TIPOS DE

MICROSCOPIOS
TIPOS DE MICROSCOPIOS AcuaNatura

NDICE

1. El microscopio ptico 3
1.1. El microscopio ptico compuesto 4
1.2. El microscopio ptico de contraste de fases 6
1.3. El microscopio ptico de campo oscuro 7
1.4. El microscopio ptico de fluorescencia 8
2. El microscopio electrnico 9
2.1. El sombreado 10
2.2. La tincin negativa 11
2.3. Rplicas de carbono 11
2.4. Criocorrosin 11
2.5. El microscopio electrnico explorador 12

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1. TIPOS DE MICROSCOPIOS

1.1. El microscopio ptico

El microscopio ptico es un instrumento que sirve para aumentar el tamao de un

objeto a travs de un sistema de lentes. Puede conseguirse con este mtodo un
aumento de hasta 2000 veces.

Las partes de las que se compone un microscopio se pueden dividir en parte

mecnica y en parte ptica (figura 1):

Parte mecnica:

Sistema de soporte:

Pie: Sirve de apoyo y para darle estabilidad al microscopio. En l est

integrada la fuente luminosa.
Brazo: Es una columna que parte del pie sirve para sujetar el tubo.
Puede ser recto o arqueado.
Tubo: Es una cmara oscura que est unida al brazo. En su parte
inferior est el revolver son los objetivos y en su parte superior los
oculares.
Platina: Es una plataforma horizontal sobre la que se engancha con
dos pinzas el portaobjetos. Tiene en su zona central un orificio que
permite el paso de la luz y un sistema de cremallera manejado por
dos tornillos que permiten el movimiento de la muestra.
Revolver: Sujeta los objetivos y gira para permitir el cambio de
objetivo.

Sistema de ajuste:

Tornillo macromtrico: Tornillo de enfoque que mueve la platina

hacia arriba y hacia abajo de forma brusca y poco precisa.
Tornillo micromtrico: Tornillo de enfoque que mueve la platina hacia
arriba y hacia abajo de forma lenta y muy precisa.

Parte ptica:

Fuente de iluminacin: Es una lmpara halgena que permite el encendido o

el apagado con un interruptor y cuya intensidad puede ser graduada. Puede
tener en su parte superior un anillo para permitir la colocacin de filtros que
facilitan la visualizacin.
Condensador: Es un sistema de lentes situado bajo la platina que permite
concentrar la luz de la fuente de iluminacin hacia la preparacin.
Diafragma iris: Est en el interior del condensador y sirve para limitar el haz
de rayos que atraviesa el sistema de lentes eliminando los rayos demasiado
desviados (regula la luz y ajusta la apertura numrica).
Oculares: Estn colocados en la parte superior del tubo y su funcin es
captar y ampliar la imagen obtenida por los objetivos. Actualmente se
suelen usar los microscopios binoculares que tienen dos oculares unidos por
un mecanismo que permite ajustar la separacin interpupilar. Son
normalmente de x10 y x12.
Objetivos: Estn colocados en la parte inferior del tubo insertados en el
revolver y obtienen la imagen real aumentada e invertida. Sobre su
superficie est indicado su aumento y su apertura numrica. Suelen llevar
dibujado un anillo de color que indica su aumento y suelen ser de x4 (rojo),
x10 (amarillo), x40 (azul) y x100 (blanco).

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Figura 1: Esquema de un moderno microscopio ptico.

1.1.1. El microscopio ptico compuesto

El microscopio compuesto ha sido de importancia crucial para la microbiologa como

ciencia y es todava, con ciertas variaciones, el principal apoyo de la investigacin
microbiolgica rutinaria.

Un microscopio compuesto tiene dos lentes o sistemas de lentes, el objetivo,

situado cerca del objeto que se observa, y el ocular, que est colocado cerca del
ojo. El aumento primario del objeto es producido por la lente objetivo y la imagen
se transmite al ocular, donde se realiza el aumento final. El aumento total de un
microscopio compuesto es el producto del aumento de su objetivo y de su ocular.
Con un objetivo que aumenta x40 y un ocular que aumenta x10 el aumento total es
de x400. El microscopio compuesto es pues capaz de conseguir aumentos
considerablemente mayores que el microscopio construido con una sola lente.

Adems del aumento una propiedad del microscopio es su poder resolutivo. Esta es
la capacidad de mostrar distintos y separados dos puntos muy cercanos y, por
tanto, cuanto mayor sea le poder resolutivo, mayor ser la definicin de un objeto.
Los microscopios de gran poder resolutivo son especialmente buenos para ver
pequeas estructuras. El poder resolutivo de un microscopio compuesto depende de
la longitud de onda utilizada y de una propiedad ptica de la lente conocida como
apertura numrica. Como la longitud de onda habitualmente est fijada, la
resolucin de un objeto es funcin de la apertura numrica: cunto mayor sea la
apertura, el objeto resuelto ser ms pequeo. Hay una correspondencia
aproximada entre el aumento de un objetivo y su apertura numrica, de tal modo
que las lentes con mayores aumentos habitualmente tendrn mayores aperturas
numricas (el valor de la apertura numrica est marcado al lado de la lente). El
poder resolutivo viene dado por la siguiente frmula:

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siendo: d = poder resolutivo, = longitud de onda, N = ndice de refraccin del

medio, = semiapertura del objetivo, N*sen = apertura numrica.

Para conseguir un aumento total mximo e idneo este debe estar comprendido
entre 500 y 1000 veces la apertura numrica. Si se busca una mayor ampliacin de
la imagen lo que se consigue es un mayor aumento, pero una nitidez baja.

Un factor que afecta a la apertura numrica adems de la construccin de la lente

es el medio a travs del cual pasa la luz. Mientras que el objetivo est separado del
objeto por el aire, su apertura numrica nunca ser mayor de 10. Para conseguir
aperturas numricas mayores que sta el objetivo debe estar inmerso en un lquido
de mayor ndice de refraccin que el aire. Se utilizan aceites de varios tipos, y las
lentes preparadas para usarse con aceite se denominan lentes de inmersin. La
apertura numrica de un objetivo de inmersin de alta calidad esta entre 12 y 14.
Aunque las lentes de inmersin en aceite tienen habitualmente mayores aumentos
que las lentes para observacin en seco, esto no es siempre as. Una lente de
inmersin utilizada en el aire da una imagen muy poco satisfactoria, por lo que
nunca deber emplearse sin aceite.

Aumento del objetivo

x10 x40 x901
Aumento con un ocular de x10 x100 x400 x900
Apertura numrica 025 076 130
Poder resolutivo, m 20 045 027
Profundidad de campo aproximada, m 70 13 05
rea de campo aprox. con un ocular de x10, mm 15 035 017
1
Lentes de inmersin

Tabla 1: Datos pticos para los objetivos utilizados comnmente.

De acuerdo con la teora de la ptica, las mayores resoluciones posibles con un

microscopio ptico compuesto permitirn la observacin de un objeto cuyo
dimetro sea de unos 02 m (1 m = 10-6 m). Si un objeto de 02 m de dimetro
se aumenta 1000 veces, aparecer a la vista como un objeto de 02 mm de
dimetro que puede apreciarse fcilmente. Con el microscopio compuesto pueden
obtenerse aumentos mayores de x1000 escogiendo los oculares adecuados, pero
con ello no se da mayor resolucin del objeto (esto se denomina aumento ineficaz,
puesto que no aade nada a la resolucin).

La mayor parte de los microscopios usados en microbiologa tienen oculares de diez

aumentos (x10) y objetivos de aumentos diversos, habitualmente x10 (aumento
total x100), x40 (aumento total x400) y x90 o x100 (objetivos de inmersin,
aumento total x900 x1000). Las lentes de menor aumento se utilizan para
rastrear la preparacin buscando objetos de inters, el objetivo de 40 aumentos
permite la observacin detallada de los microorganismos grandes tales como algas,
protozoos y hongos, y los objetivos de 90 100 aumentos se emplean para ver las
bacterias y los pequeos microorganismos eucariticos.

El sistema de iluminacin de un microscopio es tambin de considerable

importancia, especialmente cuando se utilizan grandes aumentos. La luz que entra
en el sistema debe enfocarse sobre la preparacin y para esto se utiliza un sistema
de lentes llamado condensador. Elevando o bajando el condensador puede alterarse
el plano del foco de la luz y elegirse una posicin que consiga el foco preciso. El
condensador tiene tambin un diafragma iris, que controla el dimetro del crculo
de luz que pasa por el sistema. Lo que se busca con este diafragma iris no es
controlar la intensidad de la luz que alcanza el objeto, sino asegurar que la luz que
pasa por el sistema condensador ocupe justamente el objetivo. Si el diafragma iris

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es demasiado grande parte de la luz pasar no slo al objetivo sino tambin

alrededor de l y no se utilizar. Si la luz es demasiado brillante no deber
reducirse alterando la posicin del condensador o del diafragma iris, sino usando
filtros de neutralizacin o disminuyendo el voltaje de la lmpara. Nunca se insistir
lo suficiente en que el ajuste apropiado de la luz es crucial para la buena
microscopia, especialmente a los mayores aumentos.

Otros dos factores relacionados con el sistema de lentes utilizado son la

profundidad de campo y el rea de campo. Profundidad de campo significa el
espesor de la preparacin enfocada en cualquier momento y es siempre mayor a
pequeo que a gran aumento. Con inmersin en aceite la profundidad de campo es
muy escasa, habitualmente menor de 1 m. El rea de campo se representa por el
dimetro de la parte de la preparacin que se est viendo. El rea de campo es
siempre mayor con pequeo que con gran aumento, y por esta razn las lentes de
pequeo aumento son tiles para rastrear la preparacin.

Figura 2: (a) Recorrido de la luz en un microscopio de campo claro. (b) Microfotografa de campo
claro.

1.1.2. El microscopio ptico de contraste de fases

El microscopio de contraste de fases hace posible ver fcilmente pequeas clulas,

incluso sin teir. Las clulas tienen un ndice de refraccin distinto de su alrededor
y esta diferencia puede utilizarse para crear una imagen de mucho mayor contraste
que la que puede obtenerse con el microscopio ptico normal.

En este microscopio la fuente de luz es un cono hueco de luz que pasa a travs de
un diafragma anular al condensador. En el objetivo un anillo de contraste de fases
desplaza la fase de luz que lo atraviesa en un cuarto de longitud de onda. La luz
que pasa retardada atraviesa el anillo y el ojo la ve como luz blanca normal. La luz
que pasa a travs de una muestra con ndice de refraccin diferente del ndice del
medio es retardada y tiene un recorrido ms largo, llegando al ocular fuera de fase.
La interferencia entre la luz retardada y la no retardada produce una imagen de la

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muestra. En la mayora de los microscopios de contraste de fases la imagen

aparece clara sobre un fondo oscuro. Puesto que la imagen depende de las
diferencias en el ndice de refraccin de la muestra y del medio circundante, la
imagen desaparece si la muestra es sumergida en un lquido de igual ndice de
refraccin. Para obtener mejores resultados con el microscopio de contraste de
fases es esencial que el sistema ptico est cuidadosamente alineado y se emplea
un dispositivo especial, el telescopio controlador, para ajustar el diafragma anular
en relacin con el anillo de contraste de fases.

La microscopia de contraste de fases hace posible observar clulas en estado vivo,

ayudndonos as a evitar la creacin de artefactos tales como los introducidos por
la tincin. En muchos laboratorios de bacteriologa el microscopio de contraste de
fases ha reemplazado prcticamente al microscopio ptico comn como
instrumento de investigacin. Pero hay que tener en cuenta que el objetivo de
contraste de fases es menos apropiado que el normal para la observacin de
material teido, por lo cual los objetivos de campo claro son todava necesarios y
deberan emplearse siempre para observar muestras teidas.

Figura 3: (a) Recorrido de la luz en un microscopio de contraste de fases. (b) Microfotografa de

contraste de fases.

1.1.3. El microscopio ptico de campo oscuro

El microscopio de campo oscuro es un microscopio ptico ordinario cuyo sistema

condensador ha sido modificado para dirigir la luz a la preparacin desde los lados
de tal modo que slo la luz difractada por la preparacin pasa al ocular y se hace
visible. A causa de esta disposicin la muestra aparece iluminada sobre un fondo
oscuro. La microscopia de campo oscuro ha posible la observacin en estado vivo
de partculas y clulas que de otra manera estaran por debajo de los lmites de
resolucin del microscopio ptico, aunque resulten visibles pocos detalles
estructurales. La microscopia de campo oscuro ha sido ampliamente usada en el
estudio de pequeas clulas mviles tales como Treponema pallidum, la

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espiroqueta causante de la sfilis, que es invisible con la microscopia ptica

ordinaria.

Figura 4: (a) Recorrido de la luz en un microscopio de campo oscuro. (b) Microfotografa de campo
oscuro.

1.1.4. El microscopio ptico de fluorescencia

Se utiliza para poner de manifiesto muestras que tienen fluorescencia, bien a causa
de la presencia en su interior de sustancias materiales fluorescentes o que han sido
tratadas con colorantes fluorescentes. La fluorescencia es la propiedad que tienen
muchas sustancias qumicas de emitir luz de un color despus de excitarlas con luz
de otro color. En el microscopio de fluorescencia la luz de excitacin es eliminada
con un filtro colocado entre el objetivo y el ocular, de modo que slo se ve la luz
emitida.

Figura 5: Comparacin entre los mtodos microscpicos: (a) De campo claro. (b) De campo oscuro.
(c) De contraste de fases. (d) De fluorescencia.

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1.2. El microscopio electrnico

Para estudiar la estructura interna de los microorganismos es esencial el uso del

microscopio electrnico. En este microscopio se utilizan electrones en vez de rayos
de luz, y como lentes funcionan unos electroimanes. Todo el sistema opera en el
vaco. Cuando los electrones pasan a travs de la preparacin algunos son
difractados creando entonces una imagen que se hace visible en una pantalla
sensible a los electrones. La resolucin obtenida con el microscopio electrnico es
mucho mayor que la conseguida con el microscopio ptico. Mientras que con
estructuras ms pequeas que pueden observarse tienen unos 02 m, con el
microscopio electrnico pueden verse fcilmente objetos de 0001 m (= 1 nm =
10-9 m). Con el microscopio electrnico es posible ver muchas sustancias incluso de
tamao molecular. Sin embargo, a causa de la naturaleza de este instrumento slo
pueden examinarse objetos muy delgados. Si se est interesado en ver estructuras
internas, incluso una sola bacteria es demasiado gruesa para ser observada
directamente. Por consiguiente, para preparar muestras para el microscopio
electrnico se necesitan tcnicas especiales de cortes ultrafinos. Para seccionar las
clulas primero deben ser fijadas y deshidratadas, realizndose habitualmente esto
ltimo transfiriendo las clulas a un disolvente orgnico. Despus de la
deshidratacin la muestra es incluida en plstico y en este plstico se cortan
secciones finas utilizando un ultramicrtomo, por lo general equipado con una
cuchilla de diamante. Una sola clula bacteriana, por ejemplo, puede cortarse en
cinco o seis secciones muy finas, que son examinadas despus individualmente con
el microscopio electrnico. Para obtener suficiente contraste, las preparaciones se
tratan con colorantes especiales de la microscopia electrnica, tales como cido
smico, permanganato, uranio, lantano o plomo. Estos materiales estn
compuestos por tomos de elevado peso molecular y, por ello, dispersan bien los
electrones. Las estructuras celulares teidas con uno de esos materiales presentan
un contraste muy aumentado y, por tanto, se ven mejor.

Figura 6: Microscopio electrnico moderno.

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La fina seccin es montada sobre una rejilla metlica recubierta de colodin y es

incorporada al instrumento, luego se aplica el alto vaco. Una vez es evacuada la
cmara de la muestra, se enfoca el haz electrnico y la imagen se observa en una
pequea pantalla. Se toman fotografas de las imgenes interesantes, ya que slo
en la placa fotogrfica se obtiene la resolucin ltima del microscopio electrnico. El
intenso haz electrnico causa el deterioro gradual de la muestra, de forma que no
es posible una observacin a largo plazo.

La fijacin, la inclusin y la tincin son tratamientos potencialmente perjudiciales y

pueden alterar grandemente las estructuras celulares. Por esta razn debe tenerse
gran cuidado en la interpretacin de las imgenes obtenidas con el microscopio
electrnico. Los artefactos o creaciones artificiales son mucho ms comunes que en
la microscopia ptica. Procedimientos que van bien con ciertos organismos pueden
fallar con otros. En general, se utilizan mtodos diferentes para los organismos
procariticos y para los eucariticos.

La microscopia electrnica es un arte altamente desarrollado y con esta tcnica

somos capaces de observar estructuras celulares que no pueden verse de ninguna
otra manera. La resolucin mucho mayor que puede obtenerse justifica el cuidado,
el tiempo y el gasto que representa la preparacin de micrografas electrnicas.

Figura 7: (a) Recorrido de los electrones en un microscopio electrnico. (b) Microfotografa de msculo
atrial aumentado x20000.

1.2.1. El sombreado

Si slo tiene que observarse el contorno de un organismo, no son necesarias

secciones finas y sobre la rejilla metlica pueden montarse clulas enteras. Para
aumentar el contraste de las clulas entras se recurre generalmente al sombreado.
Esto implica el recubrimiento de la muestra con una fina capa de metal como, por
ejemplo, paladio, cromo u oro. El metal se deposita sobre el objeto por un lado de
forma que se crea una sombra. De esta manera el objeto aparece con grosor y

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forma. El sombreado se utiliza a menudo para observar apndices superficiales en

las bacterias.

Figura 8: Micrografa electrnica de una clula sombreada mostrando los flagelos.

1.2.2. La tincin negativa

Otro modo de conseguir contraste con el microscopio electrnico es la tincin

negativa. Se aplica el mismo principio que en la tincin negativa del microscopio
ptico. Se utiliza una sustancia que no penetra la estructura pero que dispersa los
electrones. Una de las tinciones negativas ms comnmente utilizadas en la
microscopia electrnica se realiza con cido fosfovolfrmico (fosfotngstico).

Figura 9: Micrografa electrnica con tincin negativa.

1.2.3. Rplicas de carbono

Para examinar las superficies celulares pueden prepararse rplicas de carbono

evaporando sobre la superficie de las clulas una fina capa de carbono que se
adapta a los contornos de la superficie celular y que cuando es desprendida resulta
suficientemente delgada para poder observarse directamente al microscopio
electrnico.

Figura 10: Micrografa electrnica de una rplica de carbono de una aleacin de niquel.

1.2.4. Criocorrosin

Otra tcnica de la microscopia electrnica recientemente desarrollada es la de

criocorrosin (freeze-etching), que evita la formacin de artefactos al eliminar la
fijacin qumica y la inclusin. La muestra que va a examinarse es congelada sin
tratamiento qumico y el bloque congelado se corta con una cuchilla de diamante,

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de tal modo que quedan expuestas porciones de las superficies de las clulas. Se
hacen y se examinan entonces rplicas en carbono de esas superficies, pudindose
observar estructuras superficiales o internas de las clulas. La mayora de las
estructuras celulares vistas en secciones ultrafinas de preparaciones fijadas
qumicamente se ven tambin en material congelado, lo que sugiere que esas
estructuras no son artefactos.

Figura 11: Micrografa electrnica de una rplica celular por criocorrosin.

1.2.5. El microscopio electrnico explorador

Otro instrumento reciente para examinar las estructuras superficiales es el

microscopio electrnico explorador (scanning electron microscope). El material
que se estudia es recubierto con una pelcula fina de un metal pesado tal como el
oro. El rayo de electrones es dirigido sobre la preparacin y la va recorriendo y
explorando por todas la superficie. Los electrones dispersados por el metal pesado
activan una pantalla de observacin produciendo una imagen. Con el microscopio
electrnico explorador pueden observarse incluso muestras muy grandes, siendo
muy buena la profundidad de campo. El aumento que puede obtenerse oscila entre
uno tan bajo como x15 y uno tan alto como x100000, pero slo puede observarse
la superficie de un objeto.

Figura 12: (a) Recorrido de los electrones en un microscopio electrnico explorador.

(b) Microfotografa de la cabeza de una hormiga.

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