reacciones anteriores: cualquier
convierten en fuentes de material gentico confiables para fragmento amplificado puede contaminar nuevas
realizar estudios evolutivos a manera molecular.70 muestras y ser de nuevo amplificado. Para intentar
evitar estos falsos positivos, siempre deben tenerse ment of interest is duplicated even more. Thus, it re-
en cuenta las siguientes normas: deben separarse sults in millions of copies of the specific DNA se-
en el espacio y en el tiempo las etapas de preampli- quence, even if it is part of a complex DNA mix. 20
ficacin y amplificacin; siempre deben utilizarse years after its invention, the PCR is catalogued as
testigos negativos, donde en lugar de poner ADN se the star tool of molecular biology. In the present time,
substituya su volumen por agua. Adems, las mues- its application in biological, farming, and health sci-
tras deben ser analizadas -por lo menos- por dupli- ences are innumerable.
cado. Jams deben almacenarse productos de PCRs
con muestras biolgicas que servirn de substratos Keywords: Taq DNA polymerase, Oligonucleotide
o de reactivos. Igualmente, se recomienda no usar primers, PCR, Amplicons.
un alto nmero de ciclos, ya que la tasa de error es
proporcional al nmero de stos.76 Agradecimientos
Los anteriores riesgos y limitaciones son el ver-
dadero problema que ha impedido que la PCR se La presente revisin se model tomando en cuenta
haya popularizado an ms, despus de todos es- un sinnmero de acertadas opiniones provenientes
tos aos, como la tcnica nica para muchas prue- de amigos y colegas de la ULIEG, as como de los
bas de diagnstico. Hoy por hoy existe la alta posi- revisores de la misma, con quienes estamos agra-
bilidad de falsos positivos. decidos.
Como se puede apreciar, las aplicaciones de esta
novedosa tcnica parecen no tener lmites, pues en Dedicatoria
esencia el proceso permite, como se ha dicho, en-
contrar una aguja en un pajar, al generar un segun- Los autores desean dedicar este trabajo al profesor
do pajar lleno de copias de dicha aguja. Robert M. Chandler Burns, como un homenaje ps-
tumo por sus dos dcadas de innumerables e
Resumen invaluables revisiones a los manuscritos de la ULIEG
para revistas internacionales.
La PCR, tcnica inventada por Kary B. Mullis en
1983, emplea un par de oligonucletidos para de- Referencias
limitar una regin de inters y una polimerasa para
extenderlos, utilizando ambas hebras del gen en 1. Barrera Saldaa HA. Informacin gentica: es-
cuestin como plantilla. Al repetir este ciclo dece- tructura, funcin y manipulacin. Conacyt, Co-
nas de veces, se duplica cada vez el fragmento de leccin Ciencia Bsica. Mxico. 1992.
ADN en cuestin. As se logra copiar millones de 2. Barrera Saldaa HA, Ortiz Lpez R, Rojas Mart-
veces la secuencia de inters, aunque se encuentre nez A Resndez Prez D. Reaccin en cadena de
entre millones de otras secuencias de ADN. la polimerasa: Una nueva poca dorada en la bio-
A 20 aos de su invencin, la PCR se cataloga como loga molecular. Ciencia y Desarrollo, (Conacyt)
la estrella de las herramientas de la biologa mole- 1993; 18 (108): 50-60.
cular. En la actualidad son innumerables las aplica- 3. Mullis KB. The unusual origin of the polymerase
ciones de su utilizacin en mltiples campos de las chain reaction. Sci Am. 1990; 262 (4): 56-61,
64-5.
ciencias biolgicas, agropecuarias y de la salud.
4. Templeton NS. The polymerase chain reaction.
History, methods, and applications. Diagn Mol
Palabras clave: Taq ADN polimerasa, Oligonucle-
Pathol. 1992; 1 (1): 58-72.
tidos cebadores, PCR, Amplicones. 5. Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G,
Erlich H. Specific enzymatic amplification of DNA
Abstract in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring
Harb Symp Quant Biol. 1986; 51 (1): 263-73.
The PCR, a technique invented by Kary B. Mullis in 6. Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi
1983, uses a pair of oligonucleotides to flank a gene R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA. Primer-directed
region of interest and a polymerase to extend them, enzymatic amplification of DNA with a thermostable
using both strands of the gene as the template. By DNA polymerase. Science. 1988; 239 (4839):
repeating this cycle dozens of times, the DNA frag- 487-91.
7. Bertrand O, Delfau MH, Garbarz M, Picat C, 21. Lundberg KS, Shoemaker DD, Adams MW, Short
Devaux I, Dhermy D, Boivin P, Grandchamp B. An JM, Sorge JA, Mathur EJ. High-fidelity amplification
efficient laboratory made apparatus for DNA using a thermostable DNA polymerase isolated
amplification. J Biochem Biophys Methods. 1989; from Pyrococcus furiosus. Gene. 1991; 108 (1):
18 (3): 227-35. 1-6.
8. Wittbrodt J, Erhardt W. An inexpensive and versatile 22. Diaz RS, Sabino EC. Accuracy of replication in the
computer-controlled PCR machine using a Peltier polymerase chain reaction. Comparison between
Element as a thermoelectric heat pump. Trends Thermotoga maritima DNA polymerase and
Genet. 1989; 5 (7): 202-3. Thermus aquaticus DNA polymerase. Braz J Med
9. http://www.brinkmann.com/pdf/bs-manuals/ Biol Res. 1998; 31 (10): 1239-42.
mastercycler_gradient.pdf 23. Myers TW, Gelfand DH. Reverse transcription and
10. Baumforth KR, Nelson PN, Digby JE, ONeil JD, DNA amplification by a Thermus thermophilus DNA
Murray PG. Demystified ... the polymerase chain polymerase. Biochemistry. 1991; 30 (31): 7661-
reaction. Mol Pathol. 1999; 52 (1): 1-10. 6.
11. Pomp D, Medrano JF. Organic solvents as 24. Juhasz A, Ravi S, OConnell CD. Sensitivity of
facilitators of polymerase chain reaction. tyrosinase mRNA detection by RT-PCR: rTth DNA
Biotechniques. 1991; 10 (1): 58-9. polymerase vs. MMLV-RT and AmpliTaq
12. Brownie J, Shawcross S, Theaker J, Whitcombe D, polymerase. Biotechniques. 1996; 20 (4): 592-
Ferrie R, Newton C, Little S. The elimination of pri- 600.
mer-dimer accumulation in PCR. Nucleic Acids Res. 25. Vosberg HP. The polymerase chain reaction: an
1997; 25 (16): 3235-41. improved method for the analysis of nucleic acids.
13. Rose TM, Schultz ER, Henikoff JG, Pietrokovski S, Hum Genet. 1989; 83 (1): 1-15.
McCallum CM, Henikoff S. Consensus-degenerate 26. Kainz P. The PCR plateau phase - towards an
hybrid oligonucleotide primers for amplification of understanding of its limitations. Biochim Biophys
distantly related sequences. Nucleic Acids Res. Acta. 2000; 1494 (1-2): 23-7.
1998; 26 (7): 1628-35. 27. Morrison C, Gannon F. The impact of the PCR
14. Gorelenkov V, Antipov A, Lejnine S, Daraselia N, plateau phase on quantitative PCR. Biochim
Yuryev A. Set of novel tools for PCR primer design. Biophys Acta. 1994; 1219 (2): 493-8.
Biotechniques. 2001; 31 (6): 1326-30. 28. Sariola H. Polymerase chain reactionfrom fiction
15. Smith M. Applications of synthetic to fact and from fact to fiction. Duodecim. 1993;
oligodeoxyribonucleotides to problems in molecu- 109 (23-24): 2195-6.
lar biology. Nucleic Acids Symp Ser. 1980; (7): 29. Stolovitzky G, Cecchi G. Efficiency of DNA
387-95. replication in the polymerase chain reaction. Proc
16. http://www.beckmancoulter.com/Literature/ Natl Acad Sci U S A. 1996; 93 (23): 12947-52.
BioResearch/1793A(T).pdf 30. Cheng S, Fockler C, Barnes WM, Higuchi R.
17. Henke W, Herdel K, Jung K, Schnorr D, Loening Effective amplification of long targets from cloned
SA. Betaine improves the PCR amplification of GC- inserts and human genomic DNA. Proc Natl Acad
rich DNA sequences. Nucleic Acids Res. 1997; 25 Sci U S A. 1994; 91 (12): 5695-9.
(19): 3957-8. 31. Barnes WM. PCR amplification of up to 35-kb DNA
18. Jin C, Liu H, Yang S, Zhang S. Cloning and with high fidelity and high yield from lambda
overexpression of thermostable DNA polymerase bacteriophage templates. Proc Natl Acad Sci U S
gene in Escherichia coli. Chin J Biotechnol. 1995; A. 1994; 91 (6): 2216-20.
11 (3): 185-91. 32. Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R.
19. Cariello NF, Swenberg JA, Skopek TR. Fidelity of Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA
Thermococcus litoralis DNA polymerase (Vent) in amplification reactions. Biotechnology (N Y). 1993;
PCR determined by denaturing gradient gel 11 (9): 1026-30.
electrophoresis. Nucleic Acids Res. 1991; 19 (15): 33. Rojas Martnez A, Vzquez Alemn RM, Gustincich
4193-8. S, Cantu JM, Barrera Saldaa HA. Genetica mo-
20. Longley MJ, Bennett SE, Mosbaugh DW. lecular de la fibrosis quistica: El alelo f508 en
Characterization of the 5' to 3' exonuclease familias mexicanas. Bol Med Hosp Infant Mx.
associated with Thermus aquaticus DNA 1992; 49 (6): 335-341.
polymerase. Nucleic Acids Res. 1990; 18 (24): 34. Rojas Martnez A, Villalobos Torres MC, Ortiz de
7317-22. Luna RI, Pompa Garza MT, Barrera Saldana HA.
Marushko TV, Iehipko HV. Characteristics of tnez Dvila I., Barrera Saldaa HA. Expansion and
modern diagnosis of diseases caused by Chlamydia divergence of the GH locus between spider monkey
bacteria. Lik Sprava. 2002; (7): 3-6. and chimpanzee. Gene. En prensa
57. Alexiou-Daniel S, Stylianakis A, Papoutsi A, Zorbas 67. Revol de Mendoza A, Esquivel Escobedo D, San-
I, Papa A, Lambropoulos AF, Antoniadis A. tiago Alarcn D, Barrera Saldaa H. Independent
Application of polymerase chain reaction for duplication of the growth hormone gene in three
detection of Legionella pneumophila in serum anthropoidean lineages. JEG. 2001; 2: 151-159.
samples. Clin Microbiol Infect. 1998; 4 (3): 144- 68. Handt O, Richards M, Trommsdorff M, Kilger C,
148. Simanainen J, Georgiev O, Bauer K, Stone A,
58. Bernet C, Garret M, de Barbeyrac B, Bebear C, Hedges R, Schaffner W, et al. Molecular genetic
Bonnet J. Detection of Mycoplasma pneumoniae analyses of the Tyrolean Ice Man. Science. 1994;
by using the polymerase chain reaction. J Clin 264 (5166): 1775-8.
Microbiol. 1989; 27 (11): 2492-6. 69. De Benedetto G, Nasidze IS, Stenico M, Nigro L,
59. Sritharan V, Barker RH Jr. A simple method for Krings M, Lanzinger M, Vigilant L, Stoneking M,
diagnosing M. tuberculosis infection in clinical Paabo S, Barbujani G. Mitochondrial DNA
samples using PCR. Mol Cell Probes. 1991; 5 (5): sequences in prehistoric human remains from the
385-95. Alps. Eur J Hum Genet. 2000; 8 (9): 669-77.
60. Matsumoto T, Yamaguchi K. Rapid diagnosis of 70. http://amberforsale.com/Fossil_Amber_Gallery/
infectious diseases at the site of outpatient clinics Insects.htm
Rinsho Byori. 2002; 50 (5): 468-73. 71. Escamilla Trevio LL, Viader Salvad JM, Barrera
61. Laure F, Courgnaud V, Rouzioux C, Blanche S, Saldana HA, Guerrero Olazarn M. Biosynthesis
Veber F, Burgard M, Jacomet C, Griscelli C, and secretion of recombinant human growth
Brechot C. Detection of HIV1 DNA in infants and hormone in Pichia pastoris. Biotechnology letters.
children by means of the polymerase chain 2000; 22 (2): 109-114,
reaction. Lancet. 1988; 2 (8610): 538-41. 72. Mendoza A, Fernndez S, Cruz MA, Resndez Prez
62. Kaneko S, Miller RH, Di Bisceglie AM, Feinstone D, Barrera Saldaa HA. Detection of genetically
SM, Hoofnagle JH, Purcell RH. Detection of hepa- modified maize food products by the polymerase
titis B virus DNA in serum by polymerase chain chain reaction. Journal of Food and drugs Analysis.
reaction. Application for clinical diagnosis. Enviado.
Gastroenterology. 1990; 99 (3): 799-804. 73. Mendoza A, Salazar C, Alvarado O, Cruz MA,
63. Fras C, Matas L, Ferre X, Milln M, Marti S, Her- Barrera HA. Molecular differentiation of weak and
nndez A, Ausina V. Usefulness of adding multiplex severe citrus tristeza virus insolates in Mxico. Rev.
nested-polymerase chain reaction assay of Fitotec. Mx. 2003; 26 (4): 223-230
cerebrospinal fluid samples to routine diagnostic 74. Rodrguez-Prez MA, Lilley BG, Domnguez-
testing for herpesvirus encephalitis.Eur J Clin Vzquez A, Segura-Arenas R, Lizarazo-Ortega C,
Microbiol Infect Dis. 2001; 20 (9): 670-2. Mendoza-Herrera A, Reyes-Villanueva F, Unnasch
64. Sifuentes Rincn AM, Revol A, Barrera Saldaa HA. TR. Polymerase chain reaction monitoring of
Detection and differentiation of the six Brucella transmission of Onchocerca volvulus in two
species by polymerase chain reaction. Mol Med. endemic states in Mxico. Am J Trop Med Hyg.
1997; 3 (11): 734-9. 2004; 70 (1): 38-45.
65. Craig MH, Bredenkamp BL, Williams CH, Rossouw 75. Cunningham EP, Meghen CM. Biological
EJ, Kelly VJ, Kleinschmidt I, Martineau A, Henry identification systems: genetic markers. Rev Sci
GF. Field and laboratory comparative evaluation Tech. 2001; 20 (2): 491-9.
of ten rapid malaria diagnostic tests. Trans R Soc 76. Dunning AM, Talmud P, Humphries SE. Errors in
Trop Med Hyg. 2002; 96 (3): 258-65. the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res.
66. Revol de Mendoza A., Esquivel Escobedo D., Mar- 1988; 16 (21): 10393.