Regulacin de la actividad de la telomerasa como un potencial

teraputico contra el cncer de pulmn

Torres B. Sandra, Melecio C. Gustavo

Ingeniera en Biotecnologa, Divisin de Ciencias de la Salud e Ingenieras
Universidad de Guanajuato
03 de Junio del 2015

Resumen

La telomerasa es la enzima responsable del mantenimiento de la longitud de los telmeros

mediante la adicin de secuencias repetitivas ricas en guanina, y su actividad se observa
principalmente en gametos, clulas madre y clulas tumorales. En las clulas somticas humanas
el potencial de proliferacin es limitado, debido a que la ADN polimerasa no es capaz de copiar el
ADN en los extremos de los cromosomas. Por el contrario, en la mayora de las clulas tumorales
el potencial de replicacin es ilimitado debido al mantenimiento de la longitud telomrica dado
por la telomerasa.
La actividad de la telomerasa ha sido medida en una gran variedad de tejidos tanto cancerosos
como no cancerosos, en la gran mayora de los estudios moleculares, se ha encontrado asociacin
entre los niveles altos de actividad de esta enzima y el desarrollo de diferentes tipos de cncer.
Entre los cnceres que se han estudiado se encuentran el de pulmn, el de pncreas, el
hepatocelular, el de prstata, algunos de piel y ciertos tumores gastrointestinales. Esta
investigacin se centra el estudio del cncer de pulmn, por ser la primera causa de muerte entre
los pacientes diagnosticados de enfermedad tumoral y debido al incremento de ste en los
ltimos aos en Mxico, se considera un blanco importante tanto para su deteccin temprana,
como para el desarrollo de nuevas terapias. El principal factor de riesgo para desarrollarlo es el
tabaquismo, aunque tambin pueden influir otros factores como los ambientales, ocupacionales,
la dieta y la carga gentica.
Por la importancia del tema y su actualidad, en este trabajo se propone una alternativa para la
terapia contra el cncer de pulmn mediante la regulacin de la actividad de la subunidad
cataltica hTERT de la enzima telomerasa por medio de un mecanismo molecular bsico: La
regulacin de la expresin gentica
Palabras clave: Cncer, telomerasa, hTERT.

Contenido

1. Introduccin..2
1.1 Telmeros y telomerasa..2
1.2 hTERT.2
1.3 Cncer de pulmn.2
2. Materiales y mtodos..4
2.1 Determinacin del gen hTERT en la enzima telomerasa4
 2.2 Introduccin del gen MSP58 para la inhibicin de hTERT.4
3. Resultados5
4. Discusin5
5. Conclusin6
6. Bibliografa..6
2015. All rights reserved.
doi:1005897/gs. 2015.02.06

1. Introduccin

1.1 Telmeros y telomerasa

Los telmeros son regiones de ADN no codificante ubicadas en los extremos de los cromosomas
eucariticos. Estn constituidos por secuencias de ADN altamente conservadas, repetidas en
tndem (TTAGGG)n y protenas asociadas, y presentan una estructura especial que impide su
unin a los extremos de otros cromosomas, previniendo la fusin telomrica. Cumplen un rol
esencial en la preservacin de la integridad cromosmica, protegiendo al ADN codificante de la
accin enzimtica y la degradacin, contribuyendo al mantenimiento de la estabilidad
cromosmica; mediante importantes interacciones entre los cromosomas y la matriz nuclear,
pudiendo adems ejercer efectos sobre la transcripcin de genes situados en regiones
subtelomricas e interactan con los mecanismos regulatorios del ciclo celular.
La enzima telomerasa tiene como funcin principal mantener la integridad telomrica, acta
elongando los extremos cromosmicos erosionados a expensas de un componente de ARN que
contiene un dominio complementario a la secuencia de ADN telomrico. Ese dominio permite
alinear la enzima con el sustrato y provee de un templado para la adicin de novo de
deoxinucletidos a las secuencias telomricas. Por retrotranscripcin, la telomerasa genera una
copia de ADN de su propia copia de ARN, la cual es entonces fusionada al extremo 3' del telmero.
La extensin de los telmeros por la telomerasa es requerida para llegar a la contraccin normal
que ocurre despus de cada replicacin del ADN 22.
1.2 hTERT

La telomerasa transcriptasa inversa (abreviado a de TERT, o hTERT en los seres humanos) es una
subunidad cataltica de la enzima telomerasa, la cual, junto con el componente ARN de la
telomerasa (TERC), comprende la unidad ms importante del complejo de la telomerasa.
1.3 Cncer de pulmn

Las clulas cancergenas no son especializadas a diferencia de las normales, por esta razn se
dividen continuamente, ya que ignoran seales que normalmente dicen a la clula que deje de
dividirse o que entre en apoptosis. Tienen la capacidad de influir en clulas normales, son capases
de evadir el sistema inmunitario e incluso utilizarlo para su beneficio.
El cncer es una enfermedad gentica, ya que es causado por cambios en los genes que controlan
la forma en que funcionan las clulas, estos cambios pueden heredarse de los padres, el resultado
de errores que ocurren al dividirse las clulas o por el dao del ADN causado por algunas
exposiciones del ambiente (radn, toxinas como asbesto y arsnico).
Se afectan tres tipos principales de genes proto-oncogenes, los cuales se dedican al crecimiento y
divisin de la clula, pero cuando son alterados son ms activos permitiendo que la clula crezca y
sobreviva cuando no debera, pasa lo mismo con los genes supresores de tumores, los genes
reparadores del ADN se dedican a reparar el ADN daado pero cuando las clulas tienen
mutaciones en estos genes tienden a formar mutaciones adicionales en otros genes.
El cncer de pulmn, presenta un tipo de cncer llamado carcinoma el cual se forman en las
clulas epiteliales las cuales cuben la superficie interna y externa del cuerpo, es considerado uno
de los ms letales en la actualidad. Los tratamientos convencionales para el cncer de pulmn son
la ciruga, la radioterapia, la quimioterapia, la terapia dirigida, la terapia laser, la terapia
fotodinmica etc. Aunque estos tratamientos no han dado muy buenos resultados.

A principios de 1990, el descubrimiento de una relacin entre los telmeros, la telomerasa, el

envejecimiento y el cncer abri una nueva va en la investigacin en biologa del tumor, con
implicaciones potencialmente revolucionarias para la terapia contra el cncer. A diferencia de la
mayora de las clulas humanas normales que carecen de actividad de la telomerasa. Las clulas
deficientes en los puestos de control del ciclo celular (por ejemplo, clulas malignas que carecen
de p53, p16, o ARF / CDKN2A) pueden escapar de la senescencia replicativa y continuar
dividindose, estas clulas eventualmente entran en un segundo crecimiento y despus en un
estado de crisis en donde las clulas podran continuar proliferando pero con altas tasas de
apoptosis. En las clulas humanas, estos dos mecanismos de restriccin de crecimiento celular
(senescencia y la crisis) son mecanismos potentes para proteger contra el cncer. La mayora de
las clulas humanas permanecen en este perodo de crisis, con el crecimiento celular se equilibra
con la muerte celular, pero en raras ocasiones una clula adquiere un mecanismo, tal como
expresin de la telomerasa, que pueden mantener o alargar telmeros. Las clulas que han
escapado de la crisis se caracterizan por dos caractersticas: estabilidad de los telmeros y la
reactivacin de la expresin de la telomerasa. Este tipo raro de clulas puede entonces crecer de
forma continua (es decir, se convierte en inmortal), y esto se cree que es un paso fundamental en
la carcinognesis. A partir de esta informacin y basados en el supuesto de la relacin entre la
telomerasa y el cncer se pretenden plantear estrategias directas para la regulacin de esta
enzima como una posible terapia para el cncer de pulmn.

Una de las preguntas abiertas en el desarrollo de terapias enfocadas en la telomerasa es: Cul es
el mecanismo preciso contra el cncer utilizando inhibidores de la telomerasa? El acortamiento de
los telmeros provoca en ltima instancia, la apoptosis de las clulas malignas, se cree
generalmente que es ste el mecanismo con mejores resultados de una variedad de mtodos. Sin
embargo, en algunos modelos, como es el cncer de pulmn, sta regla no se aplica lo cual
representa un obstculo serio en la bsqueda de factores predictivos de respuesta tumoral. De
hecho, si la longitud media de los telmeros disminuye consistentemente despus de la
administracin de diversos frmacos, su medicin podra ser propuesta como un biomarcador
potencialmente til para la pronta deteccin de la respuesta del tumor, en consecuencia, debido a
que los telmeros ms cortos en una clula son aquellos responsable de desencadenar un punto
de control de dao del ADN, para los fines de prediccin es mucho ms informativo conocer la
distribucin de los telmeros ms cortos en un tumor poblacin de clulas en lugar de medir la
longitud media de los telmeros. En consecuencia, el desarrollo de ensayos cuantitativos fiables
para medir la distribucin basada en clulas con telmeros ms cortos en una poblacin de clulas
dada solamente permitir a onclogos optimizar la seleccin de pacientes con cncer con la mayor
probabilidad de respuesta a inhibidores de la telomerasa. Sin embargo la finalidad de ste estudio
es, no slo proponer la medicin de la telomerasa para que sea utilizado como un biomorcadador
para la deteccin temprana de cncer, si no tambin, investigar a detalle el mecanismo y la
actividad de esta enzima. En particular, se detect la reactivacin de hTERT en la telomerasa en
hasta el 90% de los cnceres humanos. Por otra parte, se ha demostrado que la expresin ectpica
de hTERT puede restaurar la actividad de la telomerasa en muchos tipos de clulas telomerasa-
negativos, facilitando de ese modo la inmortalizacin. Adems, la introduccin de una forma
negativa dominante de hTERT o un vector antisentido dirigidos contra hTERT inhibe la actividad de
la telomerasa en las clulas cancerosas humanas y, finalmente, induce la apoptosis o
diferenciacin. Basndonos en sta informacin, con sta investigacin se pretende realizar un
estudio a detalle de la subunidad cataltica hTERT en la enzima telomerasa para lograr su
inhibicin y as proponer una terapia gnica contra el cncer de pulmn.
2. Materiales y mtodos

Se propone un mecanismo molecular bsico en este estudio: la regulacin de la expresin

gentica, modificando la cantidad de enzima a sintetizar a travs de mecanismos de induccin y
represin gnica. Se realiz el siguiente experimento en el laboratorio de Biologa Molecular de la
Universidad de Guanajuato CCS, el organismo modelo con el que se estudi la induccin y
represin gnica fue mus musculus.
2.1 Determinacin del gen hTERT en la enzima telomerasa

La subunidad cataltica que codifica el componente activo de la enzima telomerasa, hTERT, es

considerada un protooncogen porque la expresin anormal contribuye al crecimiento celular
descontrolado, por sta razn primero se pretende determinar la expresin de hTERT, para un
posible estudio de inhibicin del mismo. Para esto se escogi un diseo de secuencias de
nucletidos del gen que se quiere buscar: Para hTERT, a este diseo, se aadieron 200ng de RNA
purificado de cada paciente control, utilizndose en la reaccin de transcripcin inversa,
empleando el Kit TaqMan transcripcin reagents-Applied Biosystems en las siguientes
condiciones: 10 min. a 20C, para la unin de los cebadores al RNA. 45 min. a 42C, para la sntesis
del cDNA. 5 min. a 95C, para la inactivacin del enzima.
Con ello se ha trascrito el RNA a DNA, puesto que la reaccin en cadena de la polimerasa slo es
capaz de amplificar DNA, de manera que se obtiene la siguiente preparacin: Oligos
complementarios de hTERT, tRNA total del paciente (200ng) y transcriptasa inversa (RT) (Kit
TaqMan transcription reagents). El mtodo que se utiliz implica el aislamiento de ARNm de cada
muestra, preparacin del DNAc mediante transcriptasa inversa y amplificacin del DNAc especfico
de la telomerasa. En este sentido, en el laboratorio se ha desarrollado un procedimiento para la
cuantificacin de la expresin gnica de la subunidad hTERT de la telomerasa por RT-PCR a tiempo
real, a partir de plasma de ambos grupos: Pacientes con cncer de pulmn y el grupo de sujetos
control. Para el anlisis de PCR, se mezclaron 5l de la reaccin de transcripcin inversa con 45l
de TaqMan Universal PCR Master Mix, conteniendo 250nM de los cebadores tanto la secuencia
inicial, como la secuencia, junto con 125nM de la sonda TaqMan, especficos del gen. Con esto se
logr determinar que efectivamente se est expresando el gen hTERT de la enzima telomerasa.
2.2 Introduccin del gen MSP58 para la inhibicin de hTERT

En estudios anteriores se ha examinado la contribucin potencial de MSP58 a la regulacin

transcripcional de hTERT. Los datos revelan que la sobreexpresin de MSP58 reprime la
transcripcin de hTERT y de la actividad de la telomerasa. En este proyecto se seleccionaron
adenovirus para la terapia gnica por ser su genoma ms grande y por su capacidad de ocasionar
infecciones en las vas respiratorias. Se llev a cabo un experimento in vivo con ratones que tenan
tumores en los pulmones. Se infect a las clulas con el gen MSP58 por medio de terapia gnica
usando adenovirus. Para analizar los resultados se hizo un anlisis del ciclo celular. Las clulas
transfectadas e infectadas con los plsmidos se trataron con tripsina y se lavaron con PBS enfriado
con hielo. Despus de la fijacin con 4 C 75% de etanol durante 24 h, las clulas se trataron con
0,2 mg / ml de RNasa A (Invitrogen , Grand Island, NY) y se tieron con 20 mg / ml PI (Sigma-
Aldrich, St Louis, MO , EE.UU.) durante 1 h a temperatura ambiente. Para analizar la distribucin
de clulas en el ciclo celular, las clulas PI-teidas se analizaron mediante un citmetro de flujo
(Beckman Coulter Cell Lab Quanta SC citometra de flujo). Los datos fueron analizados con un
software especfico.

3. Resultados

Al realizar un anlisis del ciclo celular de las clulas tumorales se observ una notable disminucin
en el crecimiento y divisin celular por lo tanto, los resultados revelan que las clulas del tejido
pulmonar muestran una marcada reduccin en la actividad de la telomerasa. Se demostr que la
sobreexpresin de MSP58 puede inducir la detencin del crecimiento Estos hallazgos sugieren
que MSP58 inhibe la actividad de telomerasa y tiene una relacin directa con la subunidad hTERT.
Se demostr adems que la terapia gnica usando adenovirus es efectiva para este tipo de cncer.

4. Discusin

La Regulacin de la expresin del gen hTERT por una variedad de factores es crucial para la
progresin y el mantenimiento de los tumores humanos. En este estudio hemos demostrado que
MSP58 es un importante regulador de la expresin de hTERT. En resumen, nuestros resultados
indican que la expresin ectpica de MSP58 en clulas con cncer de pulmn result en una
disminucin de la transcripcin hTERT y la actividad de la telomerasa. MSP58 suprime
especficamente la transactivacin mediada por hTERT, la activacin de la telomerasa, y la
actividad promotora del crecimiento celular in vitro e in vivo. Estos resultados proporcionan
informacin sobre los mecanismos que modulan la transcripcin hTERT y la proliferacin celular a
nivel molecular que involucran MSP58 y su interaccin con los componentes de la enzima
telomerasa. Los resultados eran los esperados debido a los previos estudios realizados tanto en el
gen MSP58 como en la regulacin de la enzima telomerasa y su subunidad cataltica hTERT.
 5. Conclusin

Mostramos en este proyecto que la protena MSP58 puede funcionar como un regulador negativo
de la transcripcin hTERT, y que la interaccin entre MSP58 y hTERT estn involucrados en esto.
MSP58 inhibe la transactivacin mediada por hTERT, la activacin de la telomerasa, y la actividad
promotora del crecimiento celular in vitro e in vivo. Se identific de la funcin del MSP58 en la
regulacin de la telomerasa / hTERT lo cual nos proporciona nuevos conocimientos para entender
la regulacin de la enzima a partir del gen MPS58, en el cncer de pulmn.

6. Bibliografa

Hsu C.Chia , Chen C.Han , Tsung-I Hsu, Jan-Jong Hung, Jiunn-Liang Ko , Bo Zhang, Yi-Chao Lee ,
Han-Ku, Wen-Chang Chang & Ding-Yen Lin . (2013, Diciembre 18). The 58-kDa microspherule
protein (MSP58) represses human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene expression and
cell proliferation by interacting with telomerase transcriptional element-interacting factor (TEIF).
Elsevier, Volume 1843, pp.565579. http://dx.doi.org/10.1016/j.bbamcr.2013.12.00

Koji Karasawa & Hidetoshi Arakawa.( 2015, Abril 27). Detection of telomerase activity using
microchip electrophoresis. Elsevier, Volume 993-994, pp.14-19.
http://dx.doi.org/10.1016/j.jchromb.2015.04.032

Yanxin Qi ,Huanhuan Guo , Ningning Hu,Dongyun He ,Shi Zhang ,Yunjie Chug, Yubin Huang ,Xiao Li,
LiLi Sun &, Ningyi Jinb.( 2014,Octubre 15). Preclinical pharmacology and toxicology study of Ad-
hTERT-E1a-Apoptin, a novel dual cancer-specific oncolytic adenovirus. Elsevier, Volume 280 Issue
2, pp.362-369. http://dx.doi.org/10.1016/j.taap.2014.08.008

Baojun Xu & Changkeun Sung. (2015, Junio 1). Telomerase inhibitory effects and anti-proliferative
properties of onion and other natural spices against cancer cells. . Elsevier, Volume 10. pp. 80-85.
doi:10.1016/j.fbio.2015.03.001

Mocellin S., Pooley k & Nitti D. (2013, Febrero). Telomerase and the search for the end of cncer.
Trends in Molecular Medicine. Volume 9, Issue 2. pp. 125-
133 http://dx.doi.org/10.1016/j.molmed.2012.11.006

National Cancer Institute,(9 febrero 2015). About cncer. Recuperado de:

http://www.cancer.gov/about-cancer/what-is-cancer/statistics