Resumen: E-051

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E

Comunicaciones Cientficas y Tecnolgicas 2006

Aplicacin de un diseo central compuesto para la determinacin de especies

orgnicas e inorgnicas de arsnico en agua por HPLC-HG-AAS.
Blanes, Patricia S. - Garro, Oscar A. - Gimnez, Mara C. - Hunzicker, Gabriel A.
Ctedra de Qumica Analtica I. - Ctedra de Microbiologa en Alimentos
Facultad de Agroindustrias .U.N.N.E.- Cdte. Fernndez 755. (3700). P. R. Senz Pea, Chaco. Argentina.
Tel-fax: 03732-420137. E-mail: cgimenez@fai.unne.edu.ar
Antecedentes
La concentracin total de arsnico disuelto en agua depende de la composicin geolgica y geoqumica de las reas
naturales de drenaje. Las especies ms abundantes en aguas de ro y aguas subterrneas son las especies inorgnicas
As(III) y As(V). A travs de la actividad biolgica, el arsnico inorgnico puede ser parcialmente detoxificado y
transformado en compuestos orgnicos metilados como por ejemplo, monometilarsnico (MMAs) y dimetilarsnico
(DMAs) entre otros. En aguas de ro las concentraciones de estas dos especies metiladas se encuentran en niveles de
ultra-traza y en algunos casos pueden no ser detectadas.
Las bajas concentraciones de las diferentes especies de arsnico en el medioambiente requieren de tcnicas de elevada
sensibilidad. La mayora de las metodologas descriptas en la literatura para la especiacin de este metaloide emplean la
tcnica acoplada en lnea HPLC-HG-AAS, en la cual, el arsnico en sus distintas formas, en medio cido (HCl) es
reducido cuantitativamente a As(III) por accin de KI, que al reaccionar con solucin de NaBH4 se convierte
instantneamente a arsina AsH3, la cual es arrastrada por un flujo continuo de argn hasta la celda de absorcin de
cuarzo, donde se convierte en tomos al estado gaseoso (Gettar et al., 2000; Martin et al. 1995). La seal generada se
almacena en un registrador de tipo continuo y mediante un programa computacional se integran los picos
cromatogrficos para conocer la respuesta de las especies de arsnico estudiadas.
Dado el gran nmero de variables que intervienen en los mtodos continuos de anlisis, uno de los pasos a seguir debe
ser la optimizacin de aquellas que influyen en la seal analtica, tarea que resulta larga y tediosa cuando se examina
cada variable en forma independiente.
Por lo antes expuesto, el objetivo de este trabajo fue optimizar, aplicando un diseo central compuesto (DCC) 24+* con 7
rplicas del punto central, la cuantificacin de As III, As V, DMAs y MMAs en muestras de agua, mediante la tcnica
acoplada en lnea HPLC-HG-AAS. Esta tcnica estadstica permite establecer la influencia de los factores ms
relevantes como as tambin las posibles interacciones que influyen en la seal, usando un reducido nmero de ensayos.
(Bergoa et al., 1999; Hashemi et al., 2005).
Materiales y Mtodos
Reactivos y patrones
En todos los casos se emplearon reactivos grado reactivo-analtico y agua bidestilada para la preparacin de patrones,
estndares y reactivos. Las soluciones de trabajo se prepararon por dilucin apropiada de soluciones stock de 1000
mg.L-1 de As III (Tritrisol, Merck, Darmastadt, Germany); las soluciones de As V, MMAs y DMAs se prepararon por
dilucin de (Na2HAsO4.7H2O, SIGMA), (CH3AsO3Na2.6H2O, CHEM SERVICE, West Chester PA. USA), y
(CH3)2AsO(OH), FLUKA). cido clorhdrico (HCl). Buffer Fosfato (Na2HPO4 NaH2PO4) 17 mmol.l-1 pH 7. Solucin
de Tetraborohidruro de sodio (NaBH4) (estabilizado en NaOH al 0.5%(p/v)). Solucin de Yoduro de potasio (KI).
Equipamiento
El sistema utilizado en este trabajo se esquematiza en la Fig. 1 y consiste en un cromatgrafo lquido de alta
performence (GILSON), equipado con bomba (Modelo 307), sistema de-gassing (Modelo DG-4400) y vlvula de
inyeccin (RHEODYNE 7125) con loop de 100 :l (WILSON) conectada a la columna analtica (PHENOMENEX). La
bomba peristltica de cuatro vas (GILSON Minipuls 3) bombea los reactivos hacia el coil de reaccin donde una
corriente del gas inerte (Argn) impulsa el hidruro generado (previo paso por el separador gas-lquido) hacia la celda de
cuarzo en forma de T (VARIAN) que se halla en el espectrofotmetro de absorcin atmica (METROLAB 4200 con
corrector de fondo y lmpara de ctodo hueco PHOTRON). La seal del espectrofotmetro se registra con un
convertidor analgico-digital, empleando para el anlisis el software cromatogrfico RIAC-PROCESAR V 2.0.

Fig. 1: esquema del sistema HPLC-HG-AAS

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La Tabla 1 resume las condiciones operativas empleadas.

Tabla 1: Condiciones operativas para HPLC-HG-AAS

Cromatografa lquida de alta performance

Columna 10 m Nucleosil SB 100 A (250 x 4,6 mm)
Fase mvil Buffer fosfato Na2HPO4-NaH2PO4 17 mmol.l-1 pH 7
Volumen de inyeccin 100 l
Generacin de hidruro
Pre-reductor KI 15 ml.min-1 flow rate
Reductor NaBH4 1,5 ml.min-1 flow rate
HCl 1,5 ml.min-1 flow rate
Gas carrier Argn 100 ml.min-1 flow rate
Espectrofotometra de absorcin atmica
Longitud de onda 193,7 nm
Ancho de banda 1,5 nm
T de celda 900 C

Diseo Experimental

De acuerdo a trabajos previos (Gettar et al., 2000; Martn et al., 1995) y nuestras posibilidades de variar diversos
parmetros se opt por analizar la influencia de cuatro factores con el fin de encontrar las mejores condiciones para
cuantificar las cuatro especies de arsnico en estudio. Se utiliz un diseo central de superficie de respuesta rotable, que
responde al arreglo de composicin central 24 + 4 x 2 + 7 con repeticin del punto central, para estimar la influencia
sobre la seal de cada especie de arsnico (Montgomery D. y Runger G., 2000). Las variables se seleccionaron en
funcin de trabajos previos (Morand et al., 2003), las mismas se analizaron en dos niveles: velocidad de flujo del buffer
Na2HPO4-NaH2PO4 (0,8 1,4 ml.min-1), concentracin de HCl (1,2 3,0 mol.l-1); IK (0,9 2,5 % p/v) y NaBH4 (0,8
2,0 % p/v). La Tabla 2 muestra los valores codificados de los niveles de los factores seleccionados y sus respectivos
valores experimentales (-, -1, 0, 1, ), donde =2.00.

Tabla 2: Valores experimentales para los El modelo seleccionado, responde a la siguiente

parmetros de trabajo seleccionados ecuacin:

Cdigos Parmetros -2 -1 0 1 2
A Flujo de buffer (ml.min-1) 0,5 0,8 1,1 1,4 1,7
B HCl concentracin (mol.l-1) 0,3 1,2 2,1 3,0 3,9 donde E(Y) es el valor de la respuesta esperada, 0, i,
C KI concentration (% p/v) 0,1 0,9 1,7 2,5 3,3 ij parmetros del modelo, Xi y Xj son los cdigos de
D NaBH4 concentration (% p/v) 0,2 0,8 1,4 2,0 2,6 los factores estudiados y k es el n de factores
analizados.

Discusin de Resultados

Integrados los cromatogramas, se us el programa computacional Statgraphics Plus 5.0 para determinar los coeficientes
de regresin del modelo de segundo orden. La significancia y ajuste del modelo se realiz mediante anlisis de la
varianza. Los resultados obtenidos para cada especie fueron diferentes y como el objetivo del trabajo fue encontrar las
mejores condiciones para cuantificarlas a la vez; se utiliz un artilugio matemtico de manera de relacionar todas las
especies, el cual fue sumar la relacin rea x altura de cada una ya que de esta manera se compensan las diferencias de
seal que hay entre una especie y otra.
El anlisis de la varianza expresa la variabilidad en la respuesta para cada uno de los efectos por comparacin del
cuadrado de la media y el error experimental estimado. Los resultados del ANOVA, mostraron que existen nueve
efectos con p-valor menores a 0,05 lo cual indica que dichas variables y sus interacciones tienen una significativa
influencia sobre la respuesta (95%). El valor de la prueba de falta de ajuste fue mayor a 0,05 confirmando que el ajuste
del modelo es adecuado, para un nivel de confianza del 95%. El clculo del estadstico Durbin Watson fue superior a
1,40, con lo cual se pudo probar, que no existe autocorrelacin o correlacin serial significativa. Los resultados del test
ANOVA para la relacin rea x altura pueden observarse en la Tabla 3. El diagrama de Pareto (Fig. 2) muestra cada
uno de los efectos estimados en orden decreciente de magnitud. Los efectos individuales ms significativos fueron HCl
(B) y velocidad de flujo del buffer (A), mientras que las interacciones ms importantes fueron las afectadas por la
concentracin del reductor AD (velocidad de flujo de buffer y concentracin de NaBH4), BD (concentracin de HCl y
concentracin de NaBH4) y CD (concentracin de KI y concentracin de NaBH4) como se observa en la Fig. 3.
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Tabla 3: Tabla ANOVA para la relacin rea x altura

Fig. 2: Diagrama de Pareto para la relacin Fig. 3: Interacciones de efectos ms significativos

reaxaltura
Las condiciones ptimas para lograr la mxima respuesta, derivadas de la relacin entre los efectos de las cuatro
especies de As fueron las siguientes: flujo del buffer 1,2 ml.min-1, HCl 3 mol.l-1, KI 1,7 % (p/v), NaBH4 1,4 % (p/v)
(Tabla 4). Dichas condiciones se representan mediante una superficie de respuesta generada por el DCC (Fig. 4), que
permite visualizar las regiones ptimas y determinar la influencia de los factores sobre la relacin rea x altura.

Tabla 4: Optimizacin de la respuesta en funcin de los niveles

mximos y mnimos de los factores experimentales

Fig. 4: Superficie de respuesta estimada

para la relacin rea x altura
Una vez halladas las ptimas condiciones para la separacin de las cuatro especies de arsnico consideradas, se valid
la metodologa analtica, y para minimizar los efectos de matriz la curva de calibracin se realiz mediante un proceso
de adiciones estndares, aadiendo cantidades conocidas de patrones de As III, As V, DMAs y MMAs sobre muestras
reales. La curva de adiciones estndares se construy en siete niveles de concentracin para cada especie: 0,01 - 0,025 -
0,05 - 0,1 - 0,25 - 0,5 y 1 mg.l-1. Cada punto se proces por triplicado.
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Los resultados obtenidos se evaluaron mediante la aplicacin de regresin lineal simple, la cual mostr que existe una
relacin lineal entre la respuesta analtica y la concentracin de las especies dentro del rango estudiado para un nivel de
confianza del 95%.(Tabla 5). En todas las lecturas los coeficientes de variacin fueron menores al 5%.
Para evaluar la exactitud del mtodo, se realizaron ensayos de recuperacin adicionando un patrn de 0,5 mg.l-1 cada
especie a muestras de aguas termal, potable, y subterrnea de baja y alta concentracin salina. En todos los casos los
valores obtenidos se encuentran dentro del rango de 90 a 110 % como se establece en APHA, AWWA, WFF, (1992).

Tabla 5: Parmetros de validacin para determinacin de As III, DMAs, MMAs y As V en agua

As III DMAs MMAs As V

Coef. de Correlacin (r) 0,995 0,998 0,998 0,991

Coeficiente de Determinacin (R2) 0,991 0,997 0,997 0,998
Interseccin 0,008 0,003 0,001 0,001
Pendiente (mg.l-1) 0,24 0,21 0,11 0,19
Error tpico 0,007 0,004 0,002 0,003
Lmite de deteccin (mg.l-1)a 0,01 0,02 0,05 0,02
Lmite de cuantificacin (mg.l-1)b 0,05 0,06 0,11 0,05
Rango Lineal(mg.l-1) 0,025- 1,0 0,05 - 1 0,5 - 1 0,05-0,1

a
Definido como 3/pendiente (n = 10). bDefinido como 10/ pendiente (n = 10).

Conclusiones
De los resultados obtenidos en este estudio preliminar cuyo objetivo fue optimizar, aplicando un Diseo Central
Compuesto 24+* con 7 rplicas del punto central, la cuantificacin de As III, As V, DMA y MMA en agua, mediante la
tcnica acoplada en lnea HPLC-HG-AAS, se puede concluir que:
Debido a que cada especie por separado exhibi diferentes condiciones experimentales para dar la mxima respuesta, se
relacionaron las respuestas de las cuatro especies, que derivaron en las siguientes condiciones ptimas: velocidad de
flujo del buffer 1,2 ml.min-1, HCl 3 mol.l-1, KI 1,7 % (p/v), NaBH4 1,4 % (p/v).
El valor de la prueba de falta de ajuste confirm con un 95% de confianza que el ajuste del modelo es adecuado. El
clculo del estadstico Durbin Watson fue superior a 1,40, confirmando con un 95% de confianza que no existe
correlacin serial significativa. Los resultados derivados de la validacin, mostraron que la metodologa propuesta
result ser lineal, precisa y exacta dentro del rango en estudio para cada especie, lo que permitira cuantificar
simultneamente As III, DMAS, MMAs y As V, en muestras de aguas.
Cabe destacar que esta metodologa est en continuo estudio a fin de realizar un anlisis ms detallado y mejorar los
resultados obtenidos.

Agradecimientos
Los autores agradecen el financiamiento brindado por la A.P.C.yT. (PICT: 13-05328) y la S.G.C.yT. UNNE.

Bibliografa

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