El pH intracelular regula la apoptosis inducida por TRAIL y la

necroptosis en clulas endoteliales

Zhu-Xu Zhang , 1, 2, 3, 4, * Ingrid Gan , 1, 4 Alexander Pavlosky , 1, 4 Xuyan Huang , 1 Benjamin
Fuhrmann , 1, 5 yAnthony M. Jevnikar 1, 2, 3, 5, *

La informacin del autor notas Artculo licencia y derechos de informacin

Abstracto
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1. Introduccin
El estrs inflamatorio puede mediar en diversas formas de muerte celular, que son
relevantes para diversas formas de enfermedad humana. La muerte celular es
particularmente relevante para el trasplante de rganos, ya que el estrs incluye tanto la
hipoxia temporal como el rgano se recupera y la inflamacin asociada con la reperfusin
tras el restablecimiento del flujo sanguneo [ 1 , 2 ]. La apoptosis se basa en una cascada
intracelular de miembros de la familia de la caspasa que conduce a la formacin de
membrana de los cuerpos apoptticos unidos que se eliminan por fagocitosis no
inflamatoria, como la lesin renal de la molcula 1- (KIM-1-) mediada por la depuracin de
clulas [ 3 , 4]]. Recientemente se han descrito formas reguladas de necrosis. La necrosis
regulada da como resultado una lisis celular e inflamacin intensa en respuesta a la
liberacin del contenido celular. El alcance de la necrosis regulada ha evolucionado
rpidamente para incluir no slo necroptosis, sino tambin ferroptosis, oxitosis, partnatos
y piroposis y otros [ 5 ].
Necroptosis es dependiente de interactuar con el receptor protena quinasa 1/3 (RIPK1 / 3)
para mediar la muerte celular [ 6 , 7 ]. Esta va es inducida por diversos ligandos
incluyendo TNF , FasL y Toll-like receptor (TLR) compromiso. De nota, relacionados
con el TNF relacionados con la apoptosis inducida por el ligando (TRAIL-) mediada por la
apoptosis ha sido descrito como un mtodo para inducir la muerte de clulas cancerosas a
travs de la activacin de caspasa-8 [ 8 , 9 ]. Ms recientemente, TRAIL se ha demostrado
que tambin induce necroptosis en las clulas cancerosas [ 10 - 12 ]. Curiosamente, las
clulas pueden ser sensibilizados a la muerte necropttica a travs de la inhibicin o la
alteracin de protenas endgenas como el factor 2 (TRAF2) asociado al receptor de TNF
[13 ] o inhibidor celular de la apoptosis 1/2 (CIAP1 / 2) [ 14 ]. Adems, existen
interacciones entre los componentes de la apoptosis y las vas de necroptosis. La
necroptosis puede ser inducida espontneamente a travs de la delecin gentica de la
caspasa-8 [ 15 - 17 ] que es embrionariamente letal, as como a travs de la eliminacin de
Fas asociada a la muerte del dominio de protenas (FADD) [ 18 ], o oligomerization
intracelular de RIPK3 [ 19 ] . Caspasa-8 regula la necroptosis principalmente a travs de la
escisin y la inactivacin de la necroptosis inductor de molculas RIPK1 y RIPK3
[ 16 ]. RIPK3 media la activacin de la mezcla de linaje quinasa de dominio similar
(MLKL) [ 20 , 21], la molcula efectora que en ltima instancia, induce la muerte
necropttica induciendo membrana descomposicin [ 22 ].
Necroptosis ha sido implicado en una variedad de enfermedades inflamatorias que se han
revisado [ 23 - 25]. De inters, la inhibicin de la necroptosis se ha demostrado ser
beneficioso en el corazn [ 26 ] y isquemia renal reperfusin lesin (IRI) [ 27 ]. Adems de
otros, hemos demostrado que silenciar la caspasa-8 por siRNA en los riones puede
mejorar la funcin y prolongar la supervivencia en IRI renal modelos [ 28 , 29 ]. Tambin
hemos demostrado que la eliminacin de RIPK3 en los rganos donantes es beneficiosa
despus de renal [ 30 ] o cardaca [ 31] trasplante mediante la prevencin de la
necroptosis. Sin embargo, el silenciamiento de la caspasa-8 no fue de un beneficio en el
trasplante renal y aumento de la lesin inflamatoria asociada con el aumento de necroptosis
[ 30 ]. Colectivamente, estos resultados sugieren que IRI y trasplante no representan
modelos idnticos en trminos de caspasa-8 de control. Se ha descrito que TRAIL inducida
por la muerte celular necrtica puede ocurrir sin caspasa-8 inhibicin en el bajo pH
extracelular [ 11 ], que era un RIPK1, RIPK3, y poli (ADP-ribosa) polimerasa 1- (PARP-1)
dependiente forma de muerte celular [ 12 , 32 ]. Las clulas parenquimatosas se exponen a
pH cido en condiciones patolgicas en el cerebro, el rin y el corazn [ 33 , 34]. pH en el
rgano rpidamente cae por debajo de 7 despus de la isquemia [ 35 - 39 ]. Por tanto, los
cambios de pH en las clulas podran explicar nuestras observaciones del beneficio algo
paradjico de la inhibicin de la caspasa-8 en los modelos isqumicos agudos y la clara
falta de beneficio en un modelo ms crnico, en el que los cambios agudos del pH
probablemente han resuelto. De hecho, la introduccin de perfusin pulstil de soluciones
tampn a las estrategias clnicas de preservacin de rganos han proporcionado un
beneficio por la minimizacin de los cambios de pH intraorgan y lesin de los tejidos [ 40 ].
En el presente estudio, se demuestra que la inhibicin de la caspasa-8 promueve la necrosis
mediada por TRAIL a un pH fisiolgico extracelular e intracelular normal, pero no a un pH
cido en las clulas endoteliales murinas. Nuestros resultados tambin muestran que la
muerte regulada a un pH cido se basa no slo en la funcin de RIPK1, caspasa-8, sino
tambin PARP-1, implicando parthanatos [ 41 ], as como apoptosis y necroptosis. Estos
hallazgos proporcionan una nueva e importante visin del IRI en el que la inhibicin de la
caspasa-8 ejerce un papel protector en un microambiente de pH bajo, pero la misma
estrategia puede convertirse en proinflamatoria cuando el pH se normaliza.
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2. Materiales y mtodos

2.1. Cultivo de clulas endoteliales microvasculares (MVEC)

MVECs de corazones de ratn fueron aislados y desarrollados como se describe
previamente [ 31 ]. MVEC fenotipo se confirm por tincin con anti-CD31, anti-CD102, y
anti-CD105 (eBioscience) [ 31 ]. Las clulas se cultivaron en EGM-2 MV completo que
contena 5% de FBS, 0,04% de hidrocortisona, 0,4% de hFGF-b, 0,1% de VEGF, 0,1% de
R3-IFG-1, 0,1% de cido ascrbico, 0,1% de hEGF y 0,1% 1000 (Lonza).

2.2. Condiciones de pH
El medio EBM-2 sin factores de crecimiento (Lonza) con HEPES 50 mM (Wisent) se
ajust a pH 7,4 o 6-6,7 usando HCl. Las clulas se hicieron crecer hasta monocapas y se
incubaron en este medio con el pH indicado. Se detect el cambio de pH intracelular
usando un indicador de pH rojo pHrodo (ThermoFisher) y se monitoriz utilizando el imn
de clulas vivas IncuCyte (Essen Bioscience). Una alta intensidad de fluorescencia es
indicativa de un pH intracelular ms bajo.

2.3. Mancha occidental

La protena se aisl del tejido del corazn usando tampn de lisis de clulas completas
(HEPES 20 mM, NaCl 0,4 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, DTT 1 mM y PMSF 1
mM). La concentracin de protena se determin usando el ensayo de protena Bio-Rad
(Bio-Rad). Se aadi tampn de muestra (2ME, glicerol, azul de bromofenol y Tris-HCl) a
la protena y se separ por electroforesis en gel. La protena se transfiri a una membrana
de nitrocelulosa utilizando el sistema de transferencia en seco iBlot (Invitrogen). Las
membranas se incubaron con anticuerpo de conejo anti-RIPK1 ( EPR19697 , Abcam),
policlonal de rata anti-ratn MLKL (Milipore), de conejo anti-gliceraldehdo 3-fosfato
deshidrogenasa (GAPDH, Proteintech Group), o anti- - actina (Sigma Aldrich). La
protena se visualiz utilizando anti-IgG secundaria con peroxidasa de rbano conjugado y
sustrato quimioluminiscente (Millipore).

2.4. ARN de interferencia pequea (siRNA)

MVECs fueron transfectadas con MLRL siRNA o codificado (sin sentido) siRNA (Santa
Cruz Biotech, CA) con Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las clulas fueron
transfectadas con 2 g de la siRNA en medio reducido en suero durante 5 horas y luego se
incubaron en medio completo durante 24 horas por los protocolos de fabricacin. Las
clulas se prepararon para su posterior anlisis y experimento.

2.5. PCR en tiempo real

Se extrajo ARN total de tejido o clulas mediante extraccin de Trizol (Invitrogen). El
cDNA se gener a partir de ARN utilizando Superscript II (Invitrogen). Los cebadores
utilizados para la PCR en tiempo real incluyen los siguientes: MLKL 5'-TTG CTG GGA
GCA AAT AGC-3 'y 5'-GAG TTT GAG CCA GCC TGT-3' y - actina 5'-CCA GCC TTC
CTT CCT GGG TA y 3'-CTA GAA GCA TTT GCG GTG CA. La PCR cuantitativa en
tiempo real se realiz sobre cantidades estandarizadas de cDNA utilizando la mezcla SYBR
QPCR. Se us la amplificacin de \ beta - actina como control endgeno. El valor del ciclo
de umbral delta normalizado y los niveles de expresin relativa (2 - Ct ) se calcularon
segn el protocolo del fabricante.

2.6. Ensayo de muerte celular

MVECs fueron cultivadas a una monocapa en una placa de 96 pocillos (2 10 4 clulas /
pocillo) y se trataron con 100 ng / ml de TRAIL de ratn recombinante (Peprotech), 100
nM segundo activador mitocondrias derivadas de la caspasa (SMAC) compuesto mimtico
(SMC, GDC-0152, Selleckchem), 50 M zIETD-fmk, 20 M Necrostatina-1s (Nec-1s), y
50 M PARP-1 inhibidor 3-aminobenamide (3-ABA, Calbiochem). En el momento del
tratamiento, se aadieron 100 nM de la molcula intercalante de ADN, Sytox green
(Invitrogen), para detectar la muerte celular. La fluorescencia de Sytox (clulas positivas /
pocillo) se midi cada hora utilizando imgenes de clulas vivas IncuCyte (Essen
Bioscience).

2.7. Anlisis estadstico

Los datos se compararon utilizando la prueba t de Student para valores no
emparejados. Los datos se presentaron como media desviacin estndar (DE). p valores
por debajo de 0,05 se consideraron significativamente diferentes.
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3. Resultados

3.1. El pH intracelular se redujo en MVEC crecido bajo condiciones cidas

MVECs se hicieron crecer a monocapas, y los cambios de pH intracelular en pH 5.4-8.4
medio fueron detectados por pHrodo rojo fluorescencia indicador ( Figura 1 (a) ]. El
aumento de la intensidad de fluorescencia en las clulas a pH cido demostr que el pH
intracelular MVEC estaba directamente relacionado con el pH del medio ambiente
(Figuras 1 (b) y 1 (c) ). Sin embargo, el pH intracelular restaurado hacia pH neutro despus
del tiempo como se indica por la disminucin de la intensidad de fluorescencia en las
clulas ( Figura 1 (c) ]. MVEC expres un alto nivel de TRAIL receptor DR5, pero esto no
cambi en condiciones cidas ( Figura 1 (d) ].

Figura 1
MVECs expresar altos niveles de DR5 y responder a cambios de pH extracelular. (a)
MVECs en triplicados en una placa de 96 pocillos se tieron con el colorante pHrodo rojo
(ThermoFisher) durante 30 minutos antes de ser incubados en el medio a pH 5.4, ...

3.2. La inhibicin de la caspasa no indujo la necroptosis en MVEC en

condiciones cidas
Para probar si el pH del microambiente podra afectar la modalidad de muerte por MVEC,
la necroptosis fue inducida por una combinacin de compuesto mimtico SMAC (SMC),
TRAIL y inhibidor de caspasa 8 IETD-fmk. El inhibidor RIPK1 Nec-1s, que bloquea la
necroptosis, se aadi a cultivos a pH 7,4 (Figuras 2 (a) y 2 (d) ), pH 6,7 o pH 6,0
(Figuras 2 (b) , 2 (c) y 2 (d) ). A un pH normal de 7,4, TRAIL ms SMC indujo un bajo
nivel de muerte celular y predeciblemente se someti a necroptosis con caspasa-8
inhibicin utilizando IETD-fmk-TRAIL mediada por la muerte celular (con IETD 6209
1274 versus sin IETD 3701 127 Sytox - clulas positivas a las 12 horas, p= 0,013). La
muerte de MVEC inducida por TRAIL / IETD podra inhibirse al mximo mediante la
adicin de Nec-1s (1846 340, p = 0,002), confirmando que se trataba de necroptosis
mediada por RIPK. La gran reduccin de la muerte celular utilizando Nec-1s en clulas
TRAIL / SMC sugiere que la forma primaria de muerte es necroptosis, aunque la cantidad
residual de muerte celular puede atribuirse a la apoptosis u otras formas de muerte
celular. El MVEC a pH 6,7 sufri una muerte celular sustancial tras TRAIL ms
tratamiento con SMC solo (1736 592 sin tratamiento frente a 9088 1609 clulas Sytox
positivas a las 12 horas, p = 0,0005). Sin embargo, en marcado contraste con los resultados
a pH 7,4, la adicin del inhibidor de la caspasa-8 IETD-fmk no aument la muerte pero
bloque sustancialmente la muerte celular (3842 \ pm 1236 clulas Sytox positivas, p=
0,004). Adems, hubo un efecto mnimo con Nec-1s solo en clulas TRAIL / SMC. La
muerte celular a pH 6,0 ( Figura 2 (c) ) es similar al resultado a pH 6,7. Estos datos
sugieren que el compromiso de TRAIL es capaz de inducir la muerte celular en un entorno
de pH normal y cido, pero que el pH bajo altera la muerte celular a la apoptosis. Adems,
en distinto contraste con pH 7,4, la muerte de MVEC puede ser bloqueada por la inhibicin
de la caspasa-8 mientras se intentaba atenuar la muerte de MVEC a pH 7,4 por inhibicin
de caspasa-8 result en ms muerte de MVEC a travs de necroptosis.

Figura 2
La modalidad de muerte celular MVEC depende del pH. (a) MVECs (por triplicado) fueron
tratados con 100 TRAIL ng / ml, 100 nM SMC, 50 M zIETD-fmk, y 20 M NEC-1s a
pH 7,4. La respuesta cintica de la muerte celular de MVEC ...

3.3. La muerte celular inducida por TRAIL en condicin cida depende de

PARP-1
Como se ha sealado por otros [ 32 ], la necrosis en condiciones cidas parece ser
dependiente de la activacin de PARP-1 en las clulas cancerosas. Para probar esto en
MVEC, las clulas se trataron con el inhibidor especfico de caspasa-8 zIETD-fmk junto
con el inhibidor de PARP-1 3-ABA y se expusieron a TRAIL a pH 7,4 (Figuras 3 (a) y 3
(c) ) y pH 6,7 (Figuras 3 (b) y 3 (c) ). A pH 7,4, MVEC se someti a necroptosis despus de
la adicin de zIETD-fmk (TRAIL / IETD 10368 2208 frente a 1136 136 clulas no
positivas tratadas con Sytox, p= 0,014). La adicin de TRAIL / SMC solo aument la
muerte mnimamente en 12 horas, aunque el inhibidor PARP-1 3-ABA redujo la muerte
por debajo de la lnea de base. En contraste, como se observ anteriormente a pH 6,7, la
muerte inducida por TRAIL / SMC podra ser parcialmente recuperada por ambos zIETD
(sin IETD 14328 1990 frente a IETD 8581 1100, p = 0,012). Sin embargo, la adicin de
3-ABA (1146 672, p = 0,0006) redujo la muerte celular a la lnea de base, lo que indica
que la muerte celular dependiente de PARP-1, as como la apoptosis se producen en
condiciones cidas.
figura 3
MVEC muerte en condicin cida es dependiente de PARP-1. (a) MVECs (por triplicado)
fueron tratados con 100 TRAIL ng / ml, 100 nM SMC, 50 M zIETD-fmk, y / o 3-ABA a
pH 7,4. Las respuestas de muerte celular cintica se midieron por ...

3.4. RIPK1 Clivaje bajo pH 7,4 y 6,7

Un estudio previo ha demostrado que RIPK1 no se escinde bajo condiciones de pH cido
en HT29 clulas, lo que puede explicar por qu RIPK1-dependiente de la necrosis puede
ocurrir en condiciones cidas [ 12 ]. A continuacin se determin si TRAIL tratamiento en
ambas condiciones fisiolgicas y cidas resultados en RIPK1 clivaje. Curiosamente, RIPK1
se escindi en TRAIL tratamiento a pH 7,4, as como pH 6,7 ( Figura 4 ]. La escisin de
RIPK1 permaneci dependiente de la caspasa-8 como la inhibicin de la caspasa-8 por z-
IETD-fmk evit la escisin de RIPK1 en condiciones normales y cidas ( Figura 4 ).

Figura 4
RIPK1 clivaje a pH 7,4 y 6,7. Igual nmero de MVEC fueron inducidos a la muerte celular
como se describe en la Figura 2 a pH 7,4 y 6,7. Las MVEC se cosecharon 8 horas despus y
se analizaron para la escisin de RIPK1 (74 kDa y 47 kDa) mediante anti-RIPK1 ...

3.5. La muerte celular inducida por TRAIL en condicin cida es dependiente

de MLKL
MLKL es la molcula efectora terminal para la necroptosis, ya que induce la ruptura de la
membrana celular despus de la fosforilacin por RIPK3 [ 20 , 42 ]. Para probar la
contribucin de esta protena verdugo en la necratosis inducida por TRAIL en condiciones
cidas, MLKL fue silenciado en MVEC utilizando siRNA como lo confirmaron PCR y
Western blot anlisis (Figuras 5 (a) y 5 (b) ). Como se muestra en la Figura 5 (c) , la muerte
celular inducida por TRAIL se atenu en clulas tratadas con siRNA MLKL a pH 6,7
(clulas Sytox positivas a las 12 horas: 2277 456 frente a 7033 753 en clulas tratadas
con siRNA mezclado, p = 0,002), lo que confirma que la necroptosis dependiente de
MLKL se produce en condiciones cidas.

Figura 5
La necrosis regulada por la acidosis depende de MLKL. (a) El tratamiento con ARNip de
MLKL disminuye la expresin de mRNA de MLKL como se confirm mediante anlisis de
PCR en tiempo real como se describe en Materiales y Mtodos ( n = 3). (b) La disminucin
de la protena MLKL se analiz por anti-MLKL en ...
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4. Discusin
La necroptosis contribuye a la patognesis de muchas enfermedades inflamatorias. Hemos
demostrado previamente que RIPK3-dependiente necroptosis resultados en el aumento de
la inflamacin y la supervivencia reducida en renal y trasplantes de corazn. Esta reduccin
de la supervivencia se asoci estrechamente con mayores lesiones de rganos y la
liberacin de proinflamatorias asociadas a los daos celulares patrones moleculares
(CDAMP) [ 30 , 31 ]. Hemos observado previamente que la inhibicin de la caspasa-8
produce un beneficio durante IRI. Caspase-8 silenciamiento en un modelo renal IRI
proporcion proteccin de lesiones y mejor la supervivencia a corto plazo
[ 28 , 29 ]. Como la lesin de rganos se ha demostrado que mejorar mediante la
apuntacin apoptosis muerte celular [ 28 , 29 , 43 -46 ], seal que la caspasa-8
silenciamiento por siRNA en un modelo de aloinjerto renal no tena un beneficio esperado
y de hecho dio lugar a una masiva necrosis in vivo y acelerado rechazo del injerto
[ 30 ]. Estos hallazgos dispares utilizando la misma intervencin en dos modelos diferentes
pueden aludir a muchas diferencias entre los modelos agudo (IRI) y crnico (trasplante),
claramente divergen en respuesta a la seleccin selectiva caspase-8. Las clulas
parenquimatosas que carecen de oxgeno y nutrientes en IRI aguda y en la fase temprana
del trasplante pueden responder de forma similar a la hipoxia, pero el IRI se resuelve
rpidamente mientras la aloinmunidad persiste en el trasplante. Estos modelos pueden
resaltar la importancia del microambiente celular en la muerte celular.
Las clulas isqumicas sometidas a metabolismo anaerbico generan cido lctico y
experimentan una cada subsiguiente en el pH intracelular. Nuestro estudio ha demostrado
claramente que los cambios en el pH del microambiente de las clulas endoteliales conducir
a un cambio de pH intracelular y alterado la funcin de la caspasa-8 y otras protenas. El
mecanismo de equilibrio de la muerte celular y en particular, la apoptosis y la necroptosis
en las clulas endoteliales cambios en condiciones cidas. La apoptosis y la necroptosis
ocurren simultneamente en respuesta a la activacin de TRAIL en clulas endoteliales en
condiciones cidas. Nuestros hallazgos proporcionan una nueva e importante visin de
nuestra observacin de que la inhibicin de la caspasa-8 puede desempear un papel
protector durante IRI relacionados con un pH intracelular y un microambiente bajos,
mientras que paradjicamente se convierten en proinflamatorios en el transplante en un
entorno de pH normal.
La muerte en las clulas endoteliales a un pH cido se basa en la funcin de RIPK1 y la
caspasa-8 (Figuras (cifras22 y y3).3 ). PARP-1 tambin parece estar afectado por el
microambiente celular, desempeando un papel limitado en la necroptosis a pH 7,4
[ 47 , 48 ], y evidente en la muerte de clulas de pH bajo observado aqu ( Figura 3 ] y otros
[ 32].]. Dada la funcin distinta de la caspasa-8 y la influencia de PARP-1, la naturaleza
precisa de la muerte celular que hemos observado a pH bajo que hemos denominado
"acidonecrosis" no encaja bien como necroptosis clsica o apoptosis. Un estudio previo
mostr que TRAIL media apoptosis a travs de la activacin de la caspasa, citocromo C
liberacin, y PARP-1 clivaje en clulas tumorales humanas a pH cido [ 49 , 50 ]. Otros
estudios han demostrado que TRAIL puede inducir fcilmente la muerte celular en clulas
tumorales a pH 6,5 pero en un grado significativamente menor a pH 7,4
[ 11 , 12 , 32 , 49]. Por el contrario, nuestro estudio muestra que MVEC fcilmente se
someti a necroptosis clsica a pH 7,4, as como "acidonecrosis" a pH 6-6,7 despus de
TRAIL tratamiento ( Figura 2 ]. Las diferencias en ciertas modalidades de muerte entre
tipos de clulas podran permitir que las terapias dirigidas especficas de rganos sean ms
eficaces.
El mecanismo de "acidonecrosis" no est claro. RIPK1, RIPK3, caspasa-8 y PARP-1
parecen ser necesarios para inducir la muerte necrtica con TRAIL a pH
bajo. Curiosamente, la cuestin de si PARP-1 se activa aguas arriba o aguas abajo de
RIPK1 sigue siendo incierto. RIPK1 activacin se ha demostrado que antes de la secuencia
de PARP-1 de activacin siguiente de ADN de alquilacin [ 51 ]. Sin embargo, la
inhibicin de RIPK1 tambin es capaz de inhibir la activacin de PARP-1 y la liberacin
del factor inductor de la apoptosis (AIF) de la mitocondria despus de la necrosis regulada
mediada por -lapa- quona [ 52 ]. Un hallazgo nico y novedoso en el presente estudio es
la inhibicin de TRAIL mediada por la muerte celular despus de la silenciamiento de
MLKL por siRNA en condiciones de pH bajo ( Figura 5). MLKL activacin ocurre aguas
abajo de RIPK1 / RIPK3 fosforilacin y es tanto necesario y suficiente para inducir
necroptosis [ 21 , 22 , 42 , 53 ]. Una pregunta importante sigue siendo: si la activacin de
MLKL es suficiente para inducir la necroptosis normalmente, por qu es necesaria la
activacin de PARP-1 para la "acidonecrosis"? Un estudio reciente puede aportar alguna
idea de esta cuestin, ya que la necroptosis dentro de un injerto renal trasplantado puede
causar, notablemente, partos paranos distantes, tambin por un mecanismo desconocido
[ 41 ]. Esta importante observacin puede sugerir que la acidonecrosis observada in vitroes
una necroptosis mediada por TRAIL que conduce a una forma paracrina de
parthanatos. Adems, un estudio previo mostr TRAIL mediada por la apoptosis PARP-1
clivaje a bajo pH [ 49 , 50 ]. Se necesitaran estudios detallados para detallar las posibles
seales implicadas, a saber, si esto ocurre por vesculas unidas a membrana capaces de
fusionarse con otras clulas o si el contenido citoplasmtico puede inducirlo. Claramente,
se requieren ms estudios para determinar los papeles esenciales de la caspasa-8, la
activacin de PARP-1 y MLKL durante "acidonecrosis". Sin embargo, sigue siendo
controvertido si la necrosis / parthanatos mediada por PARP-1 implica RIPK1 / 3 y
depende de tipos de clulas utilizadas en diferentes estudios [ 32 , 47 , 51]. Nuestros datos
sugieren que PARP-1 participa en "acidonecrosis" ( Figura 3 ] en MVEC. Es posible que
PARP-1 puede ser el efecto aguas abajo de la apoptosis y la necrosis a pH cido [ 32 , 54 ].
En condiciones de pH intracelular cido, las funciones celulares como el transporte de
iones, las actividades enzimticas, la sntesis de protenas y la sntesis de ADN puede ser
disminuida o alterada [ 33 , 34 , 55 , 56 ]. Las condiciones de pH cido pueden dar lugar a
una disminucin del nivel intracelular de K + debido a la actividad de la bomba H + /
K + . Una disminucin de la concentracin de K + resulta en la activacin de caspasas y
nucleasas y, por tanto, conduce a dao al ADN [ 57 , 58 ] y apoptosis [ 59 - 61]]. Este
mecanismo podra explicar por qu la acidosis induce la muerte de clulas apoptticas en
varios tipos de clulas, incluyendo las clulas endoteliales mediante la activacin de
caspasas [ 50 , 62 - 64 ]. Sin embargo, otros estudios demostraron que la acidosis protege
las clulas endoteliales de la apoptosis mediante el bloqueo de la activacin de caspasas o
el aumento de la expresin de las molculas antiapoptticas [ 65 - 68 ]. Requiere un estudio
adicional para definir los diferentes tipos de programa de muerte celular en diferentes tipos
de clulas.
Un estudio reciente ha demostrado que la necrosis inducida por acidosis en las neuronas
depende de la fosforilacin RIPK1 mediada por el canal de iones 1a (ASIC1a) [ 69 ]. La
mediacin ASIC1a de deteccin de cido de la activacin RIPK puede explicar de este
modo cmo se activan RIPKs incluso en presencia de caspasa-8 durante la acidosis. Un
estudio anterior tambin mostr que RIPK1 se escinde a pH normal, pero no se escindi a
pH cido en las clulas tumorales [ 12 ]. Aunque estos resultados podran explicar por qu
RIPK1 puede inducir necroptosis a pesar de la presencia de caspasa-8 actividad [ 11 , 12 ],
nuestros datos mostraron que RIPK1 es parcialmente clivado en condiciones de pH normal
y cido ( Figura 4). Esto indica que la escisin de RIPK1 mediada por caspasa-8 a pH 7,4
no se altera cuando el pH cae a condicin cida. Es probable que TRAIL induce apoptosis y
necroptosis simultneamente a pH cido en MVEC, como RIPK1 solamente se escinde
parcialmente ( Figura 4 ) y la inhibicin de cualquiera de la caspasa-8 o RIPK1 podra
atenuar acidonecrosis (Figuras (cifras22 y AND33 ) .
Ir:

5. Conclusiones
Este estudio destaca la importancia del microambiente celular en la magnitud, progresin y
resultado de varias formas de muerte celular programada. Para la teraputica del cncer, el
tipo de clula y el microambiente del tumor circundante parecen desempear un papel
importante en el aumento de la sensibilidad de las clulas a diferentes modalidades de
muerte celular, que es de importancia central para maximizar la muerte de las clulas
cancerosas. En contraste, con la meta en el trasplante de ser el opuesto con la reduccin
mxima de la muerte celular, la naturaleza y el momento de antideath estrategias durante la
obtencin de rganos y el trasplante se convierte en complejo como probar normotermia e
hipotermia perfusin estrategias as como diferentes soluciones de perfusin con alterado
buffering capacidad para minimizar la lesin isqumica. El microambiente extracelular que
incluye el pH regula claramente los programas intracelulares y subsecuentemente de la
muerte celular que producen inflamacin. El bloqueo de mltiples vas de muerte celular
incluyendo apoptosis y necroptosis y otros tal vez puede ser ms eficaz en la prevencin de
la muerte celular inducida por IRI y lesiones de rganos durante el trasplante que dirigido a
una va de muerte de una sola clula.
Ir:

Expresiones de gratitud
Este estudio fue apoyado por el financiamiento de investigacin de los Institutos
Canadienses de Investigacin en Salud (CIHR, AMJ, ZXZ, MOP-115048 y MOP-
111180). Este trabajo es parte del Programa Nacional Canadiense de Investigacin de
Trasplantes (CNTRP) y fue apoyado por los CIHR y sus asociados (TFU-127880).
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Conflictos de inters
No hay revelaciones financieras o conflictos de inters en este estudio.
Ir:

Referencias
1. Gobe G., Willgoss D., Hogg N., Schoch E., Endre Z. Supervivencia celular o muerte en
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