ARTICULOS TECNICOS
La determinacin de la biomasa es Determinacin de la biomasa
uno de los problemas que se presenta
en muchos procesos biolgicos.
Existen diversos mtodos, directos e
indirectos, que se han desarrollado
usando tcnicas fsicas y bioqumi-
cas. En este trabajo se describen algu-
nos de ellos, destacando sus ventaias
e inconvenientes.
Pqlqbrqs clqve:
Determinacin de la biomasa, com-
ponentes celulares especficos, mto-
dos bioqumicos, mtodos cinticos,
mtodos directos, mtodos indirec-
tos, mtodos de recuento, procesos
biolsicos
Determining biomass in biologcal
processes,
Direct and indirect methods.
Evaluation of biomass concentra-
tion is an important problem encoun-
tered in many microbial and othe
bioprocesses. Many direct and indi-
rect methods have been developed
using physical and biochemicai tech-
niques. In this work various methods
are discussed taking into the conside-
ration their practical importance, use-
fulness and constrains in application.
Keywords:
Biochemical methods, biomass eva-
Iuation, bioprocesses, counting met-
hods, direct methods, indirect met-
hods, kinetic methods, cellular speci-
fic componenis'
en procesos biolgicos
l. Mtodos directos e indirectos
Por: Carmen Arniz, Laura Isac y Julin Lebrato
Grupo de Tratamiento de Aguas Residuales. Escuela Universitaia Politcnrca.
Universidad de Sevilla. C/. Virgen de Africa, 7. 410).1 Sevilla.
I
Tel. / Fax: 954 55 28 48 954 28 27 11 . E-mail: lebrato@cica.es
l. lntroduccin
T a determinacin de la biomasa
I .t una de las variables ms im-
I / portantes de un bioproceso. ya
que su determinacin nos lleva a la
comprensin de la eficiencia del
mismo. Se trata de una variable clave
para establecer las tasas de produc-
cin, de consumo de nutrientes y el
clculo de los balances de masa de
cualqu ier proceso biolgico.
Los mtodos clsicos de deter-
minacin de biomasa son mtodos
directos que se basan en el nmero
de clulas o en el peso celular. Los
mtodos de enumeracin celular
son mtodos de observacin, basa-
dos en propiedades fsicas o en la
actividad biolgica. Actualmente
hay un gran inters en mtodos al-
ternativos de determinacin de Ia
biomasa. Estos mtodos son indi-
rectos y estiman algn componente
celular o alguna actividad metab-
lica especfica. No requieren el
examen visual de los organismos ni
su incubacin. En la Figura 1 se
muestra un resumen esouemtico
de los distintos mtodos de deter-
minacin de 1a biomasa.
2. Mrodos directos de
determinocin de lo biomosq
2,1. Mtodos grovimtricos
La cantidad total de biomasa pre-
sente en una muestra puede medirse
en lrminos de peso seco por uni-
dad de volumen, ya sea como sli-
dos en suspensin totales (SST) o
slidos en susoensin voltiles
(SSV). Las clulis se separan del l-
quido bien por centrifugacin bien
por filtracin.
La principal desventaja de estas O
tcnicas es que su determinacin in-
cluye no sio microorganismos ac- c\
tivos sino microorganismos muer- LLI
ua
tos, material inerte, polmeros ex- cO
tracelulares y materia orgnica ad- l
F-
sorbida. Adems, no puede aplicar- U
se cuando los sustratos a degradar
o
son insolubles. rr)
Los mtodos gravimtricos son c\
simpies, pero consumen bastante
tiempo y son poco reproducibles. EFI
-,f -
'I'ECNOLOGIA DEL AGUA
-
 i

ARTIEULOS TEChleo5

Mtodos de determinocin de lo biomosq

Mtodos directos
Mtodos grovimiricos
Mtodos espectrofofomtri cos
Miodos microscpicos de recuenio celulqr en cmoros
Microscopo de epifl uorescencio Noronio de ocridino, DAPI, queloto de europio, Mg-'A'NS
CTC, SFDA

FISH

Mtodos de siembro
Mtodos indirectos

Miodos fsico-qumicos indi rectos: COT, DQO

Componenfes celulores cidos nucleicos
Proteinos

Polisocridos
Lpidos

ATP

Mtodos bioqumicos Actividod esteroso

Actividod deshidrogenoso

Mtodos cinticos Adoptociones del Respirmeiro de Worburg

Tosq de respirocin

Toso de desoporicin de sustroto

Poienciol bioqumico de produccin de metono

Mtodos en continuo
Fig. 1. Esquemo de los disiintos mtodos de deferminocin de lo biomoso

de tal parmetro a partir de una sola por la profundtdad, obtenindose el

2,2, Mtodos
esPeclrof otomtricos medida de la turbidez. nmero de micrt-rorganismos Por
Se basan en la existencia de tlna Se trata de mtodos rPidos, Pero unidad de volumen (nrrnero de c-
r, generalmente).
relacin directa entre el nmero to- de baja sensibilidad y que presentan lulas.ml
problemas de calibracin (tiPo de El recuento de microorganismos
tal de microorganisn-los Presentes
cultivo, medio de cultivo) y de inter- en cmaras no es un mtodo muY
en una nlllestra y stl valor de turbi-
ferencias con partculas. exacto debido a las irregularidades
dez. Tras la determinacin de la tur-
bidez de la suspensin celular me- en la distribucin de la muestra.
O Adems. pueden confundirse las c-
O diante espectrofotometra, el resul- 2,3, Mtodos microscPicos
c\ de recuenlo celular en lulas con otras formas orgnicas e
taclo se expresa en unidades de ab-
cmoras inorgnicas existentes en el medio y
U sorbancia. Sin embargo, antes de
M
1a turbidez como mtodo de Existen diversos tiPos de cma- no permite distinguir clulas vivas
cO utilizar
l f as pafa el recttento de rnicroorga- de clulas muertas.
reclrento, hay que tealizar una recta
(, de calibrado qLre relacione medidas nismos tales como la cmara de
o directas (microscPicas, Por re- Neubauer. Thoma, Brker, Ttirk, 2.4. Mtodos microscPicos
rr) cuento en placa o Pcso seco) con las Fuchs-Rosenthrl, Mal assez, Petroff medianle epifluorescencid
O ttrser, etc. El recuenlo de microol'- La microscoPa de ePifluores-
C\ indirectas de 1a turbidez. Esta recta H
contiene datos sobre el ntmero de ganismos se realiza en la cuadrcula cencia comenz a emPlearse a Prin-
w cipios de los 70 Y hoY en da se con-
ffi central cle la cmara y se multiplica
ffi
clulas, permitiendo la estimacin

,f
IICNOI,OGIA I)IIL AGUA

sidera como uno de los mejores m-
todos para la estimacin de la bio-
masa. La epifluorescencia es debida
a un agente fluorocromo, a la adi-
cin de algn anticuerpo marcado
con fluorescencia (inmunofluores-
cencia) o a una autofluorescencia
natural debida a la existencia de al-
gn componente celular autofluo-
rescente.
Cuando la epifluorescencia se
debe a un agente fluorocromo, el
procedimiento consiste en la tincin
de las bacterias con dicho agente y
posterior recuento mediante mi-
croscopa ptica con iluminacin de
epifluorescencia. Los sustratos
fluorescentes o fluorocromos que se
han empleado para la observcin
directa de bacterias se clasifican en
dos grupos. En el primero de ellos
quedaran englobados aquellos
fluorocromos que tras ser adsorbi-
dos actan especficamente sobre
cidos nucleicos u otros componen-
tes celulares. El segundo incluira a
todos aquellos que tras ser sustratos
de una determinada actividad meta-
blica, son convertidos en molcu-
las fluorescentes.
AI primer grupo pertenecen los
principales fl uorocromos utilizados
para la estimacin de la poblacin
total de una muestra: el naranja de
acridina y el 4,6-diamidino-2-feni-
lindol (DAPI). Estos fluorocromos
permiten distinguir clulas de part-
culas e identificar bacterias no slo
por su color, sino tambin por su
forma y tamao.
El naranja de acridina colorea
tanto el ADN como eI ARN de las
clulas emitiendo a una longitud de
onda aproximada de 470 nm. Los
cidos nucleicos de hebra simple se
colorean de un color naranja-rojo
fluorescente, mientras que los de
doble hebra adoptan un color verde
fluorescente. EI fluorocromo DAPI
es un colorante especfico del ADN
y su pico de excitacin se encuentra
prximo a la regin ultravioleta
(365 nm). A pesar de las ventajas
que supone el uso de estos fluoro-
cromos, no permiten distinguir en-
tre las clulas muertas, metablica-
ARTICULOS TECNTCOS
mente inactivas, y las vivas, ya que
el ADN conserva sus propiedades
incluso en clulas muertas.
El quelato de europio, al igual
que el naranja de acridina o el DA-
PI, es un colorante especfico de
cidos nucleicos. Otros fluorocro-
mos como las sales de magnesio
del cido 1 -anilino-8-naftalensul-
fnico (Mg-ANS) tien principal-
mente componentes celulares co-
mo protenas, lpidos o membranas
celulares. En cambio, el comporta-
miento de estos agentes fluorocro-
mos es el comentado anteriormen-
te, sobrestiman el nmero de clu- cfica, y puede realizarse in situ.
las viables al no distinguir clulas
vivas de muertas.
En el segundo grupo quedaran
englobados fluorocromos como el
cloruro de 5-ciano-2,3-ditolil te-
trazolio (CTC, Rodrguez et al.,
1992) el 5- (y 6-) diacetato de
sulfofluorescena (SFDA, Tsuji et
al., 1995). Ambos fluorocromos, a
diferencia con los anteriores, dis-
tinguen bacterias metablicamen-
te activas de las que no lo son ne-
diante la observacin microscpi-
ca del producto fluorescente resul-
tado de Ia actividad metablica pa-
ra la que son especficos. En el ca-
so del CTC 1a actividad metablica
es la respiratoria y en el del SFDA
es la actividad esterasa. La epi-
fluorescencia basada en fluorocro-
mos como eI CTC y el SFDA pon-
dr de manifiesto aquellos micro-
organismos en los cuales estn
presentes dichas actividades meta-
blicas, pero sin cuantificarlas.
Salvando este obstculo se en-
cuentran las medidas bioqumicas
de determinacin indirecta de la
biomasa, que s cuantifican activi-
dades metablicas.
La epifluorescencia es un mto-
do simple y rpido. No obstante, su
reproducibilidad est cuestionada y
necesita un equipamiento relativa-
mente caro.
La fluorescencia mediante anti-
cuerpos marcados con agentes fluo-
rescentes est basada en las propie-
dades inmunolgicas de las clulas.
Es una tcnica muy sensible y espe-
La epifluorescencia
es un mtodo
Tambin puede llevarse a cabo me-
diante hibridacin de sondas fluo-
rescentes de ADN o ARN (Fluores'
cent in situ hybridization, FISH),
cadavezms utilizadas en Ecolosa
Microbiana.
2.5 Modos de siembro
El recuento de microorganis-
mos viables se fundamenta en la
capacidad de dichas clulas via-
bles de desarrollar una colonia vi-
sible en un medio de cultivo apro-
piado. En los recuentos.n piu.u
por vertido, un volumen de 0,1- I
ml de la suspensin microbiolgi-
ca se mezcla con el medio de culti-
vo fundido y parcialmente enfria-
do en una placa de Petri. En los re-
cuentos en placa por siembra en
superficie, se extiende un volumen
de aproximadamente 0,1 ml de la
suspensin sobre la superficie del
medio de cultivo. Los resultados
de los recuentos en placa se expre-
san como unidades formadoras de
colonia (UFC) por unidad de volu-
men de la suspensin microbiol-
gica. Para que el recuento sea esta- a)
dsticamente srgnificativo, el nl- O
mero de colonias deber estar c\
comprendido entre 30 Y 300 colo- LIJ
M
nias. En el caso de muestras mttY cO
_l
diluidas se puede emplear 1a filtra- F-
cin de membrana, en la que tras la
filtracin de la muestra es el filtro
el que es colocado finalmente so- rr)
O
bre el agar (Atlas, 1992). C\
Otro tipo de recttentos los consti-
tuyen aquellos que emPlean tln me-
ret
TECNOLOGIA DEL AGUA
Effi::::;:: -: ?-**::r :ea:
dio de cultivo lquido como es el ca-
so de la estimacin del nmero ms
probabie (NMP).
El recuento de microorganismos
viables se fundamenta en el desarro-
llo de una colonia visible a partir de
cada organismo viable. El principal
problema de este mtodo es que no
todas las bacterias presentes en una
muestra pueden crecer en el medio y
las condiciones de cultivo seleccio-
nado. Suelen ser, por tanto, mtodos
infraestimativos y estadsticamente
cuestionables (I .azarova y Manem,
r99s).
3. Mfodos indirectos de
determinqcin de lo
biomqsq
E,stos mtodos se basan funda-
mentalmente en la determinacin
de algn componente celular espe-
cfico, en la cuantificacin de algu-
na actividad enzimtica (mtodos
bioqumicos) o en la medida de
consumo de sustrato o de la forma-
cin de algn producto (mtodos
cinticos). Tambin se incluyen en
este apartado algunos mtodos fisi-
coqumicos.
Los mtodos bioqumicos y cin-
ticos determinan, ms que la viabili-
dad de las bacterias la actividad ya
que dependen ms del estado meta-
blico de los microorganismos que
de1 nmero de individuos.
3. l. Componenles celulares
especficos
Cualquier componente celular
seleccionado para 1a estimacin de
la biomasa viva de una muestra de-
be responder a tres criterios filnda-
mentales:
O o Estar presente nicamente en c-
O lulas vivas.
C\l
o Ser rpidarrente degradado
U cuando las clulas mueran.
M
CO Ser relativamente constante el.l
l
F- concentracin respecto a c1u.1-
bios en ei estado fisiolgico celu-
lal y entle distintas especies.
LO
Hasta el nromento, no exi\tc nrn-
O
C\ gn componente celular que cunpla
w estos tres requerimientos" Sin en-
rug bargo, los nts adecuados para esti-
l'T.]CNOI,OGIA DEI, AGUA
ARTIEULCIS TEeNTCOS
mar biomasa viva son los cidos nu-
cleicos, las protenas, Ios polisacri-
dos,los lpidos y el ATP.
3.1 .l . cidos nucleicos
El ADNI y el ARN son dos com-
ponentes de las bacterias cuya snte-
sis es proporcional a Ia tasa de creci-
miento. Mientras que las concentra-
ciones de ARN varan considerable-
mente con el estado fisiolgico ce-
lular, la cantidad de ADN es relati-
vamente ms constante.
La cantidad de ADN se determi-
na mediante espectrofotometra,
tras su extraccin y purificacin.
Existen diversas tcnicas, si bien
presentan la desventaja de que los
procedimientos de purificacin son
complejos, con diversas interferen-
cias y bastante costosos.
3.1 .2. Protenas
Existen varias tcnicas para el
anlisis de protenas totales de una
muestra biolgica. Algunos estn
muy extendidos y se caracterizan
por su sensibilidad, rapidez y sim-
plicidad. Es el caso de las tcnicas
de Lowry et al. ( 195 1 ) y Bradford
(1916).
La principal desventaja de la de-
terminacin de protenas es que su
cantidad en las clulas est sujeta a
fuertes variaciones debido, funda-
mentalmente, a cambios en las con-
diciones fisicoqumicas y al estado
fisiolgico celular.
3.1 .3. Polisacrdos
La mayora de ias clulas proca-
riotas contienen cido murmico
(un peptidoglicano) como compo-
nente de la pared celular. E,xisten
varias tcnicas para 1a determina-
cin del cido murmico en mues-
lras que conlengan microorganis-
mos. Todas ellas se basan en la con-
versin del cido murmico a lac-
tato, segLrida del anlisis enzrmi-
co o qumico de la concentracin
de lactato. El cido murmico se
extrae de 1as clulas mediante una
hidr1isis aicalina y se purifica
posteriormente mediante cromato-
grafa de intercambio inico. Otros
anlisis ms sensibles necesitan del
uso de cromatografa lquida
(HPLC) o gaseosa (GC). Todas es-
tas tcnicas son laboriosas. muy
largas y necesitan de un equipa-
miento caro (Figura 2).
3.1.4. Lpidos
Los lpidos son un componente
fundamental de las membranas ce-
lulares. Su determinacin para la es-
timacin de la biomasa de una po-
blacin bacteriana ofrece muchas
ventajas sobre otros mtodos. La
principal ventaja es su alto conteni-
do especfico y que se encuentran en
cantidades relativamente constan-
tes. Otra ventaja muy importante es
que los lpidos no forman parte de
las reservas ceiulares y se degradan
rpidamente durante la lisis bacte-
riana. Aproximadamente, entre un
90-98Vo de los lpidos de las mem-
branas celulares est en forma de
fosfolpidos (Lazarova y Manem,
1 995).
Las tcnicas de anlisis se basan,
fundamentalmente, en la extraccin
celular de los fosfolpidos con un di-
solvente orgnico, su posterior hi-
drlisis cida para liberar el fosfato
y, por ltimo, 1a determinacin co-
lorimtrica de ste. Son tcnicas re-
lativamente sencillas, reproducibles
y sensibles (de 0,1 a 1 nmol de fos-
fato; Findlay et al., 1989).
3.1.5. Trifosfato de
adenosina o ATP
El ATP presenta las ventajas de
ser un componente bioqumico cen-
tral presente en todos los microor-
ganismos y especfico de los micro-
organismos vivos, circunstancias
ambas que permiten relacionarlo
con la biomasa viva.
Una de las tcnicas ms utiliza-
das para medir ATP se basa en la re-
accin luciferina-luciferasa, proce-
so responsable de la luz emitida por
las lucirnagas y qlle ha sido am-
pliamente estudiado. En este meca-
nismo de luminiscencia se sabe que
intervienen luciferina (fenol hetero-
cclico, LH2), luciferasa (enzima,
E), ATP, cationes de n-iagnesio y

Io
orgeno en un proceso de oxidorre-
clLrccin que ocurre en doble etapa:
lH
""j +\TP:tr ---_>
+ E-LH,-AMP + PPi
E,-LH,-AMP+O, _- _____-_-->
Ya que por cada molcrla de lu-
cil'erina oxidada se emite un cuanto
cle 1r-rz, la detenninacin del ATP en
biolgica puede hacer-
Llnx mLrestra
se mediante extraccin por ebulli-
cin en tampn Tris (hipocloruro de
tr'i s-hi droximetil-aminoetano) del
ATP, incubacin con lr,rciferina-lu-
cif'crasa y posteriol medida de la luz
pt'oducida en un fotmetro con re-
gistro.
I-a mayor desventaja de esta tc-
uica es 1a necesidad de procesar 1a
ttlue stra con rapidez, ya que el estado
fisiolgico de las clLrlas cambia r'r-
pidantente tras la toma de muestra.
La lelacin entre el ATP, el ADP
Y el AMP y el contenido total de de-
sox i n'ibonucletidos lefleja la carga
ene r-utica de las clulas [(ATP + 0,5
ADP)/(AMP + ADp + ATp)1. Esta
relacitin puede duplicalse en slo
ttnos segundos. Aigur-ros autores sLl-
gielcn que la carga energtica es un
t'alor ntucho nts preciso qLre el
conte nido absolr-rto de ATP ya que la
contposicin celular de desoxir.ribu-
nttclctiticlos vara con el estado fi-
siolrir ieo cle los nlicloolglrnisrlo.:
duriurte e l cr.ecimiento tlacteriano el
pool energtico clisrlinuye, al clis-
mlnLrir la conccntracin de ATp y
1 h
':' i: {: u 1 ,.--} ; ?fieNr*s
-
:"
i :3--i*
.-
q &i
aumentar las de ADP y AMP (Uh-
linder y White, 1983).
L + H,O + bioluminiscenciu
3,2. Mtodos bioqumicos
Las medidas de alguna actividad
enzimtica pueden considerarse co-
mo una alternativa a los mtodos
tradicionales. Los ensayos enzim-
ticos son sirnples de realizar y sus
resultados se obtienen rpidamente.
Adcmis. el equiparniento lrecesiu'io
no es ni costoso ni complejo. La ma-
yora de las medidas de actividad
enzimtica se realiza mediante
convelsin de sustratos especficos
a productos coloreados que son
cuanti ficados fotomtricamente.
La principal desventaja de los
mtodos bioqumicos es la varia-
cin de las actividades enzimticas
celulares con los cambios fisiolgi-
cos y qlre, una vez que ios microor-
ganisrnos rllueren, ]as enzimas libe-
radas pueden seguir actirras. Entre
las distintas mediclts de actividad
enzimtica cabe destacar li activi-
clrd esterasa y 1a actrvidad deshidlo-
genasa.
3.2.1 Actividad esterasa
El diacetato cle I'luorescent
(FDA) es uu courpllesto que puede
ser hiclr'olizido por enzimas tales
coJro proteasas. lipasas y esterI-
sas, sienclo e1 producto cle dicha
,i
#
Por cada molcula
I r .f
de luciferina oxtdada
se emtte un cuanto
conversin enzimtica la fluores-
cena. La fluorescena puede ser vi-
sualizada como un proclucto intra-
celular mediante el en-rpleo de la
rrricroscopa de epi lluorescencia o
(1) cuanti ficada mediante espectrofo-
(2) tometra tras ser extrada con disol-
ventes orgnicos.
EI principio en el que se basa la
tcnicr del FDA es en el car'rcter hi-
drofbico del diacetato de lluores-
cena, lo que le permite penetrar a
travs de la brcapa lipdica que for-
ma la membrana celular. Una vez en
el interior celulal', es convertido me-
diante la actividad esterasa en fluo-
rescena, mo1cula de carcter hi-
droflico que puede ser almacenada
1a intracelulirmente dada 1a baja per-
neabilidad de la membrana a sta.
Ya que las clulas muertas se carac-
terizan por presentar abundantes
orificios en sus r.nembranas, el FDA
slo tefiir clulls vivas.
El FDA se ha empleado princi-
palnentc en la determinacin de la
actividad de hongos y bacterias en
mllestras de suelos. Sin embargo, se
ha encontrado que no todas las espe- O
cies plesentes en el suelo son sensi- O
O
C\
bles a esta tcnica, ya sea porcllte el
FDA no penetra adecuadamettte en U
M
las clulas o porqLle no es bien rete- CO
l
nido. Tratanclo de ntinin-rizat estos t-
problemas, en el campo de la ePi-
lluorescencia se han utilizado deli-
vados clel FDA como el diacetato clc r)
O
6-calboxifluorescena (CFDA) y el C\
diacetato de -5- (y 6-) strlfofluores-
cena (SFDA). este ltitro Inencio- ffiffi
ffi
1'I.]CNOI-OGIA DEI- AGUA

nado antefiormente y que Por el mo-
mento se ha revelado como el ms
apropiado.
3,2.2. Activdad
deshidrogendscl (DHA)
En una muestra biolgica, la de-
terminacin de 1a actividad del sis-
tema de transporte electrnico pue-
de realizarse por medida de la acti-
vidad deshidrogenasa. Todos los
microorgani smos aerobios poseen
un sistema de transporte de electro-
nes activo, en el que el ms impor-
tante aceptor terminal de electrones
es el oxgeno. En la corriente princi-
pal de este transporte electrnico
participan, entre otras, las deshidro-
genasas piridn-dependientes que
necesitan NAD o NADP como co-
enzima y las deshidrogenasas fla-
vn-dependientes que contienen fl a-
vn-adenn-dinucletido (FAD)
flavn mononucletido (FMN) co-
mo grupo prosttico. Las deshidro-
genasas son enzimas de oxido-re-
duccin que participan en el trans-
porte de electrones desde un sustra-
to orgnico a un aceptor final de
electrones mediante la transferencia
de hidrgeno. La determinacin de
la actividad deshidrogenasa pttede
hacerse midiendo la capacidad de
los microorganismos para reducir
un indicador o colorante redox. En-
tre estos colorantes se encLtentran
sales de tetrazolio tales como el clo-
mro de 2,3,5-trifeniltetrazolio
(TTC) o el cloruro de 2-(p-iodofe-
ni l) -3- trofenil )-5 -f'enil tetrazo-
(p -n i DBO, que indica la biodegradabili-
lio (lNT). Ambas se caracterizan
por ser soh-rbles en agua en su forma
oxidada y por formar depsitos ce-
I ulares insolubles de TTC-fonnazn
O e INT-formazn (Figura 3), respec-
O tivamente, cuando son reducidas
c\ por la actividad respiratoria. Estos
l!
depsitos rojizos de formazn, al ser
M
cO observados microscpicamente,
l permiten distir-rguir en mLlestras
acuosrs las bacterirrs qLte I'espilan
de aquellas qLre no (deternrinacin
v) directa de la bionasa). O bien, el
O
C\l forrrazu.r es extrado con disolven-
tes orgnicos y deterrriinado espec-
ffi trofotomtricamente, permitiendo
]'l.lcN0LO(;t^ t)lI_ AGU{
ARTTCUTOS TECzuTCOS
Figuro 1.3 Visin ol microscopio piico {I
INT-deshidrogenoso.
la cuantificacin de la actividad res-
piratoria de la muestra.
El TTC presenta el inconvenien-
te de su elevada sensibilidad al ox-
geno (Chung y Neethling, 1989). El
INT no tiene esta limitacin y su uso
est cada vez ms extendido. Sin
embargo, su precisin y correlacin
con la cantidad de biomasa viva no
est suficientemente demostrada
(Singh etal.,1994).
3,3. fftodos cnticos
La base de estos mtodos es la
medida del consumo de sustrato o
de la formacin de producto en en-
sayos en discontinuo. El ejemplo
ms tpico en microorganismos ae-
robios es la determinacin de la
dad de un sustrato en disolucin a
travs del consumo de oxseno del
medio.
3.3.1. Adaptaciones del
Respi rmetro d e Wo rb u r g
Le tasa de cortsumo de oxgeno
puede ser detelminada segn el
plincipio en el que se basa el respi-
rmetro de Warburg, por el que a
temperatura y volumen constantes,
la variacin en la cantidad de un gas
puede medirse por la variacin de su
presin. En una planta piloto eqLrr-
pada para actrar como Lllt respir-
metro, los microorganismos presen-
OOOx) de uno muestro de fongo octivo trotodo segn el protocolo de lo
metabolizanlama-
tes en la muestra
teria orgnica con 1a consecuente
disminucin del nivel de oxgeno,
que es consumido, y el aumento de
la concentracin de CO' que es pro-
ducido. El dixido de carbono es ad-
sorbido en una solucin de potasa,
por lo que la disminucin de la pre-
sin en este sistema cerrado es debi-
da al volumen de oxgeno consumi-
do por los microorganismos, lo cual
puede ser medido mediante un sen-
sor de presin y registrado. La re-
presentacin en el tiempo del oxge-
no disuelto (mg.l ') informa del
consumo de oxgeno, siendo la pen-
diente de la recta de ajuste ptimo la
tasa de consumo de oxgeno (OUR)
en mg O' l-r.h-1.
Una adaptacin del respirmetro
de Warburg para medir el biogs
producido en procesos anaerobios
puede encontrarse en James et al.
( 1 ee0).
3.3.2. Tasd de respiracin
(Oxgen Upfake Rate, OUR)
El consumo de oxgeno de los
rnicroorganisnros presentes en ttna
muestra biolgica debido a la respi-
racin endgena de nrantenimiento
celular y a la oxidacin del sustrato
orgnico presente en dicha muestra
(en ausencia de nitrificacin), reci-
be el nombre de respiracin. As
pue\. se denomina tasa de respira-
 &*tTgf;-5t*s 'Ft:{r"*xcs5

La respiracin
endgena es
directamente
=t =.
. .:,,:: proporcional a la
.
concentracin de
.

microorganismos

cin (en mg O,.l t.-t) a la velocidad

Fig.4. Sistemo OXITOP lS WTW poro o deierminocin de DBO
con la que los microorganismos uti-
lizan el oxgeno en funcin a estos
dos conceptos.
La respiracin endgena, en la
prctica, se considera qLle es cons-
tante a temperatufa y concentracin
Instnimcnlo paru l;r rncclid;l de rnicroorganismos fijos. Por tan-
c1ctr crigeno to, ser directamente proporcional a
la concentracin de microorganis-
mos presentes en la suspensin bio-
lgica, estimados como SSV.
La respiracin debida a 1a meta-
bolizrcin del sustrato orgnico
presente en la muestra o respira-
lllcct:oclo cin exgena, ser proporcional a
orgc11(] la concentracin de sustrato org-
nico rpidamente biodegradable e
inch"rira, si lo hubiera, el consumo
de oxgelro ocasionado por nitrifi-
cacin.
La tasa de lespiracin total refe-
rida a la concentracin de microor-
ganisrnos, expresada como SSV, es
la tasa de respiracin especfica
(SOUR). Su principal caracterstica
es que define li actividad biolgica
en un momento dado de una bioma-
sa especflca. O
La medida cle la actividad biol- O
O
gica SOUR est relacionada con la c\
lclreirr "al imento/nt icroorganis-
M
rros" (F/M en terminologa anglo- .O
l
sajona), ya que conrprende la tasa c1e
(_)
respiracin exgena (propolcional a C
la DBO) y los SSV de un cultivo
biolgico. En la Figura 5 se r.nues- Lr)
O
esquetrla simplificaclo del dis-
trl Lrn C\
positivo empleado para 1a meclicla
F g.5 Disposi"'o de medido del consur6 6ls er gero. cle col.rsun'lo de oxgeno

'f lrc\Ol,oct1 l)ril. AG L .\

b---
 Arargfrait*s TgNCQ5

3.3.3. Taso de desaparicin la determinacin on-line de la bio- phospholipid analysis in deter-

de svstrato
Es el mtodo ms convencional
para determinar la actividad de una
poblacin de microorganismos. La
disminucin de la concentracin de
sustl'ato en el tiempo puede hacerse a
travs de mtodos indirectos, como
la DQO o el COT, o mediante tcni-
cas especficas, fundamentalmente
cromatogrficas (GC o HPLC). La
bsqueda de nuevos mtodos ha 11e-
vado al empleo de tcnicas basadas
en el empleo de electrodos selecti-
vos, en los que el clculo de la activi-
dad de 1a muestra biolgica se realiza
en base al tiempo requerido para que
ocurra el 507o de la desaparicin del
sustrato suministrado y para el que el
electrodo es especfico.
3.3.4. Potenciol bioqumco
de produccin de rnetc'no
(BMP)
Esta tcnica consiste en medir
con una jeringa o Lrn ft'asco de Ma-
riotte relleno de agua Ia produccin
total de biogs (CHo y CO,) produ-
cida por un reactor anaerobio dis-
continuo.
3.5. MIodos fiscoqumicos
indirecias
La medida del COT o de la DQO
son mtodos muy nsados para la es-
timacin indirecta de 1a biomasa
suspendida o f ijada. Son tnuy sensi-
bles y precisos, pero presentan las
misrnus importantes limitaciones
que los SST y SSV.
4. Mtodos en contnuo
Durante los aos 90 se han desa-
lrolludo mtodos cuantitutivos nrra
masa de un proceso biolgico. Las
tcnicas ms importantes se basar.t
en propiedades elctricas, microca-
lorimtricas o espectrofotomtricas
de los cuitivos biolgicos. Sin em-
bargo, a pesar del desarrollo tecno-
lgico, no existe un sensor ideal pa-
ra la monitorizacin en continuo de
la biomasa (Singh et al., 1994).
5. Agrodecimientos
Los autores desean expresar su
agradecimiento a la Direccin Ge-
neral de Investigacin Cientfica y
Tcnica, Ministerio de Educacin y
Cultura, por la financiacin de parte
de este trabajo mediante dos becas
del Programa de Formacin de Per-
sonal Investigador, Refs.: IN92-
D28480461 y IN92-D28598661
concedidas a M.C. Arniiz y L. lsac,
respectivamente.
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