Acta Microscopica Vol 16 No1-2,(Supp.

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Cusco-Peru September 2007

DETERMINACION in vitro DE LA RESPUESTA CELULAR DE LOS

HEMOCITOS DE LA LANGOSTA Cherax quadricarinatus
ESTIMULADOS CON ANTIGENOS.
Yohana Belen Carbajal Nava1 , Luis Fernando Cruz Garca1, Edgar Zenteno Galindo2, Ma. Concepcin
Agundis Mata2 , Juan Alpuche2, Claudia Sierra Castillo1,3 , Laboratorio de Biologa Celular1, Facultad de
Ciencias Biolgicas UAEM. Laboratorio de Inmunologa,3 Dpto. de Bioqumica, Facultad de Medicina
UNAM2. Laboratorio de Bioingeniera Acucola,3 Centro de Investigaciones Biolgicas UAEM.
Av. Universidad 1001. Col. Chamilpa. Cuernavaca Fax: 329-7047 Ext. 3532 e-mail
yohana_belen@yahoo.com.mx; clau_sierra@yahoo.com.mx.

Introduccin: Todos los organismos en cultivo constantemente son sometidos a condiciones de estrs;
por lo tanto, son ms susceptibles a adquirir enfermedades afectando su desarrollo, crecimiento y
reproduccin. El tejido que puede proporcionar informacin acerca del estado de salud del organismo es
el sanguneo, constituido por la hemolinfa en invertebrados, el cual comunica a todo el organismo
desempeando mltiples funciones facilitando conocer su fisiologa y metabolismo. La fase liquida
transporta desechos, factores humorales, oxgeno, nutrientes y hormonas a todo el cuerpo y a los
hemocitos que se han considerado anlogos a los leucocitos de mamferos debido a las funciones que
realizan en el mecanismo de defensa como parte de la respuesta inmune innata, participando en el
reconocimiento, destruccin de materiales extraos y la participacin en la coagulacin de la hemolinfa.
Los mecanismos de defensa celulares que presentan los crustceos son: la fagocitosis, que consiste en la
eliminacin directa de partculas extraas o clulas envejecidas del propio organismo [1], que en
colaboracin con los factores humorales son considerados la primera lnea de defensa inmune [2]. Otros
mecanismos celulares que participan en la defensa del organismo es la nodulacin, que consiste en la
liberacin de sustancias citotxicas y pegajosas hacia el agente extrao, y la encapsulacin proceso en el
cual los hemocitos cubren la partcula extraa formando capas alrededor de ella provocando su muerte,
este proceso es normalmente acompaado de la melanizacin [3]. Se ha descrito que los hemocitos
fagociticos son los granulocitos, mientras que los hialinocitos se encargan de la coagulacin, la
nodulacin y encapsulacin se lleva a cabo por los semigranulocitos [4]. Estos estudios acerca de la
actividad de los hemocitos generalmente se han realizado por microscopia confocal, Normaski,
electrnica de barrido y de transmisin. Sin embargo, con la nueva clasificacin que hemos propuesto
para los hemocitos de la langosta Cherax quadricarinatus en frotis de hemolinfa, basados en mtodos de
Romanowsky sabemos que los granulocitos se dividen en tres grupos y dos subgrupos y los
agranulocitos en dos grupos de nucleocitos grandes y los nucleocitos pequeos [5]. Por lo tanto en base
a esta clasificacin, identificamos la actividad biolgica de clulas adherentes por la tincin de Wright.
Justificacin: La langosta Cherax quadricarinatus presenta una fcil adaptacin al medio ambiente, por
lo que esta especie es explotada econmicamente. En base a la importancia que representa el mecanismo
de defensa en organismos de inters econmico en la acuacultura, con la nueva clasificacin de los
grupos celulares de la hemolinfa por medio de frotis obtenemos informacin especifica de cada clula;
la cual, nos ha servido para determinar su actividad y de esta manera fundamentar los procesos celulares
que participan en la respuesta inmune innata.
Objetivo General: Determinar la funcin biolgica de los diversos grupos celulares de C.
quadricarinatus como antgeno para estimular la respuesta celular de los hemocitos, utilizando
eritrocitos de rata, conejo, vbora y carbn activado.
Metodologa: Las langostas se colectaron en El compartidor las peitas Jojutla, Morelos, se extrajo
1ml de hemolinfa de la zona pericrdica de la langosta, se centrifugo a 560 xg, el conteo de clulas se
realizo con el hemocitometro. Para la observacin de la respuesta celular, se utilizaron portaobjetos de
vidrio, plstico y vidrio tratados previamente con Poli-L-lisina, a los que se colocaron 50 l de clulas
suspendidas y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente, las clulas adherentes se
estimularon con diferentes eritrocitos de rata, conejo, vbora o carbn activado al 2% dejndose incubar
durante 30min. La fijacin se realizo con parafolmaldheido al 4 % durante 1 hora a 4 C. Se dejo secar y
se contrasto con colorante de Wright para la observacin en microscopio de luz; el anlisis por
microscopio de contraste de fases se realizo con muestras sin tincin.
Resultados: En base a la clasificacin de los hemocitos de la langosta por el mtodo Romanowsky (Fig.
1), se determino la participacin de cada grupo celular en la fagocitosis, nodulacin y encapsulacin con
los diferentes antgenos que se muestran en la tabla 1. Ante los eritrocitos de rata la funcin principal
fue la fagocitosis (Fig. 2), con los de conejo la nodulacin y escasa fagocitosis (Fig. 3) y la
encapsulacin fue activada por los eritrocitos de vbora (Fig. 4), a diferencia del carbn activado donde
la respuesta celular se observa considerablemente disminuida en la fagocitosis y nodulacin, lo que
indica que el reconocimiento a nivel membrana es fundamental para que se lleven a cabo estos procesos.
Por otra parte, este mtodo nos permite definir que tipo especifico de granulocito o agranulocito lleva a
cabo estas funciones, ya que anteriormente se reporta que los granulocitos realizan la fagocitosis, pero
no indica el contenido granular del hemocito o que tipo de granulocito leva a cabo la funcin. Otra
informacin que nos permiti observar el mtodo de Romanowsky es que el vidrio estimula la
degranulacin basfila llevada a cabo por los basofilocitos y en el plstico se activa la degranulacin
acidfila por los eosinocitos, probablemente al ser activada por la carga de la superficie adherente.

A B C D E

Figura 2. Fagocitosis de los Figura 3. Nodulacin.

F G H hemocitos de la langosta Liberacin de material
Cherax quadricarinatus. celular hacia el
Microscopia de Luz, 100 X. eritrocito. Microscopia
Figura 1. Clasificacin de los hemocitos de la langosta Cherax de Luz 100X.
quadricarinatus en base a la tincin de Wright. A) Neutrocitos, B)
Eosinocito, C) Basofilocito, D) Nucleocito Grande de ncleo rosa,
E) Nucleocito Pequeo de ncleo azul. F) Eosinocito con grnulos
pequeos G) Basofilocito con grnulos pequeos y H) Nucleocito
Grande de ncleo azul. Microscopia de luz 100 X. D

Figura 4. Encapsulacin ante la presencia de los

eritrocitos de vbora. A) Reconocimiento del eritrocito
a nivel membrana y D) Capas de hemocitos que
presentan principalmente basofilia. Microscopia de Luz
100 X.

FAGOCITOSIS NODULACIN ENCAPSULACIN

ERITROCITO Neutrocitos No se observo No se observo

RATA predominante Tabla 1. Actividad de los hemocitos en
respuesta ante los estmulos por
ERITROCITO Neutrocitos Eosinocitos No se observo eritrocitos de rata, conejo, vbora y
CONEJO escasos principalmente carbn activado. Se seala el tipo de
hemocito que lleva a cabo la actividad
ERITROCITO No se observo No se observo Neutrocitos biolgica y su predominancia.
VBORA principalmente
CARBN Neutrocitos No se observo No se observo
ACTIVADO escasos

Conclusines:La informacin que aportan los mtodos tradicionales para la clasificacin y

caracterizacin de los hemocitos de invertebrados son importantes desde el punto de vista morfometrico
y funcional, a partir de ellos y con el mtodo de Romanowsky obtuvimos informacin especifica de la
funcin de cada grupo celular, como resultado a la reaccin de los componentes celulares con los
componentes neutros de la tincin de Wright. Con nuestros resultados, se fundamenta la funcin de los
hemocitos identificados en frotis de hemolinfa, lo que nos permite proponerlo como un mtodo modelo
para la identificacin de los hemocitos de crustceos y a futuro pueda aplicarse como una alternativa de
diagnostico en organismos de cultivo. Por otra parte, nos permiti determinar que la reaccin a la tincin
de los hemocitos con respecto a los leucocitos de vertebrados se conserva evolutivamente en la respuesta
inmune innata.
Literatura citada:
[1].- Millar D. and Ratcliffe. N. Invertebrates. Immunity: A comparative Approach. 29-31. (1994).
[2].-Sderhll K. and L. Cerenius. Crustacean immunity. Annual Review of Fish Diseases 1:3-3. (1992).
[3].-Amirante, G. Cellular immune responses in crustaceans. Hemocytic and humoral immunity in arthropods.
Edited by Grupta, A.P., J. Wiley & Sons, Inc. 61-75. (1986).
[4].-Martin G. G. and J. E. Hose. Vascular Elements and Blood (Hemolymph). In F. W. Harrison and A.G. Humes
(eds). Decapod Crustacea. N. Y. Wiley- Liss. Microscop. Anat. Inv10:117-146. (1992).
[5].- Cruz G. L. F. Caracterizacin de los hemocitos de la langosta Cherax quadricarinatus. Tesis de licenciatura.
Facultad de Ciencias Biolgicas de la Universidad Autnoma del Estado de Morelos. (2007).