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Autor de correspondencia: Lisbeth Berrueta. Instituto de Inmunologa Clnica Facultad de Medicina, Universi-
dad de Los Andes, Avenida 16 de Septiembre. Edificio Louis Pasteur. Anexo IAHULA, PO BOX 566. Mrida
5101. Venezuela. Correo electrnico: lberruet@ula.ve
354 Barboza y col.
+
Impaired activation and costimulation of T CD4 lymphocytes
during chronic Hepatitis C infection.
Invest Clin 2008; 49(3): 353 - 367
Key words: Hepatitis C virus, T cell activation, CD28, TGF-b, CD69, CD40L, CD25.
ADN complementario (ADNc) se sigui el pleto solo o en presencia del antgeno del
protocolo de la casa comercial empleando core del VHC (2,5 g/mL) con o sin
la transcriptasa reversa de M-MLV (SuperS- anti-CD28 (1 g/mL) durante 48 h para in-
criptTM III, Invitrogen), utilizando como ini- ducir la expresin de los marcadores de su-
ciador antisentido la secuencia 5` ATA CTC perficie CD40L, CD25 y CD69 y durante 72
GAG GTC CAC GGT CTA CGA GAC CT 3. h para determinar la produccin intracelu-
La amplificacin se realiz en dos rondas de lar de citocinas, en cuyo caso se aadi ade-
PCR empleando los iniciadores: 939 (senti- ms 1 g/mL de Brefeldina 6 h antes de la
do, 5` CTG TGA GGA ACT ACT GTC TT 3`) cosecha. Como control positivo de la esti-
y 209 (anti-sentido, 5` ATA CTC GAG GTC mulacin celular se utilizaron mitgenos,
CAC GGT CTA CGA GAC CT 3`) para la cultivando las clulas con: PMA (200
primera ronda de PCR y los iniciadores 940 ng/mL) e Ionomicina (500 ng/mL) durante
(sentido, 5` TTC ACG CAG AAA GCG TCT 6 h para determinar la expresin de CD40L;
AG 3`) y 211 (anti-sentido, 5` CAC TCT PMA (50 ng/mL) e Ionomicina (1 /mL)
CGA GCA CCC TAT CAG GCA GT3`) para durante 6 h para determinar la produccin
la segunda ronda de PCR (23). Las dos ron- intracelular de citocinas y PHA (20 g/mL)
das de amplificacin se realizaron en un durante 20 horas para determinar la expre-
termociclador programable (PTC-0150 Mini sin de CD69 y CD25.
CyclerTM, MJ Research) y consistieron en 10
min de denaturacin a 94C seguidos de 24 Medicin de la expresin de CD40L, CD25
ciclos de alineamiento y extensin en tres y CD69 en la superficie celular
pasos de 94C durante 25 seg, 50C durante Las CMSP fueron lavadas con
35 seg y 68C durante 2 min, para finalizar PBS-EDTA y resuspendidas en PBS-BSA al
con un paso de 68C durante 7 min (24). 1%, para luego marcarlas con 1 g/mL de
Los productos de la PCR se separaron y ana- anti CD4- FITC, anti CD40L-PE, anti
lizaron mediante electroforesis en gel de CD25-PE y anti CD69-PerCp. Se incubaron
agarosa. Controles negativos y positivos a 4C durante 30 min en la oscuridad y lue-
apropiados fueron utilizados en las dos ron- go de tres lavados mediante centrifugacin
das de amplificacin. fueron fijadas con paraformaldehdo (PAF)
al 3% en PBS y analizadas en el citmetro
Purificacin de clulas mononucleares de flujo.
de sangre perifrica
Las clulas mononucleares de sangre Medicin de la produccin intracelular de
perifrica (CMSP) se purificaron mediante citocinas
gradiente de densidad en Ficoll-Hypaque Las CMSP estimuladas fueron resus-
1,077. Las CMSP extradas se lavaron tres pendidas en PBS/BSA 1% y marcadas con
veces con RPMI para luego resuspenderlas anti-CD4-FITC durante 30 min a 4C, lava-
en RPMI, cuantificarlas y determinar su via- das tres veces, fijadas con PAF al 3% en PBS
bilidad por el mtodo de exclusin del colo- a temperatura ambiente durante 10 min,
rante azul de tripano. Las clulas fueron permeabilizadas con saponina al 0,09% a
ajustadas con RPMI-suero bovino fetal 4C durante 10 min y luego teidas con 1
(SBF) al 10% a 7105 clulas/200 L. g/mL de los anticuerpos contra las citoci-
nas respectivas (IFN-g e IL-10) marcados
Condiciones de cultivo con PE, a 4C durante 30 minutos en oscu-
Las CMSP (7105 cel/mL) fueron cul- ridad. En el caso del marcaje con
tivadas (37C y 5% de CO2) en medio com- anti-TGF-b biotinilado, las clulas fueron la-
vadas, fijadas, permeabilizadas e incubadas grama GraphPad PRISM (versin 4.00). Los
durante 1h a 4C con 10 g/mL de estrep- resultados se expresan como la media
tavidina a fin de bloquear la biotina endge- desviacin estndar (DS). Se consideraron
na, posterior a tres lavados, las clulas fue- estadsticamente significativos a los valores
ron incubadas con anti-TGF-b biotinilado, de p < 0,05.
lavadas y seguidamente teidas con estrep-
tavidina-PE. Luego de tres lavados las clu- RESULTADOS
las fueron analizadas mediante el citmetro
de flujo. Para analizar la expresin de cito- Valoracin clnica, serolgica y virolgica
cinas intracelulares en los linfocitos CD4+ de los individuos infectados
se sigui la metodologa que se describe en En la Tabla I se resumen los datos de
la seccin Anlisis por citometra de flujo. la valoracin clnica de los individuos infec-
tados crnicos. Como puede observarse en
Anlisis por citometra de flujo general la poblacin estudiada presentaba
Las muestras fueron analizadas en un un cuadro inflamatorio heptico a juzgar
citmetro de flujo FACsort mediante el pro- por los niveles elevados de las enzimas he-
grama Cell Quest (Becton Dickinson). Fue- pticas. La infeccin por el virus VHC pudo
ron capturados 10.000 eventos y mediante ser corroborada mediante el Nested RT-
un grfico tipo dot-plot, se estableci la PCR en todos los individuos diagnostica-
regin donde se ubican las clulas linfoides dos mediante tcnicas inmunoenzimticas.
en un grfico de FSC (Forward scatter) y
SSC (Side scatter), de esta regin se selec- El entrecruzamiento de CD28 favorece
cionaron aquellas clulas con marcaje posi- la activacin antgeno especfica
tivo para CD4. La expresin de marcadores de los linfocitos T CD4+ en pacientes
de superficie y citocinas intracitoplasmti- infectados con VHC
cas fue analizada solamente en este grupo Para analizar la respuesta de clulas T
celular mediante dobles marcajes. Las lec- cooperadoras contra el antgeno del core
turas fueron realizadas mediante porcenta- del VHC y el efecto de la coestimulacin
jes de expresin de las molculas en estu- mediada por CD28 analizada a travs del
dio. Los datos son expresados como diferen- entrecruzamiento de CD28 en la membrana
cias entre clulas estimuladas o no con los celular (lo cual es comparable al acopla-
antgenos indicados. miento con sus ligandos en las clulas pre-
sentadoras de antgeno), se compararon la
Anlisis estadstico respuesta de los controles, de los familia-
El porcentaje de expresin de cada res/contacto seronegativos y la de los indi-
marcador de superficie o de la produccin viduos seropositivos infectados crnicos. La
de citocinas intracelulares se analiz usan- Fig. 1a muestra que en respuesta al antge-
do la prueba t-student calculada con el pro- no del core del VHC, existe una tendencia
TABLA I
CARACTERSTICAS CLNICAS DE LOS INDIVIDUOS CRNICAMENTE INFECTADOS
*
Familiares/contactos, al compararlo con los
* controles (p < 0,05), que no sufri cambios
cuando se utiliz el anticuerpo anti-CD28
(Fig. 2).
Fig. 2. Efecto del estmulo anti-CD28 ms core, sobre la expresin de CD25 en los linfocitos CD4+ de
pacientes infectados crnicos con VHC. La Fig. 2 muestra la expresin de CD25 en respuesta
a la estimulacin con antgeno del core del VHC solo o en combinacin con el anticuerpo
anti-CD28 durante 48 h, en controles sanos (izquierda), pacientes infectados crnicos (me-
dio) y familiares/contactos (derecha). *Se refiere a p < 0,05.
dos como los familiares contactos producen CD28 en los linfocitos CD4+ de los pacien-
niveles comparables de IL-10 frente al ant- tes infectados crnicos (p < 0,05).
geno, independientemente del entrecruza- Con la finalidad de descartar la posibili-
miento de CD28 (Fig. 4a). Sin embargo, la dad de una supresin generalizada de la res-
estimulacin con antgeno del core induce puesta en los individuos infectados crnicos,
un incremento significativo en la produc- las CMSP fueron estimuladas con mitgenos
cin de TGF-b slo en los pacientes infecta- policlonales, evidencindose que los indivi-
dos crnicos (p < 0,05) (Fig. 4b). Este in- duos infectados respondieron expresando los
cremento especfico en la produccin de marcadores de activacin y las citocinas me-
TGF-b es abolido cuando adems del est- didas en cantidades comparables a las de los
mulo antignico se entrecruza la molcula controles (datos no mostrados).
resultados muestran que los linfocitos citos T CD4+ de sangre perifrica, no se evi-
CD4+ de los pacientes infectados crnicos denci respuesta entre los controles, lo que
incrementaron la expresin de CD69 en for- indica que el producto recombinante no
ma significativa solo cuando las clulas fue- contiene ningn elemento adicional que
ron estimuladas con antgeno del core aso- pudiera estimular de forma inespecfica a
ciado al entrecruzamiento de CD28. Este las clulas T y que las observaciones anali-
incremento en CD69 no fue significativo en zadas en los distintos grupos son antgeno
los familiares contacto aunque se observ especficas. Adicionalmente, se evidencia
una tendencia positiva, que probablemente que bajo las condiciones experimentales
amerita el anlisis de un mayor nmero de empleadas en este estudio, no se estimulan
muestras. Estos datos sugieren que existe las clulas T vrgenes, an empleando anti-
un dficit en la sealizacin de esta princi- CD28 como seal coestimuladora, y que la
pal va de coestimulacin requerida para la respuesta observada en los pacientes infec-
activacin de los linfocitos T. tados y contactos corresponde a la estimu-
Por otro lado se evidenci que no hubo lacin de clulas de memoria y/o efectoras.
incremento en la expresin de CD40L en las Hay varias alternativas para explicar la
clulas CD4+ de los pacientes infectados presencia de respuesta inmunitaria celular
crnicos en respuesta al core del virus, a di- en personas seronegativas: 1) Que se trate
ferencia de lo que se observa en los familia- de respuesta de estimulacin de clulas vr-
res contacto. Por cuanto la molcula CD40L genes, o respuesta inmunitaria primaria in
es necesaria para la maduracin de clulas T vitro. Esta alternativa puede ser descartada
y clulas dendrticas, su dficit podra con- pues de ser as se observara tambin en los
ducir a un crculo vicioso que mantiene una controles sanos (12, 13) y adems la esti-
poblacin de clulas T anrgicas, parcial- mulacin in vitro de clulas vrgenes re-
mente activadas o simplemente reguladoras quiere de varias rondas de estimulacin en
durante la infeccin crnica (28, 29). Estas presencia de citocinas como la IL-2 y de c-
observaciones requieren de experimentos lulas dendrticas maduras, lo que sugiere
adicionales que incluyan un mayor nmero que se trata ms bien de respuestas de clu-
de pacientes para obtener conclusiones defi- las T de memoria tal como se ha reportado
nitivas. Sin embargo, cabe destacar que las entre los casos recuperados (9). 2) Algunos
tendencias reflejadas en este trabajo, sugie- sugieren que estos individuos nunca estu-
ren un dficit en seales de coestimulacin vieron infectados o simplemente tuvieron
en clulas CD4+ en respuesta al core de contacto con virus muertos o no infeccio-
VHC en pacientes infectados crnicos. sos, pero de ser as no habra respuesta po-
Aunque nuestros resultados no lo liclonal ante las protenas no estructurales
muestran en forma definitiva, el patrn de que necesariamente deben producirse en el
respuesta observado en los familiares con- transcurso de la replicacin viral, lo que in-
tactos de los pacientes infectados se corres- dica que hubo una infeccin subclnica y no
ponde con el reportado para los individuos un simple contacto con antgenos virales no
que se han recuperado de la infeccin agu- infecciosos (11, 13). 3) Que la respuesta re-
da, en quienes se detecta una respuesta ce- presente una etapa muy temprana de la in-
lular persistente significativamente ms feccin, alternativa que puede ser descarta-
alta que para los individuos crnicamente da porque la respuesta se conserva en indi-
infectados (30). viduos que han sido seguidos por ms de un
Al utilizar la protena purificada del ao sin observarse seroconversin ni pre-
core del VHC como estmulo para los linfo- sencia del ARN viral en sangre (10). Ade-
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