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PROTENAS
Funciones de las protenas. Niveles de organizacin en las protenas. Propiedades de
las protenas. Extraccin de protenas. Cuantificacin de protenas.
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diferentes mtodos adecuados para cada caso particular y para cada etapa de
este proceso, tales como, lisis celular, destruccin mecnica o tcnicas de
congelacin-descongelacin, a fin de romper las clulas y extraer las
protenas.
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protege las protenas de la oxidacin, pero se debe tener cuidado porque estos
agentes, en algunos casos pueden activar a las proteasas.
3.3 Mtodos de purificacin y caracterizacin
Por otro lado, para separar o purificar una protena a partir de una
mezcla de protenas se aplican habitualmente mtodos cromatogrficos que
aprovechan diferentes propiedades de la molcula proteica, como su masa
molecular (en la cromatografa de filtracin por gel), su carga (en la
cromatografa de intercambio inico) o su afinidad por determinados grupos
qumicos (cromatografa de afinidad). El anlisis de la protena o protenas
aisladas, como la determinacin de su peso molecular o la existencia de
subunidades (estructura cuaternaria), pI (punto isoelctrico), se lleva a cabo
generalmente mediante tcnicas electroforticas en condiciones nativas o
desnaturalizantes e isoelectroenfoque. El anlisis de la estructura de una
protena se hace mediante RMN, dicrosmo cicular, espectrofluorimetra,
secuenciacin, etc. Si la protena es una enzima, se realiza el anlisis de su
actividad biolgica y estudio de su comportamiento cintico.
Tcnicas utilizadas en el estudio de protenas
Purificacin Cuantificacin Anlisis de Anlisis de
estructura actividad
Fraccionamiento Espectrofotometra Espectrofluorimetra Actividad
subcelular por enzimtica
centrifugacin
diferencial
Precipitacin Espectrofluorimetra Dicroismo circular Anlisis de
salina radioligandos
Dilisis ELISA RMN Complejos
Antgeno
Anticuerpo
Cromatografa de MALDI-MS
filtracin por gel,
intercambio
inico,afinidad
Electroforesis en Secuenciacin de
geles aminocidos
isoelectroenfoque Difraccin de RX
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Absorbancia a 280 nm
Aunque ninguno de los 20 aminocidos hallados en las protenas
absorbe luz en la regin visible del espectro electromagntico, tres de ellos
(tirosina, triptofano y fenilalanina) absorben significativamente en la regin
del UV cercano a los 280 nm. Dado que las protenas poseen restos de
aminocidos aromticos, las medidas de absorcin a 280 nm constituyen un
mtodo rpido para la determinacin del contenido de protena de una
solucin. Este mtodo es usado para determinar la localizacin de protenas en
una o ms fracciones procedentes de un proceso de separacin
cromatogrfica.
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Mtodo de Lowry
Es un mtodo espectrofotomtrico de valoracin cuantitativa de
protenas. Se basa en la reaccin de las protenas con el reactivo de Folin-
Ciocalteau, que consiste en una solucin de tungstato sdico y molibdato
sdico en cido fosfrico y cido clorhdrico. A una adecuada dilucin de
protenas se aade el Reactivo de Folin que forma un complejo coloreado con
ellas, siendo la intensidad de color resultante proporcional a la concentracin
de protenas, segn la ley de Lambert-Beer (A= .L.C).
Fundamento: La reaccin entre las protenas y los reactivos empleados
por este mtodo consta de dos etapas:
1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las protenas en los
tomos de nitrgeno de los enlaces peptdicos, formando complejos. Estos
complejos Cu2+-protena, de un color azul plido, provocan el desdoblamiento de
la estructura tridimensional de la protena, exponiendo hacia la superficie a los
residuos fenoles de tirosina, que van a participar en la segunda etapa de la
reaccin. El Cu2+ se mantiene en solucin alcalina en forma de su complejo con
tartrato.
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Ventajas Desventajas
Grupos -Gran espectro de sensibilidad -Interfieren cidos
Aromticos -Mtodo no destructivo nucleicos y otros
(280 nm) compuestos aromticos.
Unin Peptdica -Protenas con y sin grupos -Deteccin de otros
(205 nm) aromticos compuestos qumicos.
-Mtodo no destructivo -Interfieren la mayora
de los tampn.
Mtodo de -10 veces ms sensible que UV -Interferencia de varias
Lowry (5 a 100 g) sustancias.
(745-750 nm) -Aconsejable para mezclas -Inestabilidad de los
complejas (tisulares) reactivos
-Desviacin de la
linealidad a altas
concentraciones
Mtodo de -5 veces ms sensible que el de -La sensibilidad
Bradford Lowry depende del contenido
(595 nm) -Pequeas interferencias se de lisinas y argininas.
compensan con el control -El complejo deja
restos azules en las
cubetas.
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Experimentacin
Protenas
Objetivos
Extraer, concentrar y purificar protenas de origen animal y vegetal.
Estudiar la propiedad amortiguadora del pH de las protenas.
Determinar el punto isoelctrico de una protena.
Estudiar el efecto de solventes orgnicos sobre las protenas.
Ensayar e interpretar los procesos de desnaturalizacin reversible e
irreversible de las protenas.
Emplear un mtodo colorimtrico para el anlisis cuantitativo de las
protenas presentes en una muestra desconocida.
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Procedimiento:
Titular una fraccin alcuota del suero y una del suero
desproteinizado, ambos diluidos 1/5 con agua destilada. La titulacin se
realiza en presencia de 10 gotas del indicador rojo de metilo que al mezclar
con el suero se torna de color amarillo,.agregando HCl 0,01 N hasta cambio
de color a rosado plido. Se mide el volumen de HCl gastados.
Procedimiento:
- Rotular nueve tubos de 1 a 9. En el tubo uno colocar 3,2 ml de cido
actico 1 N y 6,8 ml de agua destilada, mezclar.
- Agregar 5 ml de agua destilada a los 8 tubos restantes.
- Tomar 5 ml de la solucin del tubo 1 y verter en el tubo 2. Mezclar y
repetir la operacin hasta el ltimo tubo. Descartar los 5 ml finales.
- Medir el pH a cada solucin (rango de pH esperado 3,5-5,9).
- Agregar 1 ml de casena a cada tubo de la escala de pH y mezclar
inmediatamente por agitacin.
- Observar la solubilidad de la casena a distintos pH a tiempo cero (T0) y a
los 30 minutos (T30) de contacto.
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Reactivos:
- Etanol de 95
- Acetona
- Hidrxido de sodio conc.
- HCl conc.
- Solucin de ovoalbmina: separar la clara de huevo, medir su volumen y
batir durante unos minutos, mezclar con cinco volmenes de agua destilada y
filtrar la mezcla a travs de doble gasa.
Procedimiento:
Precipitacin de ovoalbmina con solventes orgnicos: agregar
volmenes iguales de alcohol y acetona a la solucin de ovoalbmina.
Coagulacin de ovoalbmina: en una serie de tubos numerados del 1 al 4,
colocar en cada uno 2 ml de solucin de ovoalbmina y proceder a:
Tubo 1: calentar.
Tubo 2: agregar unas gotas de cido clorhdrico concentrado (HCl).
Tubo 3: agregar solucin concentrada de hidrxido de sodio (NaOH).
Tubo 4: usar como control.
Explicar el fenmeno observado.
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ENZIMAS
Definicin de enzimas. Nomenclatura y clasificacin. Actividad enzimtica.
Velocidad de reaccin. Cintica enzimtica.
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Actividad enzimtica
El estudio o investigacin de una actividad enzimtica involucra dos
aspectos: uno cualitativo y otro cuantitativo.
Anlisis cualitativo:
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Anlisis cuantitativo:
Consiste en determinar la cantidad de enzima presente en un sistema;
para ello se recurre a la medida de la velocidad de la reaccin catalizada por la
enzima que se ensaya. Esto es posible debido que, en condiciones adecuadas,
la velocidad de una reaccin enzimtica es directamente proporcional a la
cantidad de enzima presente.
Velocidad de reaccin:
Se entiende por velocidad de una reaccin qumica a la variacin de la
concentracin de reactivos o de productos en funcin del tiempo. As, la
velocidad de una reaccin enzimtica puede medirse como la velocidad de
utilizacin del sustrato o bien como la velocidad de formacin de uno de los
productos. De esta manera, se puede expresar la cantidad de enzima en
trminos de unidades enzimticas, entendindose por Unidad de Enzima a la
cantidad de enzima que cataliza la transformacin de un micromol de
sustrato por minuto bajo condiciones definidas de temperatura y pH .
Cuando la actividad de una enzima se relaciona con el contenido
proteico de la preparacin enzimtica, se la denomina Actividad Especfica y
se expresa como el nmero de unidades de enzima por miligramo de protena
(UE/mg). La actividad especfica de una enzima indica el grado de pureza de
la preparacin enzimtica y es mxima cuando la enzima se encuentra pura.
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Cintica enzimtica
La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones catalizadas
por enzimas. Los estudios cinticos proporcionan informacin directa acerca
del mecanismo de la reaccin cataltica y de la especificidad de la enzima. La
velocidad de una reaccin enzimtica puede determinarse midiendo la
aparicin de los productos o bien la desaparicin de los reactivos como
funcin del tiempo. Al medir la aparicin de producto (o la desaparicin del
sustrato) en funcin del tiempo se obtiene la llamada curva de avance o de
progreso de la reaccin (Figura 1), o simplemente, la cintica de la reaccin.
A medida que la reaccin transcurre, la velocidad de aparicin del
producto (pendiente de la curva en cada punto) va disminuyendo porque se va
consumiendo el sustrato de la reaccin.
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10
6
[P] Mm
Concentracin
[S]O = 1 KM
4
vo
2
(mM)
0
0 100 200 300 400 500 600
TIEMPO (min)
Tiempo (minutos)
E+S P+E
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Km representa:
1. Constante de equilbrio de disociacin del complejo ES
2. Medida inversa de la afinidad de la enzima por el sustrato
3. Concentracin de sustrato para la que la velocidad se hace igual a la mitad
de La mxima (V 0.5)
4. Se define para un dado complejo enzima-sustrato
5. Se mide en unidades de concentracin
Km
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Experimentacin
ENZIMAS
Objetivos
Determinar la actividad de una enzima hidroltica (invertasa cida soluble
de Ricinus communis) mediante mtodos espectrofotomtricos.
Determinar la velocidad inicial de la enzima (efecto del tiempo de
incubacin).
Determinacin del pH ptimo de enzima mediante el ensayo del efecto del
pH sobre la actividad de enzima.
Determinar la KM y la Vmax de la enzime mediante el estudiao del efecto de
la concentracin de sustrato.
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INVERTASA
SACAROSA GLUCOSA + FRUCTOSA
No Reductor Reductores
INVERTASA
RAFINOSA GAL-GLU + FRUCTOSA
No Reductor Reductores
INVERTASA
ESTAQUIOSA GAL-GAL-GLU + FRUCTOSA
No Reductor Reductores
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Reactivos:
a) Reactivo cprico de Somogyi. Se prepara en el momento de usar
mezclando 1 volumen de la solucin A con 9 volmenes de la solucin B:
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CIDOS NUCLEICOS
Definicin de cidos nucleicos. Composicin. Bases nitrogenadas. Estructura de los
nuclesidos, nucletidos y polinucleticos. ADN conformacin. ARN. Tipos. Funcin
INTRODUCCION
Los cidos nucleicos son las biomolculas portadoras de la
informacin gentica. Tienen una estructura polimrica, lineal, cuyos
monmeros son los nucletidos. Son molculas formadas por centenares de
millones de nucletidos en una sola estructura covalente. El nucletido est
formado por un fosfato esterificado a una pentosa, la que a su vez est unida
por un enlace -glicosdico a una base nitrogenada.
De la misma manera que las protenas son polmeros lineales
aperidicos de aminocidos, los cidos nucleicos lo son de nucletidos. La
aperiodicidad de la secuencia de nucletidos implica la existencia de
informacin. Los cidos nucleicos constituyen el depsito de informacin de
todas las secuencias de aminocidos de todas las protenas de la clula. Existe
una correlacin entre ambas secuencias, lo que se expresa diciendo que cidos
nucleicos y protenas son colineares; la descripcin de esta correlacin es lo
que llamamos Cdigo Gentico, establecido de forma que a una secuencia de
tres nucletidos en un cido nucleico corresponde un aminocido en una
protena. Adems hay cidos nucleicos implicados en la transmisin y
procesado de la informacin gentica, otros con funciones catalticas
(ribozimas), y hay secuencias regulatorias que controlan la expresin de
diferentes genes (hormonas, factores de crecimiento, seales qumicas en
general).
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Bases nitrogenadas
Las bases nitrogenadas de los cidos nucleicos son bases heterocclicas
que pertenecen a una de dos familias:
Unas estn basadas en el Anillo pirimidnico, las Pirimidinas que
constituyen un sistema plano de seis tomos, cuatro carbonos y dos
nitrgenos. Los tomos del anillo pirimidnico tienen la siguiente numeracin:
N1: C2: N3: C4: C5: C6:
N3 4 5
2 6
1
N
Las distintas bases pirimidnicas se obtienen por sustitucin de este
anillo con grupos oxo (=O), grupos amino (-NH2) o grupos metilo (-CH3).
O O NH2
CH3 H
H N N N
O N O N O N
H H H
TIMINA URACILO CITOSINA
2,4 di oxo 5 metil pirimidina 2,4 di oxo pirimidina 2 oxo 4 amino pirimidina
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N
N1 6
5 7
8
2 4 9
3
N N
H
PURINA
NH2 O
H N
N N
N
N N N
N NH2
H H
ADENINA GUANINA
Nuclesidos
La unin de una base nitrogenada a una pentosa da lugar a los
compuestos llamados nuclesidos. Obsrvese el sufijo sido, caracterstico de
todos los glicsidos. La pentosa puede ser D-Ribosa (D-ribofuranosa), en
cuyo caso hablamos de Ribonuclesidos, o bien 2-D-Desoxirribosa (D-
desoxirribofuranosa), constituyendo los Desoxirribonuclesidos. Todos los
nuclesidos son del tipo anomrico beta. Esto nos introduce a la distincin
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Nucletidos
Cuando un ortofosfato se esterifica a alguno de los -OH de la pentosa
de un nuclesido, la estructura resultante se llama nucletido. En los
ribonuclesidos, el ortofosfato puede esterificarse en tres posiciones distintas:
2', 3' y 5'. En los desoxirribonuclesidos, la esterificacin con grupos fosfato
se da en 3, 5 de la pentosa.
La pentosa se une a la base nitrogenada por un enlace N-glicosdico que
se establece entre el tomo de C1 del azcar y el tomo de N9 de las bases
pricas o el N1 de las bases pirimidnicas. El grupo fosfato se halla unido por
un enlace ster al tomo C5 de la pentosa.
NH2
N
- N
O
5' N N Nucletido de ADN
- O
O P O CH 2 Desoxiadenosina 5monofosfato (AMP)
4' H H 1'
O
H H
3' 2'
OH H
NH2
- - N
N Adenosina 5difosfato (ADP)
O O
5' N
ON
-
O P O P O CH 2
4' H 1'
O O H
H H
3' 2'
OH OH
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Polinucletidos
Dos nucletidos pueden unirse a travs de un enlace fosfodister. Un
nucletido est fosforilado en 3' y este fosfato, a su vez, esterifica al 5'-OH del
siguiente nucletido
El enlace as establecido se llama enlace
fosfodister, y es caracterstico de los cidos
nucleicos. A su vez, el grupo 3' -OH del segundo
nucletido puede esterificarse a otro fosfato que
por su parte se esterifica al 5'-OH del siguiente
nucletido y este ltimo se une de la misma
manera a otro nucletido y as sucesivamente.
Convencionalmente los polinucletidos se numeran desde el residuo 5'
terminal, que es aquel que tiene un 5'-OH libre (extremo 5') el cual muy
frecuentemente aparece esterificado a un fosfato o polifosfato mientras que en
el extremo opuesto de la molcula hay un grupo 3' -OH libre que recibe el
nombre de extremo 3'.
Las enzimas que hidrolizan polinucletidos, genricamente llamadas
nucleasas, son, por lo tanto, fosfodiesterasas (su accin consiste en la
hidrlisis de un fosfodister).
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Conformacin A
La conformacin A del ADN aparece en cristales de baja hidratacin y
menor grado de polimerizacin que el ADN-B. Se trata de una estructura ms
ancha y corta que el ADN-B.
Conformacin Z
La conformacin Z del ADN aparece fundamentalmente en zonas
ricas en el par G-C.
Existen algunas diferencias entre la conformacin Z y las otras dos. En primer
lugar las hlices son levgiras, es una doble hlice ms estrecha y alargada
que el ADN-B.
Tambin puede hallarse ADN en las mitocondrias o en los cloroplastos
(clulas eucariotas) o los plsmidos (clulas procariotas), virus y
transposones.
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reactivo de Schiff
Reaccin con orcinol
Reaccin con agentes intercalantes (acridinas)
Resistencia a hidrlisis por lcalis.
Metilacin de purinas: por tratamiento con dimetil sulfato (DMS) y
calentamiento a pH neutro se produce la metilacin de las purinas. El
tratamiento a pH bajo produce la ruptura del enlace glicosdico con
formacin de un sitio apurnico. El tratamiento posterior con cido
diluido rompe la cadena por el sitio apurnico.
El tratamiento de ADN con hidrazina rompe el enlace glicosdico de las
pirimidinas, quedando un sitio apirimidnico; el tratamiento posterior con
piperidina rompe la cadena por el sitio apirimidnico
-
O O H H -
O O H H
N N
P P
- -
O O
O N O N
H2C N O H2C N O
O O
-
O O -
O O
P O P Sitio apurnico
- H3C H -
O O
O N N O
H
N
H2 C N N H2C OH
H
. O O
-
O O -
O O
P O P O
- -
O H3C H O H3C H
O N O N
pH bajo
H2 C N O H2C N O
O O
- O H - O H
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-
O O H H
-
O O H H
N N
P P
- -
O O
O N O N
H 2C N O H2C N O
O O
-
O O -
O O
P O P O
- H -
O H3C H
O N
O N N O N
H H
N N
H2C N H 2C N N
N
H H
O O
- O
O O
- H H
O O- H H -
O OO
N N
P
P P O DMS P
-
O
- -O -
O O
O H C HN H 3C O H N
O O 3 N O N
H 2C N O H 2C H 2C N O
H2C N O N O
O O O O
O -O O O
- H -
O O-O O H
H N H N
P P P P
- - -
O -O O
O O Sitio
N
N
apurnico OO O- N
N
H2CH C N H 2C N N
2 N
O OH O
O
O O
- O -
O O O-
P O P O
- -
O H 3C H cido diludo O H3C H
O O N
N
H 2C H 2C N O
N O
O O
-
O O H -
O O H
H N H N
P P
- -
O O N
O N O N
N
H 2C N H 2C N N
N
O O
O O
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O O
O O
P
- H H
O N N
O N O N
H H
N -
O P O CH2 N
H2C N N N
N O H
O H O-
OH
-
O O
H H H H
P N N
-
O
O
N N
O
H2C -
N O O P O CH2 N O
O O
O-
-
O O OH
P O O
- H3C H
O H3C H
O N N
O
-
H2C O P O CH2 N O
N O O
O O-
- O OH H
O H H N
H N
P
-
O N N
O N N
O
- N
H2C N O P O CH2 N
N O
O O-
O OH
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- N
O
5' O N
- O Nucletido de ARN
O P O CH 2
Uridina 5monofosfato
4' H 1'
O H
H H
3' 2'
OH OH
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Experimentacin
cidos nucleicos: ARN y ADN
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CROMATOGRAFA Y ELECTROFORESIS
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Tcnicas cromatogrficas
Segn la forma de llevar a cabo la separacin cromatogrfica, cabe
distinguir dos tipos de tcnicas cromatogrficas: en columna y plana.
Cromatografa en columna: se utiliza un tubo cilndrico, en cuyo interior se
coloca la fase estacionaria y a travs de ella se hace pasar la fase mvil. El
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veces de banda, a corta distancia de uno de los extremos de dicho plano. Una
vez seca la mancha o banda, el extremo del plano prximo a la misma se pone
en contacto con la fase mvil, manteniendo todo el sistema cromatogrfico en
una cmara cerrada. La separacin se produce por migracin diferencial de los
componentes de la muestra en la direccin en que se mueve la fase mvil.
Generalmente, a diferencia de la cromatografa en columna, en cromatografa
plana las sustancias analizadas no abandonan el lecho cromatogrfico, de
forma que el proceso se detiene cuando la fase mvil ha alcanzado una
determinada zona del plano.
En la cromatografa en papel, la celulosa acta como soporte de la fase
estacionaria que suele ser agua. No obstante, tambin existen en el comercio
papeles impregnados (gel de slice o almina, silicona, intercambiadores
inicos, etc.) o tratadas qumicamente (grupos intercambiadores incorporados
al esqueleto polimrico de la celulosa), que amplan la aplicabilidad de esta
tcnica.
En cromatografa en capa fina, un slido o soporte de la fase
estacionaria, se extiende en forma de capa sobre el plano de una superficie
rgida, normalmente una capa de vidrio o polietileno o una placa de aluminio,
de forma que la fase mvil fluye a travs del mismo. Dependiendo de las
caractersticas del slido utilizado, la cromatografa ser de particin,
adsorcin, intercambio inico o exclusin.
Hasta hace relativamente poco tiempo, la cromatografa en capa fina
(CCF) o Thin Layer Cromatography (TLC) era considerada una tcnica
cualitativa simple y rpida, para separar mezclas no demasiado complejas,
pero su aplicabilidad cuantitativa resultaba una pobre alternativa frente a otras
tcnicas cromatogrficas. Sin embargo, actualmente, debido a los cambios
introducidos en esta tcnica (calidad de los soportes, equipos para aplicar
muestras y sistemas de deteccin), es considerada una tcnica til para separar
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Manual terico prctico de Qumica Orgnica y Biolgica
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son las que permiten el paso de dicha fase a travs del lecho
cromatogrfico. Por el contrario, en cromatografa en columna la velocidad
de la fase mvil puede controlarse regulando el gradiente de presin a
travs de la columna (por ej. cromatografa de alta presin).
En la cromatografa plana, el tiempo que dura la separacin est
determinado por el tiempo necesario para que el frente del disolvente
llegue a una zona determinada del lecho cromatogrfico y es independiente
del camino recorrido por los componentes de la muestra. En cromatografa
en columna, cada soluto debe atravesar completamente la longitud de la
columna, por lo que el tiempo que dura la separacin est determinado por
el tiempo que tarda el componente ms lento en llegar al detector.
En la cromatografa en columna la separacin de varias muestras se realiza
de forma secuencial, es decir, cada muestra debe sembrarse, fraccionarse
y detectarse individualmente, mientras que en cromatografa plana, la
separacin de varias muestras se realiza de forma simultnea, siendo todas
ellas sometidas al mismo tiempo a igual proceso separativo, lo cual supone
un ahorro de tiempo.
Otra diferencia se encuentra en la forma de llevar a cabo la deteccin.
Mientras que en cromatografa en columna este es un proceso dinmico,
pasando cada soluto eludo por el detector (por ejemplo UV-visibles;
ndice de refraccin), en cromatografa plana es un proceso esttico ya que
se analizan o revelan todas las fracciones de distintas muestras a la vez.
Aplicaciones de la Cromatografa
La cromatografa es probablemente la ms verstil de las tcnicas de
separacin, ya que es aplicable a cualquier mezcla soluble o voltil. Las
tcnicas cromatogrficas se pueden emplear para la separacin, aislamiento,
purificacin e identificacin de diversos compuestos (orgnicos, inorgnicos o
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Electroforesis
La electroforesis es una tcnica para la separacin de protenas (y
tambin de aminocidos, pptidos y cidos nucleicos) que se basa en el
desplazamiento de las protenas cargadas en un campo elctrico. Si se coloca
a las protenas en un campo elctrico, el sentido en que se mueven las
molculas depende del pH de la solucin. Si el pH es igual al punto
isoelctrico (pI) de una protena, sta no migra. A un pH por debajo de su pI,
predominan las cargas positivas y la protena migra hacia el ctodo (polo
negativo). A un pH superior al pI, existe un predominio de cargas negativas y
la protena migra hacia el nodo (polo positivo). En general, se puede decir
que cuando una molcula cargada se coloca en un campo elctrico se mover
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Direccin
Muestra
de la
migracin
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Experimentacin
Cromatografa y electroforesis
Objetivos
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slica gel. Dejar desarrollar la placa hasta que el disolvente alcance unos 5 cm
por encima del origen. Sacar la placa de la cuba, marcar el frente de
disolvente y dejar evaporar el mismo. Revelar con reactivo de Dragendorffs
(solucin acuosa de cido tartrico, nitrato de bismuto y ioduro de potasio).
Determinar y comparar los valores de Rf para el alcaloide presente en el
extracto y el compuesto testigo.
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Ve
Ve
Nmero de fraccin
Respuesta del detector= Abs 280 nm
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D. Electroforesis
Determinacin de las protenas del suero humano
-Preparacin de la muestra: Por centrifugacin de una muestra de sangre se
obtiene el suero humano.
-Separacin e identificacin: La separacin se realizar mediante
electroforesis en membrana de acetato de celulosa.
Humedecer en tampn (Buffer Veronal sdico 0,04M pH=8,6)
membranas de acetato de celulosa gelatinizadas (CELLOGEL) durante 10
minutos. Eliminar el exceso de tampn poniendo las tiras entre dos hojas de
papel de filtro, con cuidado de que no lleguen a secarse por completo. Cargar
la cuba del aparato de electroforesis con tampn. Extender las tiras sobre el
puente de la cubeta de electroforesis de modo que la cara mate de la tira de
acetato de celulosa quede hacia arriba, teniendo cuidado que ambos extremos
queden sumergidos en la solucin buffer. Sembrar con ayuda de un aplicador
de plstico, la muestra de suero en la tira a 2 cm del ctodo. Conectar el
aparato de electroforesis dejando pasar la corriente durante 60 minutos a un
voltaje fijo de 200 V.
Una vez finalizada la electroforesis, depositar las tiras en una cubeta
con solucin colorante (0,5% , p/v negro amido en metanol 45% + cido
actico 10%), de modo que queden cubiertas por el lquido, durante 10
minutos. Seguidamente lavar las tiras en solucin de lavado (metanol 45% +
cido actico 5%) hasta que se observen bien las bandas de protena (azules)
sobre un fondo blanco.
Dibujar el patrn de bandas que se ha obtenido tras la electroforesis de
protenas sricas, indicando la posicin de nodo y ctodo as como el punto
de aplicacin de la muestra. Identificar las protenas que corresponden a cada
banda y justificar el orden.
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Bibliografia
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(Espaa).
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