Tesis 75

EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD CITOTXICA DE EXTRACTOS Y
FRACCIONES DE Isertia laevis EMPLEANDO LNEAS CELULARES
DERIVADAS DE TUMORES HUMANOS.
SANDRA LILIANA CASTRO DIAZ.
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al ttulo de
BILOGA.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGA
BOGOT, D.C.
2006
NOTA DE ADVERTENCIA
Artculo 23 de la resolucin No 13 de Julio de 1946
La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus

alumnos en sus trabajos de tesis. Slo velar por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral catlica y por que las tesis no contengan ataques
personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la
verdad y la justicia.
Bogot, 3 de octubre 2006.
Seores
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA.
Ciudad
Estimados Seores:
Yo (nosotros) Alba Nohem Tllez Alfonso y Sandra Liliana Castro Diaz,

identificado(s) con C.C. No. 23. 556. 606 y 52. 776. 154, autor(es) del trabajo
de grado titulado Evaluacin de la Actividad Citotxica de Extractos y
Fracciones de Isertia laevis Empleando Lneas Celulares Derivadas de Tumores
Humanos, presentado como requisito para optar al ttulo de Biloga en el ao de
2006; autorizo(amos) a la Universidad Javeriana a:
a) Reproducir el trabajo en medio digital o electrnico con el fin de ofrecerlo

para la consulta en la Biblioteca General. Si.
b) Poner a disposicin para la consulta con fines acadmicos, en la pgina
web de la Facultad, de la Biblioteca General y en las redes de informacin
con las cuales tenga convenio la Universidad Javeriana. Si.
c) Enviar el trabajo en formato impreso o digital, en caso de que sea
seleccionado para participar en concursos de trabajos de grado. Si.
d) Distribuir ejemplares de la obra, para la consulta entre las entidades
educativas con las que la facultad tenga convenio de intercambio de
informacin, para que este sea consultado en las bibliotecas y centros de
documentacin de las respectivas entidades. No.
e) Todos los usos, que tengan finalidad acadmica. Si.
Los derechos morales sobre el trabajo son de los autores de conformidad con lo
establecido en el artculo 30 de la Ley 23 de 1982 y el artculo 11 de la Decisin
Andina 351 de 1993, los cuales son irrenunciables, imprescriptibles,
inembargables e inalienables. Atendiendo lo anterior, siempre que se consulte la
obra, mediante cita bibliogrfica se debe dar crdito al trabajo y a su(s) autor(es)
Este documento se firma, sin perjuicios de los acuerdos que el autor(es) pacte con
la Unidad Acadmica referentes al uso de la obra o a los derechos de propiedad
industrial que puedan surgir de la actividad acadmica.
Alba Nohem Tllez Alfonso.

23. 556. 606
Sandra Liliana Castro Diaz.

52.776.154
APROBADO
---------------------------------------
ALBA NOHEM TLLEZ, Ph. D.
DIRECTORA
--------------------------------------- ----------------------------------
CLEMENCIA DE CASTRO JULIO PEDROZO, Ph.D.
JURADO JURADO
APROBADO
--------------------------------------- --------------------------------------
NGELA UMAA, M. Phil. ANDREA FORERO
DECANA ACADMICA DIRECTORA CARRERA
DE BIOLOGA
AUTOR O AUTORES
Apellidos Nombres
Castro Diaz Sandra Liliana
Tllez Alfonso Alba Nohem
DIRECTOR(ES)
Apellidos Nombres
Tllez Alfonso Alba Nohem
TRABAJO PARA OPTAR EL TTULO DE: Biloga.
TTULO COMPLETO DEL TRABAJO: Evaluacin de la Actividad Citotxica

de Extractos y Fracciones de Isertia laevis Empleando Lneas Celulares Derivadas
de Tumores Humanos.
FACULTAD: Ciencias Bsicas.
PROGRAMA: Carrera: x
NOMBRE DEL PROGRAMA: Biologa.
CIUDAD: BOGOT. AO DE PRESENTACIN DEL TRABAJO: 2006.
NMERO DE PGINAS: 68
TIPO DE ILUSTRACIONES:
Mapas.
Tablas, grficos y diagramas.
Fotografas.
DESCRIPTORES O PALABRAS CLAVES:

Actividad citotxica, Isertia laevis, Extractos hojas.
RESUMEN DEL CONTENIDO:

Las fracciones y subfracciones de Isertia laevis del extracto Petrol y EtOH,
mostraron actividad citotxica frente a lneas celulares tumorales humanas de
cncer de seno (MCF-7 y CSC 1595) y de clon (colo 205). Las fracciones
fueron probadas a una concentracin de 100 g/ml, la fraccin MeOH del
extracto Petrol present un 7% de viabilidad sobre la lnea celular 1595 y fue la
fraccin ms activa, del extracto EtOH la fraccin 3 con 27% de viabilidad para
la lnea MCF-7 y 23% de viabilidad en la lnea 1595 fueron las fracciones que
mostraron mejores resultados. Para la lnea celular colo 205 las fracciones ms
activas fueron la 4 y 5 del extracto EtOH con un 41% de viabilidad. Las pruebas
fitoqumicas cualitativas mostraron que las fracciones de petrol y las de EtOH
contienen esteroles y/o triterpenos.
DEDICATORIA
A mis padres por la paciencia que han tenido durante estos aos.
A mis hermanos por su apoyo en todo momento.

AGRADECIMIENTOS
A la Dra. Alba Nohem Tllez por ser una verdadera maestra y por el apoyo en la
direccin del trabajo.
A la Dra. Clemencia de Castro y Tulia de Murcia por proporcionarme las lneas
celulares y por su preciada colaboracin en todo el desarrollo del trabajo.
A los profesores del Laboratorio de Fitoqumica de la Universidad Javeriana por
su cooperacin.
Al Laboratorio de Virologa e Inmunologa de la Universidad Javeriana por
permitir usar sus instalaciones en el desarrollo del proyecto.
A Andrea y ngela por su ayuda.

TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIN 2
2. MARCO TERICO 4
2.1 LAS PLANTAS, FUENTE DE NUEVAS SUSTANCIAS 4
2.2 FAMILIA RUBIACEAE 6
2.3 CONCEPTOS GENERALES DEL GNERO ISERTIA. 7
2.3.1 ISERTIA LAEVIS 8
2.3.2 FITOQUMICA DEL GNERO ISERTIA 10
2.4 PLANTAS MEDICINALES CON TRITERPENOS, SAPONINAS
TRITERPNICAS Y SU ACTIVIDAD CITOTXICA Y ANTITUMOR 13
2.4.1 ACCIN CITOTXICA DE ESPECIES DE LA FAMILIA
RUBIACEAE 16
2.5 CULTIVO CELULAR 18
2.5.1 LNEAS CELULARES 19
2.6 ENSAYOS DE CITOTOXICIDAD IN VITRO 20
2.6.1 MTODO DEL MTT 22
2.7 EL CNCER, ENTRE LAS PRINCIPALES CAUSAS DE
MORTALIDAD 23
3. FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN 25
3.1 FORMULACIN DE PROBLEMA 25
3.2 PREGUNTA DE INVESTIGACIN 25
3.3 JUSTIFICACIN 26
4. OBJETIVOS 27
4.1 OBJETIVO GENERAL. 27
4.2 OBJETIVOS ESPECFICOS 27
5. MATERIALES Y MTODOS 28
6. RESULTADOS Y DISCUSION 34
6.1 RESULTADOS 34
6.2 DISCUSIN DE RESULTADOS 45
7 CONCLUSIONES 48
8 RECOMENDACIONES 50
9 BIBLIOGRAFA 51
10 ANEXOS 57
INDICE DE TABLAS
TABLA No 1. METABOLITOS SECUNDARIOS AISLADOS DE ESPECIES

DEL GNERO ISERTIA. 12
TABLA NO 2. PLANTAS MEDICINALES CON SAPONINAS

TRITERPNICAS, TRITERPENOS Y SU ACTIVIDAD CITOTXICA Y
ANTITUMOR. 15
TABLA 3. PRUEBAS FITOQUMICAS DE LAS FRACCIONES DEL

EXTRACTO PETROL. 34
TABLA 4. PRUEBAS FITOQUMICAS DE LAS FRACCIONES DEL

EXTRACTO ETOH. 35
TABLA 5. PORCENTAJE DE VIABILIDAD DE LAS CLULAS PARA LOS

EXTRACTOS ETOH Y PETROL FRENTE A LAS LNEAS CELULARES
PROBADAS. CONCENTRACIN 300 g/ml. 37
TABLA 6. PORCENTAJE DE VIABILIDAD DE LAS CLULAS PARA LAS

FRACCIONES PETROL, CH2CL2, ACOET, MEOH DEL EXTRACTO
PETROL. CONCENTRACIONES APLICADAS A 100 g/ml. 37

FRACCIONES 1 10 DEL EXTRACTO ETOH. CONCENTRACIONES
APLICADAS A 100 g/ml. 39
TABLA 8. PRUEBAS FITOQUMICAS DE LAS SUBFRACCIONES DE LA

FRACCIN MEOH DEL EXTRACTO PETROL. 41
SUBFRACCIONES DE LA FRACCIN MEOH DEL EXTRACTO PETROL.
CONCENTRACIONES 50 g/ml, ALCALOIDE 25 g/ml. 42

MEZCLAS DE LAS SUBFRACCIONES DE LA FRACCIN MEOH DEL
EXTRACTO PETROL CONCENTRACION 50 g/ml. 43
TABLA 11. PRUEBAS FITOQUMICAS DE LA FRACCIN 3 DEL

EXTRACTO ETOH. 43

SUBFRACCIONES DE LA FRACCIN 3 DEL EXTRACTO ETOH.
CONCENTRACIONES APLICADAS A 50 g/ml. 44
TABLA 13. EFECTO CITOTXICO DE EXTRACTO Y FRACCIONES DE

PETROL SOBRE LA LNEA CELULAR CSC 1595. 57
TABLA 14. EFECTO CITOTXICO DE EXTRACTO Y FRACCIONES 1-3

DE ETOH SOBRE LA LNEA CELULAR CSC 1595. 57
TABLA 15. EFECTO CITOTXICO DE FRACCIONES 4-6 DE ETOH SOBRE

LA LNEA CELULAR CSC 1595. 58
TABLA 16. EFECTO CITOTXICO DE FRACCIONES 7-10 DE ETOH

SOBRE LA LNEA CELULAR CSC 1595. 58
TABLA 17. EFECTO CITOTXICO DE EXTRACTO Y FRACCIONES DE

PETROL SOBRE LA LNEA CELULAR COLO 205. 58
TABLA 18. EFECTO CITOTXICO DE EXTRACTO Y FRACCIONES 1-3 DE

ETOH SOBRE LA LNEA CELULAR COLO 205. 59
SOBRE LA LNEA CELULAR COLO 205. 59

SOBRE LA LNEA CELULAR COLO 205. 59
TABLA 21. EFECTO CITOTXICO DE EXTRACTO Y FRACCIONES

PETROL SOBRE LA LNEA CELULAR MCF-7. 60
TABLA 22. EFECTO CITOTXICO DE EXTRACTO Y FRACCIONES 1-3

DE ETOH SOBRE LA LNEA CELULAR MCF-7. 60

SOBRE LA LNEA CELULAR MCF-7. 60

SOBRE LA LNEA CELULAR MCF-7. 61
TABLA 25. EFECTO CITOTXICO DEL ALCALOIDE SOBRE LA LNEA

CELULAR CSC 1595. 61
TABLA 26. EFECTO CITOTXICO DE FRACCIN MEOH DEL

EXTRACTO PETROL SOBRE LA LNEA CELULAR CSC 1595. 61
TABLA 27. EFECTO CITOTXICO DE LAS SUBFRACCIONES MEOH DEL

EXTRACTO PETROL SOBRE 1595. 62
TABLA 28. EFECTO CITOTXICO DE LAS SUBFRACCIONES DE LA

FRACCIN 3 DEL EXTRACTO ETOH SOBRE LA LNEA CELULAR CSC
1595. 62
TABLA 29. EFECTO CITOTXICO DE LAS SUBFRACCIONES DE LA
FRACCIN 3 DEL EXTRACTO ETOH SOBRE LA LNEA CELULAR CSC
1595. 62
TABLA 30. ANLISIS ESTADSTICO DEL EFECTO CITOTXICO DEL

EXTRACTO Y FRACCIONES PETROL SOBRE LA LNEA CELULAR CSC
1595. (300 g/ml), (100 g/ml). 63

EXTRACTO Y FRACCIONES 1-3 ETOH SOBRE LA LNEA CELULAR CSC
1595. (300 g/ml), (100 g/ml). 63
TABLA 32. ANLISIS ESTADSTICO DEL EFECTO CITOTXICO DE

FRACCIONES ETOH SOBRE LA LNEA CSC 1595. (100 g/ml). 63

FRACCIONES ETOH SOBRE LA LNEA CSC 1595. (100 g/ml). 64

EXTRACTO Y FRACCIONES PETROL SOBRE LA LNEA CELULAR COLO
205. (300 g/ml), (100 g/ml). 64

EXTRACTO Y FRACCIONES 1-3 ETOH SOBRE LA LNEA CELULAR
COLO 205. (300 g/ml), (100 g/ml). 64

FRACCIONES ETOH 4-6 SOBRE LA LNEA COLO 205. (100 g/ml). 65

FRACCIONES ETOH 7-10 SOBRE LA LNEA COLO 205. (100 g/ml). 65
EXTRACTO Y FRACCIONES PETROL SOBRE LA LNEA CELULAR MCF-
7. (300 g/ml), (100 g/ml). 65

EXTRACTO Y FRACCIONES 1-3 ETOH SOBRE LA LNEA CELULAR
MCF-7. (300 g/ml), (100 g/ml). 66

FRACCIONES ETOH 4-6 SOBRE LA LNEA MCF-7. (100 g/ml). 66

FRACCIONES ETOH SOBRE LA LNEA CELULAR MCF-7. (100 g/ml). 66

SLIDO ALCALOIDE SOBRE LA LNEA CSC 1595. (25 g/ml). 67
TABLA 43. ANLISIS ESTADSTICO DEL EFECTO CITOTXICO DE LA

FRACCIN MEOH SOBRE LA LNEA CELULAR CSC 1595. (50 g/ml). 67

SUBFRACCIONES DE LA FRACCIN MEOH DEL EXTRACTO PETROL
SOBRE LA LNEA CELULAR CSC 1595. (50 g/ml). 67

SUBFRACCIONES DE LA FRACCIN 3 DEL EXTRACTO ETOH SOBRE
LA LNEA CELULAR CSC 1595. (50 g/ml). 68
NDICE DE FIGURAS
FIGURA 1. DISTRIBUCIN DE I .laevis. 9
FIGURA 2. INFLORESCENCIA DE I. laevis. 10
FIGURA 3. METABOLIZACIN DE MTT A SALES DE FORMAZN POR

CLULAS VIABLES 23
FIGURA 4. MARCHA FITOQUMICA I. laevis. 30
FIGURA 5. SIEMBRA DE CLULAS Y EXTRACTOS EN PLACAS DE 96

POZOS. 33
FIGURA 6. CROMATOGRAFA EXTRACTO PETROL Y FRACCIONES. 35
FIGURA 7. CROMATOGRAFA EN CAPA FINA DEL EXTRACTO ETOH

TOTAL Y FRACCIONES 1-8. 36
FIGURA 8. CROMATOGRAFA FRACCIONES 8-10 EXTRACTO ETOH 36
FIGURA 9 EFECTO CITOTXICO DE EXTRACTO Y FRACCIONES DE

PETROL EN LNEA CELULAR MCF-7 38
FIGURA 10. EFECTO CITOTXICO DEL EXTRACTO Y FRACCIONES

PETROL EN LNEA CELULAR 1595. 38
FIGURA 11. EFECTO CITOTXICO DE EXTRACTO Y FRACCIONES DE

PETROL SOBRE LNEA CELULAR COLO 205. 38

ETOH EN LNEA CELULAR MCF7. 39
FIGURA 13. EFECTO CITOTOXICO DE EXTRACTO Y FRACCIONES DE
ETOH EN LNEA CELULAR 1595. 40

ETOH EN LNEA CELULAR COLO 205. 40
FIGURA 15. CROMATOGRAFA SUBFRACCIONES MEOH DEL

EXTRACTO PETROL 41
FIGURA 16. EFECTO CITOTXICO DEL ALCALOIDE Y

SUBFRACCIONES DEL EXTRACTO PETROL SOBRE LNEA CELULAR
1595. 42
FIGURA 17. CROMATOGRAFA SUBFRACCIONES DEL EXTRACTO

ETOH 43
FIGURA 18. EFECTO CITOTXICO DE SUBFRACCIONES DE ETOH EN

LNEA CELULAR 1595 44
NDICE DE ANEXOS
EFECTO CITOTXICO DE EXTRACTOS Y FRACCIONES. (TABLAS). 57
ANLISIS ESTADSTICO (TABLAS). 63

INDICE DE ABREVIATURAS
AcOEt: acetato de etilo.
CCD: cromatografa en capa delgada.
CH2Cl2: diclorometano
CSC-1595: lnea celular colombiana de cncer de seno
Colo 205: lnea celular de clon.
DMSO: Dimetil Sulfoxido
EtOH: etanol
MCF-7: lnea celular comercial de cncer de seno
MeOH: metanol
MTT: (metil tiazol tetrazolio) (3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5 difenil tetrazolio

bromuro)
Pf: punto de fusin

RESUMEN
Colombia presenta una gran diversidad de plantas vasculares, pero un nmero

reducido de stas han sido estudiadas en su composicin qumica y actividad
farmacolgica. Ms del 50 % de las drogas de uso clnico derivan de productos
naturales, por lo tanto los bosques de Colombia tienen un gran potencial
medicinal.
El presente trabajo evalu la actividad citotxica de la especie Isertia laevis de la

familia Rubiaceae que es la cuarta familia de plantas vasculares con ms especies.
Esta planta es reportada en etnobotnica por ser anticancergena y para curar
infecciones de la piel; en Colombia presenta una buena distribucin, va de los
300 a los 1700 m.s.n.m.
Entre los compuestos que han sido reportados para otras especies del gnero se
encuentran alcaloides indlicos, glicsidos triterpnicos, esteres y saponinas
triterpnicas. Todos estos metabolitos han sido evaluados en otras familias
botnicas y en diferentes especies de la familia rubiaceae y han presentado una
buena respuesta en ensayos de citotoxicidad sobre lneas celulares derivadas de
tumores.
En este trabajo se evalu la actividad citotxica de extractos y fracciones de la

especie I. laevis sobre las lneas celulares de cncer de seno MCF-7, CSC-1595 y
de clon Colo 205 mediante el mtodo in vitro MTT (metil tiazol tetrazolio) (3-
(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5 difenil tetrazolio bromuro), un ensayo colorimtrico
rpido, cuantitativo, que se utiliza para medir la viabilidad celular
Los resultados indican que la fraccin MeOH del extracto Petrol present un
efecto citotxico moderado con 32 y 7 % de viabilidad en las lneas celulares de
cncer de seno, las fracciones 2, 3, 4, 7, 8 y 9 del extracto EtOH tambin
presentaron porcentajes de viabilidad menores al 50% para estas dos lneas. La
lnea celular Colo 205 tuvo un comportamiento diferente al de las otras dos lneas,
siendo las fracciones 4 y 5 las ms activas con un porcentaje de viabilidad de 41%
para el resto de fracciones tuvo un efecto proliferativo con porcentajes entre 79 y
162% de viabilidad. La lnea celular que present mayor sensibilidad frente a los
extractos y fracciones fue la lnea 1595 seguida de la lnea MCF-7.
La mezcla de las subfracciones de la fraccin MeOH mostr cierto grado de

sinergismo al potenciar la accin citotxica de SF-1 y SF-3.
1. INTRODUCCIN.
El estudio de las propiedades curativas de la gran diversidad de plantas vasculares

colombianas es hasta el momento incipiente, siendo el ms bajo el de las especies
con posible actividad antineoplsica. Las plantas superiores han sido una fuente
til de compuestos antitumorales de importancia clnica, en consecuencia, es
importante rastrear los productos de origen natural mediante modelos in vivo y/o
in vitro, entre los que se destacan los ensayos de citotoxicidad como uno de los
indicadores de actividad antitumoral inicial.
Si se tiene en cuenta que la tercera causa de muerte en Colombia es debida a las

neoplasias malignas y que por ejemplo el cncer de mama en nuestro pas tiene
una tasa de incidencia en las mujeres de 30 por cada 100 000, se deben enfocar
los estudios en la bsqueda de nuevas sustancias con efecto citotxico sobre
diferentes lneas celulares tumorales. De acuerdo a bancos de informacin
etnobotnica, Isertia laevis se utiliza como anticancergena, hacen una decoccin
de las hojas y se dice cura el cncer de estmago. Garca Barriga (1992).
Isertia laevis pertenece a la familia Rubiaceae, esta familia es una de las ms

numerosas, se encuentra representada en todos los ecosistemas, en la regin
Andina se registra el mayor nmero de especies. El gnero Isertia presenta
catorce especies en Amrica, slo siete de ellas conocidas en Colombia, es un
grupo al que se le debe prestar atencin ya que la actividad farmacolgica de sus
metabolitos secundarios no ha sido estudiada.
Las especies del mismo gnero: Isertia pittieri, Isertia haenkeana e Isertia
hypoleuca, producen alcaloides indlicos, triterpenos y saponinas triterpnicas,
metabolitos secundarios que pueden contribuir al desarrollo y descubrimiento de
nuevos frmacos al igual que productos de inters biolgico en general.
Igualmente los estudios revelan que estos metabolitos obtenidos de otras familias
botnicas han mostrado tener un potencial importante de actividad citotxica y
anticancergena.
El trabajo que aqu se presenta evalu la actividad citotxica de extractos y
fracciones de la especie Isertia laevis sobre dos lneas celulares de cncer de seno
MCF-7 y CSC-1595 y la lnea celular de clon Colo 205, mediante el mtodo de
fraccionamiento bioguiado por bioensayo MTT un ensayo colorimtrico,
rpido, verstil y cuantitativo. Es parte del programa de investigacin La
biodiversidad colombiana como fuente de nuevos frmacos en oncologa que
viene desarrollando el Grupo de Investigacin Fitoqumica de la Pontificia
Universidad Javeriana.
2. MARCO TERICO.
2.1 Las plantas, fuente de nuevas sustancias.
Segn Samper (2000), cuando nos referimos a la flora, se habla de la diversidad

de las plantas a nivel global y se calcula que en la actualidad hay cerca de 270 000
especies de plantas vasculares. Pero esta riqueza no est distribuida
uniformemente alrededor del globo y de hecho conocemos que hay ciertas
regiones, entre ellas Colombia, que se caracteriza por tener una alta concentracin
de especies.
Se estima que en Colombia existen entre 35 000 y 50 000 especies de plantas

vasculares. La gran variabilidad de climas, paisajes, grandes regiones e historias
evolutivas, ha permitido que podamos hablar de Colombia como un pas
megadiverso. Sin embargo, tenemos megadiversidad en la medida en que lo
reconozcamos y lo comprobemos y para eso se requiere de estudios bsicos
como los inventarios biolgicos. Gast, F en Mendoza et al (2004).
La forma alarmante en la que progresa el exterminio de especies vegetales en

ciertas reas, incluso antes de que dichas plantas hayan sido registradas y mucho
menos, estudiadas qumicamente, viene tambin a incrementar la necesidad de
realizar cada vez mayores esfuerzos, respecto a la conservacin gentica de las
plantas medicinales utilizadas en determinadas zonas. Pese a la rpida expansin
de la literatura fitoqumica, slo un pequeo porcentaje de la totalidad de las
especies se ha estudiado y queda, por tanto, un amplio campo de investigacin
futura. Los investigadores se enfrentan al problema de realizar una investigacin
sistemtica entre miles de especies an no estudiadas y de muchas de las cuales no
se conoce ninguna indicacin inmediata de su actividad farmacolgica. Pedrozo
(2004).
El descubrimiento de nuevas sustancias a partir de plantas con actividad

teraputica constituye una meta de la humanidad. El reino vegetal contiene un
enorme potencial de molculas por descubrir; se estima que ms del 90 % de las
especies no han sido estudiadas. La naturaleza ha demostrado ser una fuente
importante de compuestos anticancergenos efectivos; por ejemplo drogas
derivadas de microorganismos y de plantas. Los productos naturales representan
el 50 % de las drogas de uso clnico en pases desarrollados, el 25 % de los cuales
derivan de plantas superiores. Tllez et al (2004), Mongelli et al (2002). En los
pases en desarrollo el uso de las plantas medicinales representa el 80 % del
arsenal teraputico. Sharapin (2000).
Un 57% de las frmulas mdicas vendidas en Estados Unidos estn basadas en

productos naturales, esto es, son productos naturales en s o son derivados
sintticos o anlogos de productos naturales. De 1983 a 1995, ms del 60% de las
nuevas drogas aprobadas para el tratamiento del cncer e infecciones estuvieron
basadas en productos naturales. Los bosques tropicales por lo tanto representan
una reserva con potencial medicinal. Setzer et al (2003).
Las plantas tienen una larga historia de uso en el tratamiento del cncer, aunque
muchas de las demandas para la eficacia de tal tratamiento deben verse con algn
escepticismo porque el cncer es definido pobremente en la medicina tradicional.
Los primeros agentes de uso clnico fueron los llamados alcaloides de vinca
vinblastina y vincristina aislados de Catharanthus roseus la cual es usada por
varias culturas para el tratamiento de diabetes. Esta droga fue descubierta durante
una investigacin de la planta como un recurso potencial como agente
hipoglicemiante; por consiguiente, su descubrimiento puede ser atribuido
indirectamente a la observacin de un uso medicinal de la planta. Cragg et al
(2003).
Dos agentes con actividad clnica epidoside y teniposide son derivados

semisintticos del producto natural epipodophyllotoxin, que es relacionado
originalmente a una planta usada para el tratamiento del cncer.
Epipodophyllotoxin es un ismero de podophyllotoxin el cual fue aislado como el
agente anti-tumor activo de las races de varias especies del gnero
Podophyllum. Estas plantas poseen una larga historia de uso medicinal por parte
de las culturas americanas y asiticas, incluso en el tratamiento de cncer de piel y
verrugas. Cragg et al (2003).
Otros ejemplos son la homoharringtonine que ha mostrado eficacia contra las

varias leucemias, aislado del rbol chino Cephalotaxus harringtonia var
drupacea y el elliptinium, un derivado de ellipticine, comercializado en Francia
para el tratamiento de cncer de seno, aislado de especies de la familia de
Apocynaceae, incluida Bleekeria vitensis una planta medicinal de Fiji con
reputadas propiedades anticncer; las hojas de Taxus baccata usadas en la
medicina tradicional de la India (ayurveda), con un uso reportado en el
tratamiento del cncer. El flavopiridol es totalmente sinttico, pero la base para su
estructura es un producto natural, el rohitukine, aislado de Dysoxylum
binectariferum. El combretastatins, derivado de Combrettum cajfrunn, acta
causando el cierre vascular en el tumor y produciendo la necrosis. Cragg et al
(2003).
2.2 Familia Rubiaceae.
A lo largo de la historia taxonmica de Rubiaceae la definicin de tribus ha

presentado variaciones y en la actualidad an no se cuenta con una clasificacin
ampliamente aceptada. Al nivel de gneros, la mayora son estables y slo en
pocos casos se presentan segregaciones o diferencias entre especialistas. Mendoza
et al (2004).
Rubiaceae es una de las familias de plantas vasculares ms grandes, con 659

gneros y un nmero estimado de 10 700 especies alrededor del mundo, solo
Asteraceae, Orchidaceae y Poaceae tienen ms especies. Aproximadamente 80 %
de los gneros son leosas. Se han registrado 75 gneros y 729 especies de
Rubiaceae en los Andes por encima de los 1000 m de altitud, Palicourea el
gnero ms grande con 164 especies. Andersson (1995).
Es una familia cosmopolita, pero con mayor presencia en las regiones tropicales
y subtropicales. En el neotrpico, Rubiaceae generalmente figura entre las
primeras familias con mayor nmero de especies cuando se realizan inventarios
locales y en Colombia no slo es una de las ms diversas sino con mayor nmero
de individuos en las regiones Andina, Amaznica y del Choc biogeogrfico, la
mayor diversidad se registra en la regin Andina. Presenta una amplia cobertura
de ecosistemas, que van desde las zonas costeras y de los manglares hasta las
zonas de pramo Mendoza et al (2000), (2004).
De los gneros de Rubiaceae presentes en Colombia, cerca del 68% tienen

especies de hbito arbustivo o arbreo. Se encuentran en bosques, rastrojos,
potreros o pantanos. Para Colombia se registran 105 gneros nativos o
naturalizados distribuidos en 25 tribus. Adicionalmente se documentan cuatro
gneros introducidos y cultivados como ornamentales o alimenticios. Mendoza et
al (2004). En Cundinamarca est representada por 46 gneros y 115 especies.
Garca Kirkbride (1986).
El mayor oficio que cumplen es alimentar la fauna silvestre Mahecha (1997);

presenta especies con importancia econmica ya sea en la produccin de tintes,
sustancias mdicas, productos comestibles, maderables y ornamentales. Mendoza
et al (2004). La familia tienen importancia econmica principalmente por el caf
que es uno de sus integrantes, tambin son conocidas la quina, que sirvi para
extraccin de alcaloides y drogas para curar el paludismo y la ipecacuana que es
emitizante. Garca Kirkbride (1986).
2.3 Conceptos generales del gnero Isertia.
Isertia se distribuye desde Centroamrica hasta el norte de Suramrica, en el

caribe solo en el extremo occidente de Cuba y Guadalupe. Es caracterstica de
bosques secundarios o sucesionales. Boom (1984). El gnero presenta catorce
especies en Amrica, para Colombia se conocen siete especies distribuidas en
reas bajas del Choc biogeogrfico, Caribe, Llanos orientales, Amazonas y
piedemonte de los Andes en donde asciende hasta los 1.700 m de altitud.
Mendoza et al (2004).
Entre los nombres comunes y usos de las especies del gnero, en el Amazonas se
conoce como tef-capacira a Isertia coccinea var hypoleuca (Benth.) K. Schum,
que tiene propiedades medicinales. Isertia haenkeana DC. es conocida en Bolvar
como pava; los Karijonas la llaman cuyarocr; las hojas se emplean contra el
reumatismo, el paludismo y las lceras. En Nario se conoce a Isertia pittieri
(Standl.) Standl. como tabaquillo y flor de quinde. Garca Barriga (1992),
Mendoza et al (2004). Los indgenas miraa utilizan la corteza de Isertia sp que al
secarla y pulverizarla aplican sobre la zona que presenta heridas y granos para
acelerar la cicatrizacin. La Rotta (1988).
A Isertia laevis (Triana) B.M. Boom se le llama asaquiro y asaquir

(Vaups), vara santa (Tolima); las hojas se emplean como anticancergenos y
para curar infecciones de la piel. Garca Barriga (1992), Mendoza et al (2004). En
Per la madera de esta especie se utiliza en construccin y se conoce con el
nombre de asaquiro, caaynum, tsagnum, y cagnum. Boom (1984).
2.3.1 Isertia laevis (Triana) B.M. Boom
La clasificacin taxonmica de Isertia laevis es:

Reino: Plantae
Divisin: Magnoliophyta.
Clase: Magnoliopsida.
Subclase: Asteridae.
Orden: Rubiales
Familia: Rubiaceae.
Subfamilia: Cinchonoideae
Tribu: Isertieae
Gnero: Isertia
Especie: Isertia laevis
En la base de datos W3 TROPICOS del Missouri Botanical Garden se encuentra
que la sinonimia de esta especie es: Cassupa laevis Triana; Cassupa panamensis
Standl; Creatantha peruviana Standl; Isertia alba Sprague; Isertia panamensis
(Standl.) Standl.; Isertia parvifolia Standl; e Isertia weberbaueri Standl.
En Colombia presenta una distribucin entre los 300-1700 m de altitud. Se

encuentra en los departamentos del Amazonas, Antioquia, Boyac, Choc,
Caldas, Cauca, Caquet, Casanare, Cundinamarca, Huila, Meta, Putumayo y
Tolima. Mendoza et al (2004); en los Andes se puede encontrar en elevaciones
que van desde los 100 hasta los 2000 m.s.n.m y se extiende desde el norte de
Costa Rica y de oriente a occidente de la Amazona. Boom (1984). Figura 1.
Figura 1. Distribucin de I. laevis. (Tomada de Boom (1984)).
Son arbustos o rboles pequeos de 12 metros de alto, ramas cuadrangulares.

Hojas membranceas a subcoriceas, elpticas, 29-43 cm de largo, 14-20 cm de
ancho, pice agudo o cuspidado de 1-2 cm de largo, base aguda a redondeada,
haz glabro, envs blanco, pubescente. Pecolo 40-120 mm de largo, 2-5 mm de
ancho. 4 estpulas, interpeciolares, triangulares, 5-13 mm de largo. Inflorescencia
en pancula. Cliz en forma de copa, 5-6 mm de largo, 3-4 mm de ancho, dentro
glabro o ciliado, 5-6 lbulos. Corola blanca, tubular, 32-53 mm de largo, con
pubescencia alrededor de la boca, lbulos 5 a 6. Estambres 6 o 7, anteras
oblongas, 7-9 mm de largo. Ovario 2 a 3 locular. Estilo ciliolado, 32-47 mm de
largo, estigma con 2 lbulos oblongos, 3-5 mm de largo. Fruto en baya, elipsoidal,
8-11 mm de dimetro. Semillas 0.7-1 mm de largo. Boom (1984). Figura 2.
Figura 2. Inflorescencia de I. laevis. (Tomado de www.mobot.mobot.org)
Las hojas se usan como anticancergenas, hacen una decoccin de dos hojas para
una taza, lo cual se toma dos veces al da. Se dice que cura el cncer de
estmago; otro uso es el de los indios Cholos del Choc que toman la decoccin
de las hojas para curarse las infecciones de la piel, especialmente las lceras
malignas; Garca Barriga (1992).
2.3.2 Fitoqumica del gnero Isertia.
Algunos de las compuestos qumicos que han sido reportados para otras especies
de Isertia segn Bohlmann et al (1969); Garca Barriga (1992); Bruix et al
(1993) y Soto et al (2001) son alcaloides de tipo indlico y fueron encontrados
por Arriaga et al (1990) y Rumbero et al (1990), triterpenos y saponinas
triterpnicas por Um et al (2001).
Dos especies de este gnero han sido estudiados previamente: Isertia hypoleuca
de la cual se aislaron alcaloides del tipo quinamina, esteroles y triterpenos; en
Isertia haenkeana, aislaron secoiridoides, glicsidos triterpnicos, esteres de
cido qunico. Bruix et al (1993); Rumbero- Snchez et al (1991).
Alcaloides 2,2- Indolylquinuclidine son encontrados generalmente en tallos y
hojas de especies de Cinchona y Remijia. Sin embargo recientemente, bases
semejantes han sido aisladas de I. hypoleuca e I. haenkeana. Dihidroquinamina y
epidihidroquinamina de I. hypoleuca; de las hojas de I. haenkeana tambin se ha
aislado el segundo compuesto. En I. haenkeana fue encontrado un alcaloide
derivado del cido nicotnico que haba sido aislado previamente de la especie
Nauclea diderrichii. Bruix et al (1993).
Segn Bruneton (2001), la distribucin de este amplsimo grupo de alcaloides

indolmonoterpnicos est prcticamente limitado a tres familias: Apocynaceae,
Loganiaceae y Rubiaceae. La diversidad estructural de este grupo cuenta con ms
de 2 000 compuestos diferentes. Menos de un 10% de los gneros que
componen la familia Rubiaceae elaboran alcaloides a partir de una unidad
monoterpnica, se trata de gneros pertenecientes a las tribus ms primitivas de
la subfamilia de las Rubioideae (Psychotrieae: Cephaelis) y de los
Cinchonoideae (Naucleae: Andina, Nauclea; Cinchoneae: Remijia, Mitragyna,
Uncaria, etc).
La relacin entre Rubiaceae, Apocynaceae y Loganiaceae, en lo concerniente a

alcaloides, ha sido reconocida extensamente. Entre las especies que dieron
positivo para el test de alcaloides indlicos, estuvieron I. haenkeana e I. laevis.
Soto- Sobenis et al (2001).
Se aisl y determin de Isertia pittieri la estructura de dos nuevos 27-nor

bidesmsidos glicosidos triterpenos junto con dos glicosidos triterpnicos
conocidos, los 27-nor-triterpenos tienen un esqueleto C35 ese esqueleto deriva del
esqueleto normal C30 y su distribucin est restringida a unas pocas familias
botnicas. cidos glicosidos pirocinclicos han sido aislados solo de la familia
Rubiaceae, cuatro de Adena rubella y uno de I. haenkaena Um et al (2001).
Adems muchos glicosidos interesantes de cido quinvico y cincholic han sido
aislados de la familia Rubiaceae. Arriaga et al (1990). Tabla 1.
Tabla 1 Metabolitos secundarios aislados de especies del gnero Isertia.
Especie Estructuras Nombres Parte

planta
I. hypoleuca Alcaloides * Dihydrocinchonamine Hojas
* Isodihydroquinamine
I. haenkeana Alcaloides * Epidihydroquinamine Hojas

*Apodihydrocinchonami
y
ne
corteza
I. haenkeana Glicsidos triterpnicos * cido quinvico Hojas

3-O-6deoxy-D-
glucopyranoside-28-O--
D-glucopyranoside.
* Cincholic acid 3-O--
6-deoxy-D-
D-glucopyranoside.
I. haenkeana * Pyrocincholic acid 3- Hojas

O-6-deoxy-D-
D-glucopyranoside.
I. pittieri Glicsidos triterpnicos Pyrocincholic acid 3-O- Tallo
-D-quinovopyranosyl-
28--D-
glucopyranosyl(1-6)--D-
glucopyranosyl ester.
I. pittieri Esteres 4,5-di-O-caffeoylquinic Tallo

acid butyl ester.
1,5-di-O-caffeoylquinic
acid.
acid
acid.
2.4 Plantas medicinales con triterpenos, saponinas triterpnicas y su actividad

citotxica y antitumor.
Los triterpenos, 4 000 compuestos basados en ms de 40 esqueletos diferentes,

son compuestos en C30 procedentes de la ciclacin del 3S-2,3-epxido-2,3-
dihidroescualeno ms raramente del mismo escualeno. Casi siempre hidroxilados
en C3. Bruneton (2001).
Las saponinas son producidas principalmente por plantas pero tambin por
animales marinos inferiores y algunas bacterias. Constan de un azcar,
usualmente contienen glucosa, galactosa, xilosa, rhamnosa o metil pentosa,
glicosidicamente enlazada a una aglicona hidrofbica (sapogenina) la cual puede
ser terpenoide o esteroide. La aglicona puede contener uno o ms enlaces C-C
insaturados. La cadena oligosacrida est unida normalmente a la posicin C3
(monodesmsido) pero muchas saponinas tienen un azcar adicional en la
posicin C26 o C28 (bidesmsido). Francis et al (2002).
Segn Bilbao (1997), las saponinas triterpnicas se aslan principalmente de

dicotiledneas; son un grupo de glicsidos solubles en agua, que tienen las
propiedades de hemolizar la sangre y disminuir la tensin superficial del agua
formando espuma abundante.
Las saponinas son comunes en un gran nmero de plantas y productos de plantas

que son importantes en la nutricin humana y animal. Muchos efectos biolgicos
han sido atribuidos a las saponinas. Experimentos han demostrado las
propiedades fisiolgicas, inmunolgicas y farmacolgicas de las saponinas lo que
ha provocado un considerable inters clnico en estas sustancias. Francis et al
(2002).
Segn Sparg et al (2004), muchas saponinas son usados en fitoterapia y en la

industria cosmtica. Ellas son los constituyentes de muchas drogas de plantas
populares y son consideradas responsables de numerosas propiedades
farmacolgicas. Entre las propiedades biolgicas y farmacolgicas de las
saponinas se pueden enumerar: actividad antiparasitaria, citotxica y antitumoral,
antiviral, antiinflamatorio, antifngico. Numerosos reportes destacan las
propiedades citotxicas de muchas saponinas. Sin embargo las saponinas con
gran citotoxicidad no siempre tienen propiedades antitumor.
Las saponinas aisladas de diferentes plantas y animales han demostrado inhibir el

crecimiento de clulas cncer in vitro. La bsqueda de las sustancias naturales
capaces de controlar clulas malignas ha conducido a la investigacin
considerable sobre esta caracterstica de las saponinas. El efecto depresivo de las
saponinas contra las clulas de cncer puede ocurrir a travs de mecanismos
diversos y complejos. Ms claridad en cuanto a la especificidad de las saponinas
sobre diferentes tipos de cnceres podra ser conveniente en el diseo de
preparaciones teraputicas. Francis et al (2002).
Tabla 2. Plantas medicinales con saponinas triterpnicas, triterpenos y su
actividad citotxica y antitumor.
Nombre planta. Modelo Compuesto Respuesta Referencia

experimental. utilizado.
Aralia dasyphylla Clulas KB, Saponinas Actividad citotxica Xiao et al., 1999
Miq. HeLa-S3 triterpnicas
(Araliaceae)
Panax ginseng Clulas carcinoma Saponinas Actividad antitumor Lee et al., 1999
C.A.Meyer de prstata LNCaP triterpnicas Inhibe el crecimiento Liu et al., 2000
(Araliaceae) y la proliferacin
celular.
Pulsatilla Saponinas Actividad citotxica Mimaki et al.,

chinensis (Bunge) triterpnicas 1999
Regel
(Ranunculaceae)
Trevesia palmata Lneas celulares Saponinas Inhibe la De Tommasi et al.,
(Roxb. Ex Lindl.) J774, HeK-293 y triterpnicas proliferacin celular 2000
Vis. (Araliaceae) WEHI-164
Acanthophyllum Linfocitos Saponinas Actividad citotxica Gaidi et al., 2000
squarrosum Boiss. triterpnicas
(Caryophyllaceae)
Nigella sativa L. Saponinas Actividad antitumor Kumara & Huat.,

(Ranunculaceae) triterpnicas 2001
Silene fortunei Clulas tumorales Saponinas Actividad citotxica Gaidi et al., 2002
Vis. de clon triterpnicas
(Caryophyllaceae)
Acacia tenuifolia Lnea celular de Saponinas Actividad citotxica Abdel-Kader et al.,
(L.) Willd. cncer de pulmn triterpnicas 2001
(Leguminosae) M109
Acacia victoriae Clulas humanas Saponinas Actividad citotxica Mujo et al., 2001
Benth de leucemia T. triterpnicas
(Leguminosae)
Acacia concinna Clulas de Saponinas Actividad citotxica Tezuka et al., 2000
Wall. fibrosarcoma triterpnicas
(Leguminosae) humano HT-1080
Pittosporum Lneas celulares de Saponinas Actividad citotxica Seo et al., 2002
viridiflorum Sims cncer de ovario triterpnicas
(Pittosporaceae) A2780
Chysanthemum Clulas Raji Triterpeno Efecto inhibitorio Ukiya et al., 2002
morifolium pentacclico sobre virus Epstein-
(Composite) dioles y Barr
trioles
Clinopodium Melanoma Glucsidos, Inhibe el crecimiento Dzhambazo et al.,
vulgara L. metasttico triterpenos de clulas tumorales. 2002
(Lamiaceae) humano,carcinoma y saponinas
epidermoide triterpnicas
humano
2.4.1 Accin citotxica de especies de la familia Rubiaceae
Entre las especies de rubiaceae con estudios de actividad citotxica, se puede

nombrar a Palicurea ovalis, a esta planta le evaluaron los alcaloides que
presentaba en extractos y fracciones frente a clulas VERU-YARU, se encontr
que la CL50 para el extracto EtOH fue de 112 26.9 g/ml, calicantina (alcaloide)
125.8 25.6 g/ml y uno de los alcaloides (no identificado todava) 71 37.6
g/ml, concluyeron que la citotoxicidad del extracto fue debida en gran medida a
uno de los alcaloides presentes. Arteaga et al (1997).
El gnero Uncaria ha sido una de los ms estudiados, se descubrieron dos esteres

triterpenos tetracclicos y cidos uncarnicos de la especie U. rhynchophylla. Estos
compuestos inhibieron la fosfolipasa Cl (PLCl) con CI50 de 35.66 y 44.55 M
respectivamente. Los compuestos tambin inhibieron el crecimiento de las lneas
celulares de cncer A-549, HCT-15, MCF-7 y HT-1197. Otros seis compuestos
encontrados en esta especie fueron reportados porque tambin inhibieron tanto la
PLCl y el crecimiento de clulas de cncer, con una CI50 de 9.5-4.6 M y 0.5
6.5 g/ml respectivamente. Estos compuestos incluan nuevos cidos uncarnicos
y otros tres esteres triterpenos pentacclicos. Heitzman et al (2005).
Los extractos acuosos de U. tomentosa inhibieron la proliferacin de clulas

HL60 y Raji y afect solo de forma moderada a las clulas K562. cidos
urslicos aislados de esta misma especie han sido citotxicos en las lneas
celulares SK_MEL, KB, BT-549, SK-OV-3 y VERO con CI50 entre 30 y 40
g/ml en todas las lneas celulares. Heitzman et al (2005).
De Mitragyna inermes se han reportado alcaloides indlicos y saponinas

triterpnicas que poseen una 27-nor-triterpenoide aglycona poco comn la cual ha
sido solo reportada aislada de Adina rubella e Isertia haenkeana. El extracto
MeOH fue probado en las lneas celulares HL-60, Bel-7402, 293 y KB, present
la fraccin I como la nica citotxica para lnea celular Bell-7402 inhibiendo
>50% a una concentracin de 102 g/ml, esta fraccin fue purificada y se aisl el
componente citotxico 3-O-(-D-6-deoxy-glucopiranosil)-cido quinvico,
inhibiendo 43,01% y 91,74% el crecimiento de las clulas Hela en un a una
concentracin de 102 y 103 g/ml . Cheng et al (2002).
Otras especies estudiadas han sido Chiococca alba, Hamelia patens, Posoqueria
latifolia, Psychotria parvifolia, P. elata y Randia matudae, se utilizaron clulas
Hep G2, RatH-4-II-E, MDA-MB-231, Hs 578T, 5637. Ch. alba actu mejor en la
lnea celular Hs 578T con un porcentaje de clulas muertas de 100%, en las lneas
celulares Hep G2 y MDA-MB-231 no present actividad citotxica y en la lnea
celular 5637 tuvo un porcentaje de 6.44%;
H. patens present un 10.56% de clulas muertas en la lnea MDA-MB-231 y sin

citotoxicidad en Hep G2; Posoqueria latifolia tuvo un 27.69% de clulas muertas
en Hs 578T y un 0% en Hep G2 y MDA-MB-231 P. parvifolia tuvo un 70% de
clulas muertas en la lnea 5637, 44% en Hs 578T , 20% en MDA-MB-231 y 10%
para Hep G2 P. elata present porcentajes entre el 88 y 98% en todas las lneas
celulares. Setzer et al (2003).
2.5 Cultivo celular.

El cultivo de clulas tiene su origen en el siglo XIX, cuando se comenzaron a
estudiar con cierto detalle los tejidos y rganos en vasos de vidrio. Tras la
incorporacin de modificaciones que dieron lugar a medios ms sofisticados, se
hizo posible el cultivo de clulas tumorales procedentes de muestras de tejidos
malignos tanto del hombre como animales. En un principio el objetivo principal
era el estudio de las propias clulas, cmo crecen, qu necesitan para su
crecimiento, cmo y cundo dejan de crecer. Este tipo de estudios todava tiene
hoy un gran inters cientfico, por ejemplo, en relacin con investigaciones sobre
el ciclo celular y el control del crecimiento de clulas tumorales. Morgan &
Darling (1995).
El cultivo de clulas tiene el objetivo de mantener vivas, fuera de su organismo

de origen, clulas animales para estudiar su comportamiento sin el control normal
ejercido por el organismo vivo; para observarlas, bajo un ambiente experimental
controlable. Freshney (2000).
El cultivo de clulas, es la mejor manera de establecer nuevas lneas celulares en

cultivo para estudiar la morfologa celular y para comparar el efecto de diferentes
agentes, o diferentes concentraciones de un agente sobre el crecimiento y
metabolismo.
2.5.1 Lneas celulares.
Las lneas celulares son clulas de origen animal o humano que se han adaptado a
vivir en cultivo, poseen capacidad de proliferacin ilimitada, debido a que han
sufrido un proceso de transformacin, que puede ocurrir espontneamente, ser
inducido por compuestos qumicos, radiaciones o virus; que implica la alteracin
de las caractersticas de crecimiento. Freshney (2000).
Las lneas celulares establecidas se pueden dividir en dos tipos principales:

adherentes (clulas en monocapa) que se fijan al material plstico de un frasco o
placa y por lo tanto tienen que desprenderse de esa superficie antes de utilizarlas y
no adherentes (clulas en suspensin) que normalmente no se fijan a la superficie
del recipiente de cultivo. Morgan & Darling (1995).
Las clulas que crecen en cultivo, ya sean adherentes o en suspensin, suelen

clasificarse en primarias, inmortales o transformadas. Las clulas primarias son
aquellas recientemente aisladas a partir de tejidos u rganos y suelen tener una
duracin limitada de cultivo. Las clulas inmortales o transformadas presentan
ambas la propiedad de crecer en forma ilimitada en cultivo (es decir, no mueren).
Las clulas transformadas estn integradas por clulas que derivan de tumores o
que han sido manipuladas de algn modo. Morgan & Darling (1995).
La demostracin de que las clulas y los tumores slidos humanos pueden dar
origen a lneas celulares continuas, foment su empleo en investigacin sobre
cncer e impuls su implementacin como mtodo complementario de
screening o tamizaje previo a los ensayos in vivo, en el Grupo de Desarrollo de
Frmacos del Instituto Nacional de Cncer de los Estados Unidos. Cordero
(2002).
La propagacin de lneas celulares requiere que el nmero de clulas aumente

continuamente, las condiciones de cultivo han sido seleccionadas para favorecer
al mximo la proliferacin celular. Estas condiciones son: baja densidad celular,
baja concentracin de Ca2+ y la presencia de factores de crecimiento. Dentro de
los requerimientos generales de un cultivo de lneas celulares se cuentan: el medio
de cultivo nutritivo, condiciones de pH, temperatura y ambiente controlado. El
medio nutritivo bsicamente debe ser un medio lquido, que contenga una fuente
de carbono, aminocidos esenciales, oligoelementos, un sistema regulador de pH,
iones y factores de crecimiento aportados por el suero fetal bovino (FBS) con el
que generalmente se suplementa el medio. Adicionalmente los medios de cultivo
celular contienen rojo de fenol como indicador de pH, para permitir un constante
monitoreo de esta variable. Freshney (2000).
Despus de preparar el medio bsico deben ser aadidos otros suplementos, de
modo que pueda utilizarse en el cultivo celular, como por ejemplo antibitico para
disminuir el riesgo de contaminacin por microorganismos y suero que
proporciona una serie de nutrientes importantes para las clulas. Alvarado et al
(2002).
Entre las ventajas de las lnea celulares que citan Morgan & Darling (1995) se
encuentran que suelen ser ms sencillas de manejar que las clulas primarias,
crecen continuamente y puede obtenerse un mayor nmero de clulas. Adems
son ms fciles de obtener y existe una informacin relativamente abundante
sobre ellas.
2.6 Ensayos de citotoxicidad in vitro.
La definicin de citotoxicidad tiende a variar dependiendo de la naturaleza del

estudio, si las clulas mueren o simplemente tienen su metabolismo alterado.
Estos ensayos son empleados porque son baratos, fcilmente cuantificables y
reproducibles. Muchos experimentos in vitro, tienen el propsito de determinar la
potencial citotoxicidad de los compuestos estudiados, porque ellos van a ser
usados como frmacos, cosmticos y deben demostrar que no son txicos o
porque van a ser usados como agentes anticncer y la citotoxicidad es crucial
para su accin. Freshney (2000).
La configuracin de los modelos experimentales empleados in vitro para valorar

la toxicidad de los compuestos qumicos se fundamenta en dos pilares bsicos,
que son el sustrato biolgico y los indicadores de toxicidad. El sustrato es el
material generalmente orgnico, vivo o no, sobre el que se aplica in vitro el
xenobitico. Estas alteraciones se valoran mediante indicadores de toxicidad, que
son los parmetros que se determinan para cuantificar las modificaciones
producidas en la estructura o fisiologa de los componentes del sustrato de
ensayo. Repetto (1995).
Segn Cragg & Newman. (2003), en la dcada de los 90s el descubrimiento de
agentes antitumor de origen natural estuvo basado en tests de actividad citotxica
contra lneas celulares de cncer usando modelos in vitro o in vivo. Muchos
agentes anti-cncer descubiertos usando tales ensayos han mostrado ejercer su
accin citotxica a travs de la interaccin con la tubulina o de la inhibicin de la
topoisomerasa. Con la identificacin de un nmero creciente de blancos
moleculares asociados con cnceres particulares, el descubrimiento de drogas
anti-cncer est basado ahora en el alto rendimiento de tamizar compuestos
contra un rango de tales blancos.
En Monks et al (1991) se muestra como por ejemplo el Instituto Nacional de

Cncer de los E.U. ha implementando nuevas investigaciones in vitro para el
descubrimiento de nuevas drogas contra la enfermedad. Con el propsito de
examinar esto se proporcionara una evaluacin inicial de ms de 10 000 nuevas
sustancias por ao para la actividad citotxica y/o la inhibicin del crecimiento
contra una gran diversidad de tipos de tumores y permitir la deteccin de la
sensibilidad que un tumor puede tener a determinada droga. El objetivo es testar
nuevas sustancias contra un amplio panel representativo de lneas celulares de
tumores humanos.
Segn Fresney (2000), los ensayos de citotoxicidad se pueden clasificar en

ensayos de viabilidad y ensayos de supervivencia, los primeros se emplean para
determinar la proporcin de clulas que inmediatamente despus de un
tratamiento potencialmente traumtico, se mantienen intactas. Mediante estos
ensayos se puede evaluar la citotoxicidad de un tratamiento en trminos de
concentraciones letales (LC).
La concentracin letal 50 (LC50) es la concentracin de la sustancia de tratamiento

que causa la muerte al 50% de las clulas presentes, evaluadas inmediatamente
despus del tratamiento. Cordero (2002).
Para Freshney (1995), (2000), algunos ensayos de citotoxicidad como los de
viabilidad que se basan en la capacidad que tienen las clulas para excluir
sustancias a las que son impermeables, ofrecen una interpretacin instantnea,
Estos tests de viabilidad son para medir la tasa de supervivencia directamente, las
clulas que al ser expuestas al colorante no se tien, se consideran viables y son
de particular importancia para agentes txicos los cuales ejercen sus efectos
primarios sobre la integridad de la membrana.
2.6.1 Mtodo del MTT.
Muchos ensayos biolgicos requieren medir la supervivencia y/o proliferacin de

las clulas de mamfero, esto puede lograrse por varios mtodos, para esto se
desarrollo un ensayo colorimtrico rpido, verstil y cuantitativo, basado en una
sal de tetrazolio MTT (metil tiazol tetrazolio) (3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5
difenil tetrazolio bromuro),mide slo clulas vivientes y puede medirse
espectofotomtricamente leyendo la absorbancia entre 540570 nm. Mosmann
(1983).
El MTT es una sal de tetrazolio color amarillo que se utiliza para medir la
actividad y viabilidad celular por el rompimiento causado por la reduccin
(aceptacin de un H+) del anillo de la sal de tetrazolio MTT por accin de las
enzimas deshidrogenasas mitocondriales: succinatodeshidrogenasas, para
formar unos cristales azules de formazan insolubles en agua, pero solubles en
dimetil sulfxido (DMSO). La viabilidad celular es proporcional a la absorbancia,
que presentan los cristales de formazn en solucin. Angel (1999). Figura 3.
Figura 3. Metabolizacin de MTT a sales de formazan por clulas viables.

Este mtodo est basado en la capacidad de las enzimas mitocondriales de las
clulas viables de transformar la sal de tetrazolio MTT en cristales de formazan.
El mtodo ha sido usado exitosamente para monitorear la sensibilidad de clulas
de tumores humanos a agentes quimioteraputicos. Ferrari et al (1990).
2.7 El Cncer, entre las principales causas de mortalidad.
Para Pardo et al (2003) el pas no tiene an conocimiento certero acerca del

comportamiento de la enfermedad en nuestro medio, despus de las enfermedades
cardiovasculares y las muertes violentas, las neoplasias malignas son la tercera
causa de mortalidad en Colombia, para el 2000, el cncer de cuello uterino fue el
ms comn en las mujeres (23,4%), seguido por el de mama (19,7%) y el de piel
(11,8%).
Segn los datos de la International Agency for Research in Cancer (IARC), en el

2002, en el mundo, el cncer de mama represent 22,8% de todos los cnceres en
las mujeres, estimndose ms de 1 milln de casos nuevos por ao. En los pases
desarrollados, el cncer de mama es muy superior en incidencia a los otros tipos
de cncer, mientras que, en los pases menos desarrollados, la magnitud es
variable. En Colombia, la tasa de incidencia estimada es de 30 por 100.000
mujeres, muy similar a la de cncer de cuello uterino que es de 33 por 100.000
mujeres. Daz et al (2005).
En Colombia, la mortalidad por cncer de mama muestra una clara tendencia al

incremento en la ltima dcada. Para el ao 2000, el cncer de mama ocup el
tercer lugar como causa de muerte por cncer entre mujeres (con 1.542 muertes
registradas), despus del cncer de estmago y el de cuello uterino. Daz et al
(2005).
Segn Cordero (2002), dentro de la propuesta de programas de bioprospeccin

nacional se ha planteado como uno de los objetivos, el seleccionar e implementar
una serie de ensayos econmicos, rpidos, reproducibles, sensibles e indicativos,
para someter a los extractos naturales y sus fracciones a esta batera de pruebas,
con el propsito de evaluar su potencialidad de aplicaciones en campos
teraputicos con alto impacto sobre la economa y la calidad de vida.
3. FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN
3.1 Formulacin del problema.
En este trabajo de grado se plante evaluar el posible efecto citotxico frente a

lneas celulares tumorales de extractos obtenidos de una especie vegetal
perteneciente a la familia Rubiaceae.
En la parte de los Andes tropicales por encima de los 1000 m.s.n.m, el registro de
gneros de Rubiaceae que se tiene es de 75 y 729 especies, el gnero Isertia, tribu
Isertieae, aunque presenta una buena distribucin es un gnero poco conocido.
Aunque Isertia es un gnero pequeo, se encontr entre sus metabolitos

secundarios nuevas saponinas triterpnicas, triterpenos y alcaloides indlicos,
dichas sustancias han sido estudiadas en otras familias botnicas y se sabe que
presentan actividad citotxica y anticancergena, haciendo que esta planta
medicinal se convierta en una alternativa para estudiar preliminarmente su
citotoxicidad.
El cncer es un problema relevante dentro del perfil epidemiolgico de Colombia.

Datos generales muestran que, despus de las enfermedades cardiovasculares y las
muertes violentas, las neoplasias malignas son la tercera causa de mortalidad en
Colombia (Dane) y la incidencia estimada para el 2000 fue de 60.883 casos, con
33.178 muertes. Pardo et al (2003).
3.2 Pregunta de investigacin
Tendrn algn efecto citotxico frente a las lneas celulares de cncer de seno
CSC-1595 y MCF-7 y la lnea de clon Colo 205 los extractos y fracciones
obtenidos de Isertia laevis?
3.3 Justificacin.
Las plantas son una fuente de drogas medicinales que podran ser aprovechadas en
un uso clnico para atacar muchas de las enfermedades que no tienen opciones de
tratamiento; en los bosques colombianos un gran nmero de especies vegetales
no han sido estudiados, esta clase de trabajos son convenientes si se tiene en
cuenta la rpida destruccin que estn sufriendo estas zonas de vida.
Hacia finales de la dcada de los ochenta, resurge el inters de la industria

farmacutica mundial, por las plantas medicinales y otros recursos naturales como
fuentes de principios con actividad biolgica, como alternativa a las estrategias de
diseo de frmacos como la qumica combinatoria y la simulacin por
computador, que resultaron de difcil aplicacin y atendiendo a las
recomendaciones de la Organizacin Mundial de la Salud de promover el uso de
plantas medicinales y sus derivados en el tratamiento de patologas de alto
impacto social. Asebey (1996).
A las especies de Isertia se les atribuyen propiedades etnobotnicas para

diferentes enfermedades como lceras, reumatismo, paludismo y cncer de
estmago. La valoracin preliminar de la potencial actividad citotxica de los
extractos y fracciones de Isertia laevis servir para avanzar en la bsqueda de
principios que tengan actividad farmacolgica y para la generacin de beneficios
sociales y econmicos para la comunidad a travs del acercamiento a nuevas
alternativas teraputicas del cncer que pueden ser aplicadas en el pas.
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo general.
Determinar la viabilidad de lneas celulares tumorales de cncer de seno MCF-7,

CSC-1595 y clon Colo 205, tratados con extractos y fracciones obtenidos de
Isertia laevis.
4.2 Objetivos especficos.
Identificar los extractos y fracciones de hojas de Isertia laevis citotxicamente

activas.
Realizar la identificacin y caracterizacin qumica cualitativa de la fraccin o

principio activo citotxico obtenido de Isertia laevis.
Demostrar la accin sinrgica o antagnica de los posibles componentes del

extracto y/o fraccin citotxica ms activa de la especie Isertia laevis, frente a la
lnea celular ms sensible.
5. MATERIALES Y MTODOS.
Material vegetal:
Se colect el material vegetal en el municipio de Medina departamento de

Cundinamarca, a una altura de 550 m.s.n.m. La clasificacin taxonmica de la
planta fue realizada por M. Gutirrez del Instituto de Ciencias Naturales de la
Universidad Nacional de Colombia como Isertia laevis (Triana) B. M. Boom, de
la familia Rubiaceae. Un ejemplar se encuentra depositado en el Herbario
Nacional Colombiano con el No. COL: 506495.
La planta se limpi, se separ en sus partes, (hojas, tallo, flores y frutos), el

material vegetal se sec a la sombra en un lugar con buena corriente de aire.
Despus se pulveriz en un molino de cuchillas para que las partculas pequeas
tuvieran una mayor superficie de contacto con el solvente, se pes (2.6 Kg) y se
guard en un recipiente limpio y seco para utilizarlo posteriormente.
Obtencin de extractos:
En el Laboratorio de Fitoqumica de la Universidad Javeriana se obtuvieron los

extractos y fracciones de las hojas de Isertia laevis.
El material vegetal seco y molido se extrajo en Soxhlet con Petrol, durante 72

horas con el fin de desengrasar el material, el extracto en Petrol se concentr en
un rotaevaporador a presin reducida, posteriormente se flocul con MeOH-agua
por 24 horas, se filtr y se llev a sequedad.
El marco desengrasado se extrajo por maceracin en fro con EtOH, el extracto se

concentr a presin reducida en rotavapor.
Obtencin de fracciones:
A (5g) del extracto en petrol floculado, se le hizo una cromatografa en columna
tipo flash con slica gel G-60, eluda con Petrol, CH2Cl2, AcOEt, MeOH. A cada
fraccin se le realiz cromatografas en placas de slica gel corridas en Petrol:
AcOEt (7:3), reveladas con cido perclrico.
(2g) del extracto etanlico, se percol en una columna cromatografa tipo flash
con RP-18 y eluda con mezclas de MeOH:H2O (10:2), MeOH, MeOH:CH2Cl2
(8:2) y CH2Cl2, se obtuvieron 10 fracciones de 50 mL cada una. Las primeras
fracciones se monitorearon en CCD de RP-18 corridas en MeOH:H2O (10:2),
para el resto de fracciones CCD slica gel corridas en Petrol:AcOEt (7:3),
reveladas con cido perclrico.
La fraccin MeOH del extracto petrol se pas por cromatografa en columna de

Sephadex, se obtuvieron 3 subfracciones se realiz cromatografa en placas de
RP-18 corridas en MeOH:H2O (10:2), y revelada con cido perclrico; a la
fraccin 3 del extracto EtOH se le hizo cromatografa en columna de Sephadex, se
obtuvieron 2 fracciones, se realiz cromatografa en placas de RP-18 corridas en
MeOH:H2O (10:2), y revelada con cido perclrico. Figura 4.
A los extractos totales de EtOH y Petrol, a las fracciones y subfracciones se les

realizaron pruebas fitoqumicas cualitativas de terpenos: liebermann burchard,
salkwoski; glicsidos: molish, antrona; saponinas: prueba de espuma;
Flavonoides y fenoles: shinoda, cloruro frrico; alcaloides: dragendorff.
Material vegetal
Hojas
(1.5 Kg)
Extraccin en Soxhlet con petrol
Marco I Extracto Petrol

(41.34g)
Maceracin en fro
con EtOH
Flocular
Extracto EtOH Extracto

(2g) (5g)
Cromatografa
columna flash
slica gel
Cromatografa
en columna tipo flash
RP-18
F1............. F3. ... F10

petrol CH2Cl2 AcOEt MeOH
(580mg)(2980mg)(1112mg) (3708mg)
Cromatografa
columna Sephadex
sephadex
Sf3.1 Sf3.2 Sf1 Sf2 Sf3

(352mg) (130mg) (223mg) (438mg) (162mg)
Figura 4. Marcha fitoqumica I. laevis.
Para aislar alcaloides se utilizaron 20g de material vegetal y fueron extrados en

maceracin en fro con MeOH, se concentr en el rotavapor. El extracto MeOH
se acidific con HCl al 10%, despus de filtrado se neutraliz con NH4OH a pH 9.
Se extrajo con AcOEt en embudo de separacin, la fase orgnica se concentr
en el rotavapor. En el baln se form un precipitado que se sac con EtOH, este
precipitado form un slido con Pf: 221 C.
Fraccionamiento guiado por bioensayo:
La evaluacin de la actividad biolgica se realiz siguiendo el mtodo:

"fraccionamiento guiado por bioensayo. El cual consiste en la aplicacin de
tcnicas de separacin y aislamiento sobre un determinado extracto, con el objeto
de hacer un seguimiento de la actividad biolgica de las fracciones y compuestos
puros obtenidos, para finalizar con la identificacin de los principios activos
responsables de la actividad citotxica demostrada por el extracto original,
determinar el posible efecto sinrgico o antagnico entre las sustancias que estn
presentes en la fraccin que contiene el posible principio activo.
Bioensayos:
Los ensayos citotxicos se realizaron en el laboratorio de Virologa de la

Universidad Javeriana. La viabilidad celular fue determinada por la tcnica del
MTT, ensayo que se encuentra ampliamente referenciado en la literatura
Studzinski (1999). Se tom como control negativo del solvente empleado el
DMSO 0.2%.
Solubilizacin y preparacin de muestras:
Los extractos se solubilizan en Dimetil Sulfoxido (Merck) al 0.2% concentracin

inocua para las clulas, se realizaron los ensayos de los extractos a la
concentracin de 300 g/ml, las fracciones a 100 g/ml y subfracciones a 50
g/ml.
Lneas celulares:
Se utilizaron las lneas celulares neoplsicas suministradas por el Instituto

Nacional de Cncer de EEUU: MCF -7 (seno) y Colo 205 (clon) y la lnea de
cncer de seno obtenida y caracterizada en el Instituto Nacional de Cncer de
Colombia CSS-1595 con las siguientes caractersticas:
MCF-7. Tumor de una paciente de 69 aos con adenocarcinoma de glndula
mamaria, hipotetraploide, clulas epiteliales.
CSC 1595. Lnea celular colombiana obtenida en el laboratorio de biologa

experimental del INC del tumor de una paciente de 77 aos con cncer de seno
ductal infiltrante avanzado, caractersticas: aneuploide, 70 cromosomas,
hormonodependiente, sensible a antraciclinas y 5-fluoracilo. Tllez et al (2006).
Colo 205. Tumor de un paciente de 70 aos, caucsico, con carcinoma de clon

(adenocarcinoma), hipertriploide.
Cultivo celular:
Se utilizaron cajas de 96 pozos para el cultivo de las clulas con medio de cultivo
L-15 suplementado con 10% de suero fetal bovino y 100 l/10ml, penicilina
estreptomicina y neomicina (5000U, 5mg estreptomicina y 10 mg neomicina/ml).
Las lneas celulares fueron resuspendidas en medio de cultivo L-15 (40 000
clulas por pozo) en 100 l por pozo. Las cajas se incubaron a 37 C y 5% de CO2
por 24 horas, tiempo para la formacin de la monocapa de clulas. Despus de la
formacin de la monocapa, se colocaron 20 l de cada una de las soluciones de
extractos y fracciones a las concentraciones definidas (300 g/ml de extractos y
100 g/ml de fracciones), en los pozos de la caja, cada concentracin de los
extractos y fracciones tenan seis rplicas, se incubaron por 24 horas, tiempo
para que las clulas puedan incorporar las sustancias. Pasado este periodo las
soluciones de extractos y sus respectivas fracciones son retiradas y a cada pozo se
le adicionaron 100 l de medio L-15, por 24 horas para establecer si las clulas se
recuperan.
Posteriormente el medio es retirado y a cada pozo se le agregaron 100 l de

medio Dulbecco modificado y 50 l de MTT, las cajas se incubaron por 4 horas a
37 C. Pasadas las 4 horas se retiraron los 150 l de medio Dulbecco y MTT y se
adicionaron en los pozos 100 l de isopropanol para disolver los cristales de
formazan producidos, a continuacin se ley la absorbancia en espectrofotmetro
a una longitud de onda de 540 nm. Figura 5.
Cultivo de lneas celulares MCF-7, CSC-1595, colo 205

en placas de 96 pozos
100 l x pozo
con medio L-15
suero fetal bovino
antibitico
Incubar por 24h, a 37 C, con 5% de CO2
Adicin de 20 l de tratamiento por pozo

300 g/ml extractos
100 g/ml fracciones
50 g/ml subfracciones
Retiro de tratamientos
Adicin de 100 l de L15 x pozo
Retiro de medio L-15

Adicionar 100 l de medio Dulbecco modificado y 50 l de MTT
Incubar 4h
Retirar medio Dulbecco modificado y MTT
Adicionar 100 l de isopropanol
Lectura de placas en espectofotmetro a 540nm
Figura 5. Siembra de clulas y extractos en placas de 96 pozos.
El anlisis estadstico entre los valores de controles y ensayos fueron

interpretados mediante la prueba t (Student), con un nivel de significancia de
(p<0.05). Tablas 30-45.
6. RESULTADOS Y DISCUSIN
6.1 RESULTADOS.
Para las fracciones Petrol, CH2Cl2, AcOEt, MeOH del extracto en Petrol, las
pruebas fitoqumicas determinaron la presencia de esteroides y/o triterpenos en
las fracciones CH2Cl2, AcOEt, MeOH, tabla 3.
Tabla 3. Pruebas fitoqumicas de las fracciones del extracto Petrol.
Fraccin Cloruro Shinoda Liebermann Salkwoski Antrona Molisch

Frrico Burchard
1 Petrol - - - - - -
2 CH2Cl2 - - + + - +
3 AcOEt - - + + - +
4 MeOH - - + + + -
Estas fracciones se monitorearon mediante una CCD en slica gel G-60 corrida en
Petrol: AcOEt (7:3) y revelada en cido perclrico como se observa en la figura
6. Los Rf para el extracto Petrol fueron 0.25; 0.38; 0.52, los Rf para la fraccin
Petrol fueron: 0.48; 0.55; 0.63 y 0.76. Rf fraccin CH2Cl2: 0.14; 0.36; 0.51 y
0.66 Rf fraccin AcOEt: 0.14; 0.39. Rf fraccin MeOH: 0.69 y 0.80.
Figura 6. Cromatografa Extracto Petrol y fracciones 1-4.

Las fracciones obtenidas del extracto EtOH mostraron en las pruebas
fitoqumicas cualitativas la presencia de flavonoides, esteroides y/o triterpenos y
saponinas ver tabla 4.
Tabla 4. Pruebas fitoqumicas de las fracciones del extracto EtOH.

Frrico Burchard
1 + + + + + +
2 + - + + + +
3 - - + + + +
4 - - + - - -
5 - - + - - -
6 - - + - - -
7 - - + - - -
8 - - + - - -
9 - - + - - -
10 - - + - - -
En la figura 7 se muestra la CCD de RP-18 del extracto EtOH total y fracciones 1

a 8, corrida en MeOH:H2O (10:2), revelada con cido perclrico. Rf extracto
EtOH total: 0.21 y 0.95. Rf fraccin 1: 0.92. Rf fraccin 2: 0.62; 0.675; 0.76;
0.9; 0.9625. Rf fraccin 3: 0.37; 0.4. Rf para la fraccin 4 fueron: 0.21. Rf
fraccin 5: 0.08 y 0.21. Rf fraccin 6: 0.075.
Figura 7. Cromatografa en capa fina del extracto EtOH total y fracciones 1-8.
En la figura 8 se muestra la cromatografa de las fracciones 8-10 del extracto

EtOH en placa de slica gel, corrida con Petrol: AcOEt (7:3) y revelada con cido
perclrico. Rf subfraccin 9: 0.23. Rf subfraccin 10: 0.23; 0.36; 0.5.
Figura 8. Cromatografa fracciones 8-10 extracto EtOH.
Los resultados obtenidos en la evaluacin citotxica siguiendo el mtodo:

"fraccionamiento guiado por bioensayo (MTT), se consideraron activos los
extractos y las fracciones que presentaron porcentajes de viabilidad igual
inferiores a un 50 %. Los extractos totales petrol y etanlico frente a las lneas
celulares CSC 1595, MCF-7 y Colo 205, demostraron la mayor actividad los dos
extractos frente a lnea celular colombiana CSC-1595 con porcentajes de
viabilidad del 50% (50% de citotoxicidad) a la concentracin de 300 g/mL como
se muestra en la tabla 5.
Tabla 5. Porcentaje de viabilidad de las clulas para los extractos EtOH y Petrol
frente a las lneas celulares probadas. Concentracin 300 g/ml.
% Viabilidad
Extracto Petrol total Extracto EtOH total
MCF-7 82 76
Colo 205 104 101
CSC 1595 50 50
Las fracciones Petrol, CH2Cl2, AcOEt y MeOH se obtuvieron a partir del

extracto total en petrol y se probaron a la concentracin de 100 g/mL, La
fraccin MeOH present la mayor actividad como se muestra en la Tabla 6 y
figuras 9, 10 y 11; con porcentajes de viabilidad 32% y 7% para las lneas
celulares de cncer de seno MCF-7 y CSC 1595 respectivamente y no activo para
la lnea Colo 205 de coln.
Tabla 6. Porcentaje de viabilidad de las clulas para las fracciones Petrol, CH2Cl2,
AcOEt, MeOH del extracto petrol. Concentraciones aplicadas a 100 g/ml.
F. Petrol F. CH2Cl2 F. AcOEt F. MeOH
MCF-7 66 81 97 32
CSC 1595 64 43 38 7
Colo 205 77 82 97 69
EFECTO CITOTOXICO DEL EXTRACTO PETROL EN LA

LNEA CELULAR MCF-7
100
VIABILIDAD
80
%
60
40
20
0
Petrol 300ug/mL F. Petrol 100ug/ml F. CH2Cl2 F. AcOEt F. MeOH
EXTRACTO Y FRACCIONES
Figura 9. Efecto citotxico de extracto y fracciones Petrol en lnea celular MCF-7

EFECTO CITOTOXICO DEL EXTRACTO PETROL EN LNEA
CELULAR 1595
80
VIABILIDAD
60
%
40
20
0
P et r ol F. P et r ol F. CH2Cl 2 F. A c OE t F. M eOH
300ug/ mL 100ug/ ml
Figura 10. Efecto citotxico del extracto y fracciones petrol en lnea celular 1595.
EFECTO CITOTOXICO DEL EXTRACTO PETROL EN LA

LNEA CELULAR COLO 205
120
% VIABILIDAD
100
80
60
40
20
0
Petrol 300ug/mL F. Petrol F. CH2Cl2 F. AcOEt F. MeOH
100ug/ml
Figura 11. Efecto citotxico de extracto y fracciones de Petrol sobre lnea celular
Colo 205.
Las fracciones F.1 ....F.10 obtenidas a partir del extracto total etanlico se
probaron a la concentracin de 100 g/mL, La fraccin F.9 present la mayor
actividad frente a la lnea celular MCF-7 con un porcentaje de viabilidad del 20%
; La fraccin F.3 present actividad con porcentajes de viabilidad 27% y 23%
para las lneas celulares de cncer de seno MCF-7 y CSC 1595 respectivamente y
no activa para la lnea de coln Colo 205 con un 162% de viabilidad , sin
embargo s mostraron actividad para esta lnea las fracciones F. 4 y F. 5 con un
41% de viabilidad, como se muestra en la Tabla 7 y figuras 12,13 y 14.
Tabla 7. Porcentaje de viabilidad de las clulas para las fracciones 1 10 del
extracto EtOH. Concentraciones aplicadas a 100 g/ml.
F.1 F.2 F.3 F.4 F.5 F.6 F.7 F.8 F.9 F.10
MCF-7 93 43 27 44 72 44 29 50 20 55
CSC 1595 130 39 23 48 58 57 35 38 42 104
Colo 205 108 103 162 41 41 115 127 157 152 148
EFECTO CITOTOXICO DEL EXTRACTO EtOH EN LA

LNEA CELULAR MCF-7
100
VIABILIDAD
80
60
%
40
20
0
ETOH F.2 F.4 F.6 F.8 F-10
total
Figura 12. Efecto citotxico de extracto y fracciones obtenidas del extracto en

EtOH frente a la lnea celular MCF7, a una concentracin de 100 g/ml.

LNEA CELULAR 1595
140
VIABILIDAD
120
100
80
%
60
40
20
0
ETOH F.2 F.4 F.6 F.8 F-10
total
Figura 13. Efecto citotxico de extracto y fracciones de EtOH en lnea celular

CSC1595.
LNEA CELULAR COLO 205
200
VIABILIDAD
150
%
100
50
0
ETOH F.2 F.4 F.6 F.8 F-10
total
Figura 14. Efecto citotxico de extracto y fracciones de EtOH en lnea celular

colo 205.
La fraccin activa en MeOH se fraccion percolando en cromatografa en

columna con Sephadex como fase estacionaria y fase mvil MeOH, se obtuvieron
tres subfracciones, se realiz cromatografa en placas de RP-18 corridas en
MeOH:H2O (10:2), y revelada con cido perclrico. Los Rf para la subfraccin 1
fueron: 0.4 y 0.425. Rf subfraccin 2 0.25 y 0.4. Figura 15.
Sf1 Sf2 Sf3

Figura 15.Cromatografa subfracciones obtenidas de la fraccin MeOH del
extracto en Petrol
Para las subfracciones de la fraccin MeOH del extracto en Petrol, las pruebas
fitoqumicas determinaron la presencia de esteroides y/o triterpenos, tabla 8.
Tabla 8. Pruebas fitoqumicas de las subfracciones de la fraccin MeOH del
extracto Petrol.

Frrico Burchard
Sf1 - - + + - +
Sf2 - - + + - +
Sf3 - - + + - +
Las subfracciones Sf1, Sf2 y Sf3 obtenidas a partir de la fraccin MeOH del
extracto Petrol se probaron a la concentracin de 50 g/ml. La subfraccin Sf1
mostr un porcentaje de viabilidad del 100%; La subfraccin Sf2 present un
porcentaje de viabilidad de 72% y Sf3 83% de viabilidad para la lnea celular de
cncer de seno CSC 1595 como se muestra en la Tabla 9 y figura 16.
Tabla 9. Porcentaje de viabilidad de las clulas para las subfracciones de la

fraccin MeOH del extracto Petrol concentraciones aplicadas a 50 g/ml,
alcaloide a 25 g/ml.
% viabilidad
Sf1 Sf2 Sf3 Alcaloide
CSC 1595 100 72 83 83
EFECTO CITOTOXICO DE ALCALOIDE Y SUBFRACCIONES

DE LA FRACCIN MeOH DEL EXTRACTO PETROL EN LA
LNEA CELULAR 1595
100
% VIABILIDAD
80
60
40
20
0 Alcaloide subfr.1 subfr. 2 Subfr.3
ALCALOIDE, SUBFRACCIONES
Figura 16. Efecto citotxico del alcaloide y subfracciones de la fraccin MeOH

del extracto petrol sobre lnea celular 1595.
Para probar si las subfracciones actuaban de forma sinrgica o antagnica se
hicieron mezclas de las subfracciones, se probaron a una concentracin de 50
g/ml, las subfraccin 1 y 2 fueron las que presentaron un porcentaje de
viabilidad ms bajo 68% (32% citotoxicidad) como se muestra en la tabla 10
Tabla 10. Porcentaje de viabilidad de las clulas para la mezcla de las

subfracciones de la fraccin MeOH del extracto Petrol, concentraciones 50
g/ml.
% viabilidad
Sf1+ Sf2+Sf3 Sf1+ Sf2 Sf2+Sf3 Sf1+Sf3
Concentracin Concentracin Concentracin Concentracin
16.6 g/ml 16.6 g/ml 25 g/ml 25 g/ml
CSC 1595 71 68 92 84
La fraccin activa F.3 se paso por una columna con Sephadex, eluda con MeOH,
obtenindose dos subfracciones, se realiz cromatografa en placas de RP-18
corridas en MeOH:H2O (10:2), revelada con cido perclrico. Los Rf para la
fraccin F.3 y sus subfracciones 1 y 2 presentaron manchas con Rf 0.30; 0.37 y
0.45, figura 17.
F3 S3.1 S3.2
Figura 17. Cromatografa subfracciones de la fraccin 3 del extracto EtOH
Las pruebas fitoqumicas determinaron la presencia de esteroides y/o triterpenos
en las subfracciones de la fraccin 3 del extracto EtOH. Tabla 11.
Tabla 11. Pruebas fitoqumicas de la fraccin 3 del extracto EtOH.

Frrico Burchard
S3.1 - - + + - +
S3.2 - - + + - +
Las subfracciones S3.1 y S3.2 de la fraccin 3 del extracto EtOH se probaron a

la concentracin de 50 g/ml. La subfraccin S3.1 tuvo un porcentaje de
viabilidad del 60% y la subfraccin S3.2 mostr un porcentaje de viabilidad de
61% en la lnea celular CSC 1595 como se muestra en la Tabla 12 y figura 18.

fraccin 3 del extracto EtOH. Concentraciones aplicadas a 50 g/ml
subfracciones.
% viabilidad
Sf1 Sf2
CSC 1595 60 61
EFECTO CITOTOXICO DE LAS SUBFRACCIONES DE LA

FRACCIN 3 DEL EXTRACTO EtOH DEL EXTRACTO EN LA
LNEA CELULAR 1595
61,5
VIABILIDAD
61
%
60,5
60
subf r .1 Subf r . 2
SUBFRACCIONES
Figura 18. Efecto citotxico de subfracciones de EtOH en lnea celular 1595

Los resultados de la prueba estadstica t de Student (ver anexos) muestran que el
efecto citotxico de los extractos y fracciones fue producto de las concentraciones
que fueron probadas y no causado por otros agentes.
6.2 DISCUSIN DE RESULTADOS
Los extractos y fracciones obtenidos de Isertia laevis se probaron frente a un

panel de clulas provenientes de tejido tumoral, una colombiana obtenida del
Laboratorio de Biologa Experimental del Instituto Nacional de Cancerologa, la
lnea CSC-1595 y las lneas comerciales de seno MCF-7 y clon Colo 205, con el
fin de evaluar su actividad citotxica.
Los extractos se probaron a una concentracin de 300 g/ml mostrando los

siguientes efectos citotxicos, la lnea tumoral CSC 1595 fue la ms sensible a los
extractos totales petrol y etanlico, con un efecto citotxico del 50% (% de
viabilidad 50%).
En la evaluacin de las fracciones petrol, CH2Cl2, AcOEt y MeOH valoradas a

100 g/mL, se demostr que la ms activa fue la fraccin MeOH con porcentajes
de viabilidad de 32% y 7% en las lneas tumorales de seno MCF-7 y CSC 1595
respectivamente.
La lnea celular obtenida de tumor de paciente colombiano CSC 1595 fue la ms

sensible al efecto de las fracciones CH2Cl2, AcOEt y MeOH con porcentajes de
viabilidad del 43%, 38% y 7% respectivamente, este resultado es interesante si
se tiene en cuenta que esta lnea se considera joven, conservando un buen grado
de similitud entre el tejido tumoral y la lnea celular, opuesto a lo que sucede con
la lneas celulares comerciales como lo menciona Tllez et al (2004). Las
fracciones no fueron activas para la lnea celular de coln Colo 205. Estos
resultados demuestran cierta selectividad de accin frente a las lneas tumorales de
diversa procedencia y origen.
El comportamiento de las fracciones del extracto de EtOH tambin fue similar
para las lneas 1595 y MCF-7. Las fracciones 2, 3, 4, 7, 8 y 9 del extracto EtOH
presentaron porcentajes de viabilidad entre 23 y 50% para las lneas celulares
CSC 1595 y MCF-7, la fraccin 6 tuvo una viabilidad 44% solo para la lnea
celular MCF-7, la lnea celular Colo 205 tuvo un comportamiento diferente al de
las otras dos lneas, siendo las fracciones 4 y 5 las ms activas con un porcentaje
de viabilidad de 41% como se presenta en la tabla 7, opuesto a lo que mostr la
viabilidad para el resto de fracciones y extractos de petrol y EtOH que tuvieron
un efecto proliferativo con porcentajes de viabilidad entre 79 y 162% en esta lnea
celular. Figuras 13.
Las pruebas fitoqumicas cualitativas muestran que las fracciones del extracto
EtOH y del extracto petrol contienen esteroides y/o triterpenos y saponinas
triterpnicas Tablas 3 y 4, concuerda con la qumica reportada en la literatura
para las especies de Isertia, Arriaga et al (1990), Rumbero et al (1990), Bruix et
al (1993); Um et al (2001).
Los resultados del porcentaje de citotoxicidad para la fraccin MeOH a unas

concentraciones de 100 y 50 g/ml fue de (93% y 35% de efecto citotxico)
respectivamente lo que indica que la CC50 se debe encontrar entre los 50 y 100
g/ml; al subfraccionar la fraccin MeOH que fue la que present el porcentaje
de viabilidad inferior al 7% se quiso determinar el posible efecto sinrgico o
antagnico entre las sustancias que presentaba esta fraccin, se obtuvieron tres
fracciones y la fraccin que present un mayor porcentaje de citotoxicidad fue la
Sf2 (28%), las subfracciones no actuaron de manera similar como la fraccin
MeOH, por eso se hicieron mezclas de las subfracciones para observar cual
presentaba un efecto citotxico moderado, se observ que las mezclas donde se
encontraba la subfraccin 2 presentaron una mejor actividad citotxica explicando
as que las subfracciones 2 y 1 se relacionan de forma sinrgica y la subfraccin 3
presenta un efecto antagnico con respecto a las otras subfracciones.
Segn las cromatografas y las pruebas fitoqumicas cualitativas, los metabolitos
secundarios esteroides y/o triterpenos posiblemente sean los que estn actuando
favorablemente en la actividad citotxica de las fracciones que presentaron un
porcentaje de viabilidad menor o igual al 50%. A los triterpenos y saponinas
triterpnicas se les ha comprobado propiedades farmacolgicas importantes, entre
ellas una buena actividad citotxica en varias lneas celulares derivadas de
tumores humanos, como lo referencia Sparg et al (2004) para varias familias
botnicas y Cheng et al (2002) y Setter et al (2003) para especies de la familia
rubiaceae.
Uno de los gneros ms estudiado ha sido el gnero Uncaria, en la especie U.

rhynchophylla se encontraron varios esteres triterpenos tetracclicos y cidos
uncarnicos, los cuales inhibieron el crecimiento de las lneas celulares de cncer
A-549, HCT-15, MCF-7 y HT-1197. Heitzman et al (2005).
En el trabajo de Cheng et al (2002) sobre Mitragyna inermes se report una 27-

nor-triterpenoide aglycona que haba sido aislada solo de Isertia haenkeana y
Adina rubella. El extracto MeOH fue el que mostr ser citotxico contra un
panel de lneas celulares de cncer humanos, utilizaron como eluyentes de la
columna de slica gel CH2Cl2, AcOEt y MeOH, obteniendo tres fracciones. La
fraccin I present la inhibicin del crecimiento de ms del 50% en la lnea
celular Bel-7402, esta fraccin fue sometida a purificacin sobre columna de
Sephadex LH-20 y se aisl el componente citotxico (un cido quinvico).
Tanto el gnero Uncaria como el gnero Isertia pertenecen a la subfamilia

Cinchonoideae compartiendo caracteres morfolgicos, pero sera preciso acudir a
caracteres quimiotaxonmicos que fortalecieran an ms los aspectos
filogenticos dentro de la subfamilia.
Con la prueba t se compar el control con cada uno de los extractos y fracciones
evaluadas, los valores de t calculados mostraron ser inferiores a los valores de t
de la tabla. Se rechaz la Ho, es decir s hay diferencias significativas entre los
tratamientos y el control.
7. CONCLUSIONES
Las lneas celulares de cncer de seno CSC 1595 y MCF-7 fueron las lneas ms
sensibles al exponerlas a los diferentes extractos y fracciones de petrol y EtOH.
La fraccin MeOH del extracto en Petrol a la concentracin de 100 g/mL fue la

que present mayor actividad citotxica entre los extractos y fracciones evaluadas
con un 7% de viabilidad (efecto citotxico de 93%) frente a la lnea celular de
cncer de seno CSC 1595 y con un 32% de viabilidad (68% de efecto citotxico)
en la lnea celular comercial de seno MCF-7.
La subfraccin obtenida a partir de la fraccin MeOH, (SF-1, SF-2 y SF-3) que

present la mayor actividad citotxica a la concentracin de 50 g/mL fue SF-2.
La fraccin SF-1 Present un 100% de viabilidad.
La mezcla de las subfracciones de la fraccin MeOH demostr cierto grado de

sinergismo al potenciar la accin citotxica de SF-1 y SF-3.
La fraccin ms activa de Isertia laevis mediante las pruebas qumicas

cualitativas demostr la presencia glicsidos de triterpenos (Glicsidos
esteroidales y/o saponinas). Posiblemente los causantes de la accin citotxica.
Las fracciones del extracto EtOH presentaron moderada actividad citotxica para
las lneas celulares CSC 1595 y MCF-7.
Las fracciones y extractos que presentaron un porcentaje de viabilidad menor al

50% pueden ser evaluadas en otras lneas celulares derivadas de cncer de seno,
para estimar si existe especificidad citotxica frente a esta clase de lneas
celulares.
Las fracciones y extractos que no presentaron efecto citotxico pueden ser
probadas en lneas celulares derivadas de tumores de otros rganos para evaluar
que tan inocuas son.
8. RECOMENDACIONES
Se recomienda que todas las fracciones y extractos se prueben en un panel amplio

de lneas celulares tumorales humanas.
Se sugiere hacer pruebas con otras lneas celulares de cncer de seno.
Es importante seguir evaluando la fraccin MeOH del extracto Petrol que

present una viabilidad del 7%.
Es recomendable hacer ensayos sobre clulas normales para poder evaluar el

efecto txico que presentan los extractos y fracciones.
Se aconseja utilizar otras partes de la planta para comparar cual presenta mayor
concentracin de metabolitos secundarios.
9. REFERENCIAS
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10. ANEXOS.
Tabla 13. Efecto citotxico de extracto y fracciones de petrol sobre la lnea

celular CSC 1595.
CSC-1595
Petrol F. Petrol
300ug/mL 100ug/ml F. CH2Cl2 F. AcOEt F. MeOH CONTROL
0,108 0,12 0,077 0,065 0,06 0,147
0,117 0,101 0,076 0,069 0,006 0,193
0,108 0,094 0,064 0,058 0,005 0,191
0,111 0,091 0,081 0,073 0,004 0,194
0,094 0,113 0,085 0,062 0,005 0,188
0,011 0,176 0,086 0,092 0,005 0,172
Promedio 0,0915 0,115833333 0,078166667 0,069833333 0,014166667 0,180833333
Desv Est 0,040153456 0,031492327 0,008035339 0,01205681 0,022462561 0,018432761
Comp Control 5,7623E-04 0,00141388 1,97853E-07 2,23796E-07 6,5468E-08
Viabilidad 50,59907834 64,05529954 43,22580645 38,61751152 7,834101382
Tabla 14. Efecto citotxico de extracto y fracciones 1-3 de EtOH sobre la lnea
celular CSC 1595.
ETOH total F.1 F.2 F.3 CONTROL

0,042 0,234 0,049 0,036 0,147
0,087 0,195 0,051 0,038 0,193
0,084 0,187 0,043 0,033 0,191
0,097 0,173 0,051 0,057 0,194
0,118 0,235 0,068 0,033 0,188
0,123 0,387 0,165 0,056 0,172
Promedio 0,091833333 0,235166667 0,071166667 0,042166667 0,180833333
Desv Est 0,029157618 0,078552955 0,046717948 0,011267949 0,018432761
Comp Control 8,6832E-05 0,130069354 0,000324199 2,22335E-08
Viabilidad 50,78341014 130,0460829 39,35483871 23,31797235
Tabla 15. Efecto citotxico de fracciones 4-6de EtOH sobre la lnea celular CSC
1595.
F.4 F.5 F.6 CONTROL
0,08 0,086 0,086 0,175
0,072 0,094 0,102 0,19
0,08 0,092 0,101 0,146
0,09 0,093 0,097 0,188
0,076 0,104 0,099 0,159
0,081 0,106 0,088 0,133
Promedio 0,079833333 0,095833333 0,0955 0,165166667
Desv Est 0,006013873 0,007652886 0,00683374 0,023129346
Comp Control 5,34706E-06 3,84804E-05 3,39292E-05
Viabilidad 48,33501514 58,0221998 57,82038345
Tabla 16. Efecto citotxico de fracciones 7-10 de EtOH sobre la lnea celular
CSC 1595.
F.7 F.8 F.9 F.10 CONTROL

0,061 0,066 0,067 0,15 0,175
0,062 0,075 0,074 0,167 0,19
0,056 0,058 0,068 0,168 0,146
0,055 0,072 0,081 0,185 0,188
0,051 0,068 0,072 0,183 0,159
0,066 0,044 0,061 0,178 0,133
Promedio 0,0585 0,063833333 0,0705 0,171833333 0,165166667
Desv Est 0,005468089 0,011321072 0,00683374 0,013044795 0,023129346
Comp Control 6,6293E-07 2,22443E-06 2,27595E-06 0,552315225
Viabilidad 35,41876892 38,64783047 42,68415742 104,0363269
Tabla 17. Efecto citotxico de extracto y fracciones petrol sobre la lnea Colo
205.
Colo 205
Petrol F. Petrol
0,252 0,19 0,227 0,246 0,224 0,246
0,389 0,26 0,243 0,302 0,266 0,281
0,33 0,195 0,223 0,267 0,152 0,318
0,234 0,175 0,256 0,242 0,134 0,284
0,242 0,175 0,163 0,272 0,149 0,228
0,234 0,255 0,216 0,25 0,19 0,256
Promedio 0,280166667 0,208333333 0,221333333 0,263166667 0,185833333 0,268833333
Desv Est 0,06456134 0,038944405 0,032054121 0,022435834 0,051164115 0,032089978
Comp Control 7,0826E-01 0,014868353 0,02811947 0,730327646 0,007165794
Viabilidad 104,2157471 77,49535028 82,33106014 97,89212647 69,12585245
celular colo 205.
0,325 0,203 0,221 0,462 0,246
0,255 0,262 0,197 0,39 0,281
0,202 0,289 0,321 0,353 0,318
0,208 0,374 0,33 0,55 0,284
0,345 0,383 0,37 0,602 0,228
0,299 0,235 0,223 0,267 0,256
Promedio 0,272333333 0,291 0,277 0,437333333 0,268833333
Desv Est 0,060251694 0,07359076 0,071897149 0,125525562 0,032089978
Comp Control 9,0255E-01 0,51417516 0,804586015 0,009725912
Viabilidad 101,3019219 108,2455053 103,0378177 162,6782393
Tabla 19. Efecto citotxico de fracciones 4-6 de EtOH sobre la lnea celular Colo
205.
F.4 F.5 F.6 CONTROL
0,258 0,241 0,553 0,401
0,197 0,208 0,548 0,455
0,212 0,198 0,535 0,406
0,179 0,147 0,46 0,429
0,155 0,172 0,481 0,579
0,142 0,186 0,599 0,482
Promedio 0,1905 0,192 0,529333333 0,458666667
Desv Est 0,041965462 0,032106074 0,050867147 0,066358622
Comp Control 7,93916E-06 4,75947E-06 0,065256485
Viabilidad 41,53343023 41,86046512 115,4069767
Colo 205.
0,575 0,665 0,667 0,74 0,401
0,655 0,718 0,784 0,685 0,455
0,564 0,799 0,886 0,395 0,406
0,55 0,704 0,491 0,698 0,429
0,466 0,621 0,776 0,711 0,579
0,701 0,835 0,606 0,863 0,482
Promedio 0,585166667 0,723666667 0,701666667 0,682 0,458666667
Desv Est 0,082804388 0,080587013 0,142138899 0,154660919 0,066358622
Comp Control 1,5298E-02 9,90923E-05 0,003517424 0,008712474
Viabilidad 127,5799419 157,7761628 152,9796512 148,6918605
Tabla 21. Efecto citotxico de extracto y fracciones Petrol sobre la lnea celular
MCF-7.
MCF-7
Petrol F. Petrol
0,388 0,255 0,421 0,42 0,152 0,458
0,348 0,379 0,421 0,492 0,155 0,403
0,49 0,352 0,372 0,535 0,182 0,502
0,654
0,548
0,411
Promedio 0,408666667 0,328666667 0,404666667 0,482333333 0,163 0,496
Desv Est 0,073221126 0,065209917 0,028290163 0,058106225 0,016522712 0,094891517
Comp Control 2,0887E-01 0,030365027 0,157508506 0,828605817 0,000639086
Viabilidad 82,39247312 66,26344086 81,58602151 97,24462366 32,86290323
celular MCF-7.
0,04 0,537 0,197 0,14 0,458
0,407 0,408 0,221 0,12 0,403
0,692 0,442 0,222 0,142 0,502
0,654
0,548
0,411
Promedio 0,379666667 0,462333333 0,213333333 0,134 0,496
Desv Est 0,326858277 0,066860551 0,014153916 0,012165525 0,094891517
Comp Control 4,2043E-01 0,604456533 0,001632932 0,000380601
Viabilidad 76,54569892 93,21236559 43,01075269 27,01612903
MCF-7.
F.4 F.5 F.6 CONTROL
0,224 0,462 0,182 0,458
0,192 0,326 0,211 0,403
0,251 0,292 0,265 0,502
0,654
0,548
0,411
Promedio 0,222333333 0,36 0,219333333 0,496
Desv Est 0,02953529 0,089955545 0,042122836 0,094891517
Comp Control 0,002120235 0,078728504 0,002215909
Viabilidad 44,82526882 72,58064516 44,22043011
Tabla 24. Efecto citotxico de fracciones 7-10 de EtOH sobre la lnea MCF-7.
0,14 0,214 0,108 0,281 0,458
0,143 0,297 0,1 0,356 0,403
0,162 0,237 0,102 0,182 0,502
0,654
0,548
0,411
Promedio 0,148333333 0,249333333 0,103333333 0,273 0,496
Desv Est 0,011930353 0,04285246 0,004163332 0,087275426 0,094891517
Comp Control 4,8556E-04 0,004124494 0,000226881 0,011455932
Viabilidad 29,90591398 50,2688172 20,83333333 55,04032258
Tabla 25. Efecto citotxico del slido alcaloide sobre la lnea celular CSC 1595.
Alcaloide CONTROL
0,3390 0,4150
0,3930 0,4460
0,3280 0,4840
0,4650 0,3910
0,3710 0,4110
0,3010 0,4950
Promedio 0,3662 0,4403
Desv Est 0,0582 0,0421

Comp
Control 0,0300
Viabilidad 83,1567
Tabla 26. Efecto citotxico de fraccin MeOH en la lnea CSC 1595.

CSC-1595
fr. MeOH(50) CONTROL
0,166 0,244
0,183 0,249
0,156 0,237
0,152 0,272
Promedio 0,16425 0,2505
Desv Est 0,01381726 0,01515476
Comp Control 0,0001539
Viabilidad 65,5688623
Tabla 27. Efecto citotxico de las subfracciones MeOH del extracto petrol sobre
1595.
CSC-1595
A+B+C A+B(50) B+C(50) A+C CONTROL
0,215 0,229 0,289 0,165 0,282
0,15 0,171 0,177 0,164 0,249
0,163 0,148 0,174 0,187 0,237
0,166 0,161 0,162 0,181 0,272
0,178 0,169 0,25 0,223 0,244
Promedio 0,1744 0,1756 0,2104 0,184 0,2568
Desv Est 0,02478508 0,03118974 0,05596695 0,02397916 0,01925357
Comp
Control 0,00037389 0,00111581 0,11769359 0,00073416
Viabilidad 67,9127726 68,3800623 81,9314642 71,6510903
Tabla 28. Efecto citotxico de las subfracciones de la fraccin 3 del extracto

EtOH sobre la lnea celular CSC 1595.
Subfr.1 Subfr. 2 CONTROL
0,238 0,196 0,415
0,261 0,244 0,446
0,261 0,292 0,484
0,294 0,327 0,391
0,284 0,286 0,411
0,261 0,274 0,495
Promedio 0,2665 0,269833333 0,440333333
Desv Est 0,01982675 0,045070685 0,042103048
Comp Control 3,5671E-06 4,91071E-05
Viabilidad 60,52233157 61,27933384
Tabla 29. Efecto citotxico de las subfracciones de la fraccin 3 del extracto

EtOH sobre la lnea celular CSC 1595.
CSC-1595
F-3 1+2 CONTROL
0,381 0,282
0,243 0,249
0,225 0,237
0,224 0,272
0,335 0,244
Promedio 0,2816 0,2568
Desv Est 0,0720125 0,01925357
Comp Control 0,47819333
Viabilidad 109,657321
Tabla 30. Anlisis estadstico del efecto citotxico del extracto y fracciones Petrol
sobre la lnea celular CSC 1595. (300 g/ml), (100 g/ml).
VAR. 1 VARIABLE 1 VARIABLE 1 VARIABLE 1 VARIABLE1 VARIABLE2
Ext. Petrol F. Petrol F. CH2Cl2 F. AcOEt F. MeOH
Media 0,043597704 0,110308296 0,07741116 0,0683247 0,00580645 0,17906486
Varianza 0,0016123 0,000991767 6,4567E-05 0,00014537 0,00050457 0,00033977
Observaciones 6 6 6 6 6 6
Diferencia hipottica
de las medias 0 0 0 0 0
Grados de libertad 10 10 10 10 10
P(T< =t) una cola 0,000288113 0,00070694 9,8927E-08 1,119E-07 3,2734E-08
P(T< =t) dos colas 0,000576226 0,00141388 1,9785E-07 2,238E-07 6,5468E-08
Tabla 31. Anlisis estadstico del efecto citotxico del extracto y fracciones 1-3
EtOH sobre la lnea celular CSC 1595. (300 g/ml), (100 g/ml).
VARIABLE 1 VARIABLE1 VARIABLE1 VARIABLE1 VARIABLE 2
Ext. EtOH F.1 F.2 F.3
Media 0,080947109 0,21922655 0,05788927 0,039973183 0,179064859
Varianza 0,000850167 0,00617057 0,00218257 0,000126967 0,000339767
Observaciones 6 6 6 6 6
Diferencia hipottica de
las medias 0 0 0 0
Grados de libertad 10 10 10 10
P(T< =t) una cola 4,3416E-05 0,06503468 0,0001621 1,11168E-08
P(T< =t) dos colas 8,68319E-05 0,13006935 0,0003242 2,22335E-08
Tabla 32. Anlisis estadstico del efecto citotxico de fracciones EtOH sobre la
lnea celular CSC 1595. (100 g/ml).
VARIABLE1 VARIABLE1 VARIABLE1 VARIABLE 2
F.4 F.5 F.6
Media 0,079466437 0,095332209 0,095077002 0,162363964
Varianza 3,61667E-05 5,85667E-05 4,67E-05 0,000534967
Observaciones 6 6 6 6
de las medias 0 0 0 0
P(T< =t) una cola 2,67353E-06 1,92402E-05 1,69646E-05 0
P(T <=t) dos colas 5,34706E-06 3,84804E-05 3,39292E-05 0
Tabla 33. Anlisis estadstico del efecto citotxico de fracciones EtOH sobre la
VARIABLE1 VARIABLE1 VARIABLE1 VARIABLE1 VARIABLE 2
F.7 F.8 F.9 F.10
Media 0,058071563 0,061824903 0,069952263 0,17096484 0,162363964
Varianza 2,99E-05 0,000128167 4,67E-05 0,000170167 0,000534967
Diferencia hipottica de las
medias 0 0 0 0 0
P(T< =t) una cola 3,31465E-07 1,11222E-06 1,13797E-06 0,276157613 0
P(T< =t) dos colas 6,6293E-07 2,22443E-06 2,27595E-06 0,552315225 0
Tabla 34. Anlisis estadstico del efecto citotxico del extracto y fracciones
Petrol sobre la lnea celular colo 205. (300 g/ml), (100 g/ml).
VAR. 1 VAR. 1 VAR. 1 VAR. 1 VAR. 1 VAR. 2
Media 0,26968121 0,20278726 0,216796946 0,2616623 0,175234231 0,26570122
Varianza 0,00416817 0,00151667 0,001027467 0,00050337 0,002617767 0,00102977
de las medias 0 0 0 0 0 0
Grados de libertad 10 10 10 10 10 10
P(T< =t) una cola 0,35413138 0,00743418 0,014059735 0,36516382 0,003582897
P(T <=t) dos colas 0,70826276 0,01486835 0,02811947 0,73032765 0,007165794
EtOH sobre la lnea celular colo 205. (300 g/ml), (100 g/ml).
VAR.2
VAR. 1 VAR. 1 VAR. 1 VAR. 1
Media 0,26087284 0,26570122 0,27594845 0,261624814 0,40578663
Varianza 0,00363027 0,00102977 0,0054156 0,0051692 0,01575667
medias 0 0 0 0 0
P(T< =t) una cola 0,45127341 0,25708758 0,402293007 0,00486296
P(T <=t) dos colas 0,90254683 0,51417516 0,804586015 0,00972591
Tabla 36. Anlisis estadstico del efecto citotxico de fracciones 4-6 EtOH sobre
la lnea celular colo 205. (100 g/ml).
VAR.1 VAR.1 VAR.1 VAR. 2
F.4 F.5 F.6
Media 0,183208619 0,187496522 0,52517979 0,45155463
Varianza 0,0017611 0,0010308 0,00258747 0,00440347
de las medias 0 0 0 0
P(T< =t) una cola 3,96958E-06 2,37973E-06 0,03262824
P(T< =t) dos colas 7,93916E-06 4,75947E-06 0,06525649
Tabla 37. Anlisis estadstico del efecto citotxico de fracciones EtOH 7-10
sobre la lnea celular colo 205. (100 g/ml).
F.7 F.8 F.9 F.10
Media 0,575289271 0,716294168 0,67575836 0,64234781 0,45155463
Varianza 0,006856567 0,006494267 0,02020347 0,02392 0,00440347
medias 0 0 0 0 0
P(T< =t) una cola 0,007649051 4,95462E-05 0,00175871 0,00435624
P(T< =t) dos colas 0,015298102 9,90923E-05 0,00351742 0,00871247
Tabla 38. Anlisis estadstico del efecto citotxico del extracto y fracciones Petrol
sobre la lnea celular MCF-7. (300 g/ml), (100 g/ml).
VAR.1 VAR. 1 VAR. 1 VAR. 1 VAR.1 VARIABLE2
Media 0,4004432 0,31911498 0,4032927 0,477506911 0,16194274 0,482168327
Varianza 0,00536133 0,00425233 0,00080033 0,003376333 0,000273 0,0090044
de las medias 0 0 0 0 0 0
Grados de libertad 10 10 10 10 10 10
P(T<=t) una cola 0,10443536 0,01518251 0,07875425 0,414302908 0,00031954
P(T< =t) dos colas 0,20887071 0,03036503 0,15750851 0,828605817 0,00063909
EtOH sobre la lnea celular MCF-7. . (300 g/ml), (100 g/ml).
VARIABLE 1 VARIABLE1 VARIABLE1 VARIABLE1 VARIABLE 2
Media 0,10379872 0,45623066 0,21268249 0,133224125 0,48216833
Varianza 0,10683633 0,00447033 0,00020033 0,000148 0,0090044
medias 0 0 0 0 0
P(T< =t) una cola 0,21021593 0,30222827 0,00081647 0,000190301
P(T <=t) dos colas 0,42043187 0,60445653 0,00163293 0,000380601
Tabla 40. Anlisis estadstico del efecto citotxico de fracciones EtOH 4-6 sobre
la lnea celular MCF-7. (100 g/ml).
VAR.1 VAR.1 VAR.1 VAR. 2
F.4 F.5 F.6
Media 0,219672672 0,346554609 0,214172098 0,4821683
Varianza 0,000872333 0,008092 0,001774333 0,0090044
Diferencia
hipottica de las
medias 0 0 0 0
Grados de
libertad 7 7 7 7
P(T <=t) una cola 0,001060117 0,039364252 0,001107954
P(T <=t) dos
colas 0,002120235 0,078728504 0,002215909
Tabla 41. Anlisis estadstico del efecto citotxico de fracciones EtOH 7-10
sobre la lnea celular MCF-7. (100 g/ml).
F.7 F.8 F.9 F.10
Media 0,14771992 0,244711981 0,103223388 0,252903903 0,48216833
Varianza 0,00014233 0,001836333 1,73333E-05 0,007617 0,0090044
Diferencia
hipottica de las
medias 0 0 0 0 0
P(T< =t) una cola 0,00024278 0,002062247 0,000113441 0,005727966
P(T <=t) dos colas 0,00048556 0,004124494 0,000226881 0,011455932
Tabla 42. Anlisis estadstico del efecto citotxico de slido alcaloide sobre la
VAR.1 VAR 2
Alcaloide
Media 0,35903684 0,437039267
Varianza 0,00339057 0,001772667
Observaciones 6 6
de las medias 0 0
Grados de libertad 10 10
P(T< =t) una cola 0,0149798
P(T< =t) dos colas 0,0299596
Tabla 43. Anlisis estadstico del efecto citotxico de la fraccin MeOH sobre la
Media 0,163413505 0,24983909
Varianza 0,000190917 0,00022967
Observaciones 4 4
Diferencia hipottica de las medias 0 0
P(T< =t) una cola 7,69487E-05
P(T <=t) dos colas 0,000153897
Tabla 44. Anlisis estadstico del efecto citotxico de subfracciones de la fraccin

MeOH del extracto petrol sobre la lnea celular CSC 1595. (50 g/ml).
Media 0,17185159 0,17182212 0,18171954 0,25567072
Varianza 0,0009728 0,0031323 0,000575 0,0003707
Diferencia hipottica de las medias 0 0 0 0
P(T <=t) una cola 0,0005579 0,0588468 0,00036708
P(T< =t) dos colas 0,00111581 0,11769359 0,00073416
Tabla 45. Anlisis estadstico del efecto citotxico de subfracciones de la fraccin

3 del extracto EtOH sobre la lnea celular CSC 1595. (50 g/ml).
Media 0,268330991 0,25567072
Varianza 0,0051858 0,0003707
Observaciones 5 5
Diferencia hipottica de las medias 0 0
P(T< =t) una cola 0,239096666
P(T< =t) dos colas 0,478193332
EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD CITOTXICO DE EXTRACTOS Y
DERIVADAS DE TUMORES HUMANOS
SANDRA LILIANA CASTRO DIAZ., ALBA .N. TLLEZ ALFONSO.
slcastro@javeriana.edu.co, ntellez@javeriana.edu.co
RESUMEN
Las fracciones y subfracciones de Isertia laevis del extracto Petrol y EtOH,
mostraron actividad citotxica frente a lneas celulares tumorales humana de
cncer de seno (MCF-7 y CSC 1595) y de clon (colo 205). Las fracciones
fueron probadas a una concentracin de 100 g/ml, la fraccin MeOH del
extracto Petrol present un porcentaje de viabilidad de 7% sobre la lnea celular
1595 y fue la fraccin ms activa, del extracto EtOH la fraccin 3 con 27%
para la lnea MCF-7 y 23 % de viabilidad en la lnea 1595 fue la fraccin que
mostr mejor resultado. Para la lnea celular colo 205 las fracciones ms activas
fueron la 4 y 5 del extracto EtOH con un porcentaje de viabilidad de 41%. Las
pruebas fitoqumicas cualitativas mostraron que las fracciones de petrol y las de
EtOH contienen esteroles y/o triterpenos
Palabras claves: Actividad Citotxica, Isertia laevis, Extractos hojas.

ABSTRACT
The fractions of Isertia laevis showed citotoxic activity in front of human tumor
cell lines of breast cancer (MCF-7 and CSC 1595) and of colon (colo 205). The
fractions were proven to a concentration of 100 g/ml, the fraction MeOH of the
extract Petrol presented a percentage of viability of 7% on the cell line 1595 and it
was the most active fraction, of the extract EtOH the fraction 3 with 27% for the
line MCF-7 and 23% of viability in the line 1595 the fraction that showed better
result were. For the cell line colo 205 the most active fractions it was the 4 and 5
of the extract EtOH with a percentage of viability of 41%. The tests qualitative
showed that the fractions contain esterols and/or triterpenes.
Key words: cytotoxic activity, Isertia laevis, leaves extracts.

INTRODUCCIN.
Colombia presenta una gran diversidad de plantas vasculares, la mayora de ellas
no han sido estudiadas o son poco conocidas.
No se conocen trabajos fitoqumicos de Isertia laevis, se tienen reportes de los
metabolitos secundarios de I.pittieri, I.haenkeana e I.hypoleuca, en las que se han
encontrado alcaloides indlicos Bohrmann et al (1969); Garca Barriga (1992);
Bruix et al (1993) y Soto et al (2001), triterpenos Arriaga et al (1990) y Rumbero
et al (1990) y saponinas triterpnicas Um et al (2001); estas ltimas segn
varios estudios en otras familias botnicas tienen propiedades citotxicas y
anticancergenas y han presentado buenos resultados en ensayos con lneas
celulares tumorales. Sparg et al (2004). En etnobotnica I. laevis se utiliza como
anticancergena Garca Barriga (1992).
En este trabajo se evalu la actividad citotxica de extractos y fracciones de hojas
de la especie I. laevis sobre las lneas celulares de cncer de seno MCF-7, CSC-
1595 y de clon Colo 205 mediante el mtodo in vitro MTT, un ensayo
colorimtrico rpido, verstil y cuantitativo. Mosmann (1983).
MATERIALES Y MTODOS.
Material vegetal: Se colect en el municipio de Medina departamento de
Cundinamarca. Un ejemplar se deposit en el Herbario Nacional Colombiano con
No. COL: 506495.

Obtencin de extractos: Se realiz extraccin en Soxhlet con Petrol para el
desengrase del material durante 72 horas, se concentr en rotavapor a presin
reducida. Al extracto floculado se le hizo una cromatografa en columna flash en
slica gel eluda con Petrol, CH2Cl2, AcOEt, MeOH de la cual se obtuvieron 4
fracciones. A cada fraccin se le realiz cromatografas en placas de slica gel
corridas en Petrol:AcOEt (7:3), reveladas con cido perclrico.
El material desengrasado fue extrado por maceracin en fro con EtOH, el
extracto se concentr a presin reducida en rotavapor. Se realiz cromatografa en
columna flash con RP-18 eluda con mezclas de MeOH:H2O (10:2), MeOH,
MeOH:CH2Cl2 (8:2) y CH2Cl2, se obtuvieron 10 fracciones.
A la fraccin MeOH se le hizo cromatografa en columna con Sephadex eluda
con MeOH, se obtuvieron tres subfracciones, se les hizo cromatografa en placas
de RP-18 corridas en MeOH:H2O (10:2), revelada en cido perclrico. A la
fraccin 3 del extracto EtOH tambin se le hizo subfraccionamiento y se
obtuvieron dos subfracciones, se realiz cromatografa en placas de RP-18
corridas en MeOH:H2O (10:2), revelada con cido perclrico.
A los extractos totales de EtOH y Petrol y a las fracciones se les realizaron
pruebas fitoqumicas cualitativas de terpenos: liebermann burchard, salkwoski;
saponinas: molish, antrona, prueba de espuma; flavonoides: shinoda, cloruro
frrico; alcaloides: dragendorff.

Fraccionamiento guiado por bioensayo: consiste en la aplicacin de tcnicas de
separacin y aislamiento sobre un determinado extracto, con el objeto de hacer un
seguimiento de la actividad biolgica de las fracciones obtenidas, para finalizar
con la identificacin de los principios activos responsables de la actividad
citotxica demostrada por el extracto original, determinar el posible efecto
sinrgico o antagnico entre las sustancias que estn presentes en la fraccin que
contiene el posible principio activo.
Bioensayos: La viabilidad celular fue determinada por la tcnica del MTT, ensayo
que se encuentra ampliamente referenciado en la literatura Studzinski (|1999). Se
tom como control negativo del solvente empleado DMSO 0.2%.
Solubilizacin y preparacin de muestras: Los extractos se solubilizan en
Dimetil Sulfoxido (Merck) al 0.2% concentracin inocua para las clulas.
Lneas celulares: Se utilizaron las lneas celulares neoplsicas suministradas por
el Instituto Nacional de Cncer de EEUU: MCF -7 (seno) y Colo 205 (clon) y
la lnea de cncer de seno obtenida y caracterizada en el Instituto Nacional de
Cncer de Colombia CSS-1595 con las siguientes caractersticas:
MCF-7. Tumor de una paciente de 69 aos con adenocarcinoma de glndula
mamaria, hipotetraploide, clulas epiteliales.

CSC 1595. Tumor de una paciente de 77 aos con cncer de seno ductal
infiltrante avanzado, caractersticas: aneuploide, 70 cromosomas,
hormonodependiente, sensible a antraciclinas y 5-fluoracilo. Tllez et al (2006).
Colo 205. Tumor de un paciente de 70 aos, caucsico, con carcinoma de clon
(adenocarcinoma), hipertriploide.
Cultivo celular: Se utilizaron cajas de 96 pozos para el cultivo de las clulas con
medio L-15 suplementado con 10% de suero fetal bovino y 100 l/10ml,
penicilina estreptomicina y neomicina (5000U, 5mg estreptomicina y 10 mg
neomicina/ml). Las lneas celulares fueron resuspendidas en medio de cultivo L-
15 (40 000 clulas por pozo) en 100 l por pozo. Las cajas se incubaron a 37 C
y 5% de CO2 por 24 horas, tiempo para la formacin de la monocapa de clulas.
Despus de la formacin de la monocapa, se colocaron 20 l de cada una de las
soluciones de extractos y fracciones a las concentraciones definidas (300 g/ml de
extractos y 100 g/ml de fracciones), en los pozos de la caja, se incubaron por 24
horas, tiempo para que las clulas puedan incorporar las sustancias. Pasado este
periodo las soluciones de extractos y sus respectivas fracciones son retiradas y a
cada pozo se le adicionaron 100 l de medio L-15, por 24 horas para establecer si
las clulas se recuperan.
Posteriormente el medio es retirado y a cada pozo se le agregaron 100 l de
medio Dulbecco modificado y 50 l de MTT, las cajas se incubaron por 4 horas a
37 C. Pasadas las 4 horas se retiraron los 150 l de medio Dulbecco y MTT y se

adicionaron en los pozos 100 l de isopropanol para disolver los cristales de
formazan producidos, a continuacin se ley la absorbancia en espectrofotmetro
a una longitud de onda de 540 nm.
RESULTADOS.
Para las fracciones Petrol, CH2Cl2, AcOEt, MeOH del extracto en Petrol, las
pruebas fitoqumicas determinaron la presencia de esteroides y/o triterpenos.
Tabla 1. Pruebas fitoqumicas de las fracciones del extracto Petrol.
Frrico Burchard
Petrol - - - - - -
CH2Cl2 - - + + - +
AcOEt - - + + - +
MeOH - - + + + -
Las fracciones obtenidas del extracto EtOH mostraron en las pruebas
fitoqumicas cualitativas la presencia de flavonoides, esteroides y/o triterpenos y
saponinas ver tabla 2.
Tabla 2. Pruebas fitoqumicas de las fracciones del extracto EtOH.
Frrico Burchard
1 + + + + + +
2 + - + + + +
3 - - + + + +
4-10 - - + - - -
A los extractos de Petrol y EtOH se hojas de I.laevis se les evalu el efecto
citotxico a una concentracin de 300 g/ml y a las fracciones a una
concentracin de 100 g/ml, frente a las lneas celulares. Las fracciones que se
consideraron activas fueron las que presentaron un porcentaje de viabilidad menor
a un 50%. La fraccin MeOH del extracto Petrol present la mayor actividad
como se muestra en la Tabla 3 con un porcentaje de viabilidad de 7% en la lnea
celular 1595.
Tabla 3. Porcentaje de viabilidad de las clulas para las fracciones Petrol, CH2Cl2,
AcOEt, MeOH del extracto petrol. Concentracin a 100 g/ml.
F. Petrol F. CH2Cl2 F. AcOEt F. MeOH
MCF-7 66 81 97 32
Colo 206 77 82 97 69
CSC 1595 64 43 38 7
En el estudio se encontr que las fracciones actuaron mejor sobre las lneas
celulares de cncer de seno 1595 y MCF-7 en las que se encontraron porcentajes
de viabilidad de 20 a 48%. Segn tabla 4.
Tabla 4. Porcentaje de viabilidad de las clulas para las fracciones 1 10 del
extracto EtOH. Concentraciones a 100 g/ml.
F.1 F.2 F.3 F.4 F.5 F.6 F.7 F.8 F.9 F.10
MCF-7 93 43 27 44 72 44 29 50 20 55
Colo 205 108 103 162 41 41 115 127 157 152 148
CSC 1595 130 39 23 48 58 57 35 38 42 104

Figuras 1, 2 y muestran las fracciones tanto del extracto petrol como del EtOH
que tuvieron un porcentaje de viabilidad menor al 50%. Las dos lneas celulares
de cncer de seno presentaron un mayor nmero de fracciones con viabilidad
inferior al 50%. En la lnea celular colo 205 las fracciones 4 y 5 presentaron
viabilidad de 41%.
FRACCIONES CON EFECTO CITOTOXICO < A 50% EN LA

LNEA CELULAR 1595
50
VIABILIDAD
40
30
%
20
10
0 F. MeOH F.2 F.3 F.4 F,7 F.8 F.9
FRACCIONES
Figura 1. Fracciones petrol y EtOH con porcentaje de viabilidad menor al 50% en
la lnea celular 1595
FRACCIONES CON EFECTO CITOTOXICO < AL 50% EN LA

LNEA CELULAR MCF-7
60
VIABILIDA
40
%
20
0 F. MeOH F.2 F.3 F.4 F.6 F,7 F.9
FRACCIONES
Figura 2. Fracciones petrol y EtOH con porcentaje de viabilidad menor al 50%
sobre la lnea celular MCF-7.
Para las subfracciones de la fraccin MeOH del extracto en Petrol, las pruebas
fitoqumicas determinaron la presencia de esteroides y/o triterpenos. Las
subfracciones Sf1, Sf2 y Sf3 obtenidas a partir de la fraccin MeOH del extracto
Petrol se probaron a la concentracin de 50 g/ml. La subfraccin Sf1 mostr

un porcentaje de viabilidad del 100%; La subfraccin Sf2 present un porcentaje
de viabilidad de 72% y Sf3 83% de viabilidad para la lnea celular de cncer de
seno CSC 1595 como se muestra en la Tabla 5 y figura 3.
fraccin MeOH del extracto Petrol concentraciones 50 g/ml
% viabilidad
Sf1 Sf2 Sf3
CSC 1595 100 72 83
EFECTO CITOTOXICO DE SUBFRACCIONES DE LA

FRACCIN MeOH DEL EXTRACTO PETROL EN LA LNEA
CELULAR 1595
100
VIABILIDAD
50
%
0
Alcaloide subfr.1 subfr. 2 Subfr.3
SUBFRACCIONES
Figura 3. Efecto citotxico de subfracciones de la fraccin MeOH del extracto
petrol sobre lnea celular 1595.
Para probar si las subfracciones actuaban de forma sinrgica o antagnica se
hicieron mezclas de las subfracciones, se probaron a una concentracin de 50
g/ml, las subfracciones 1 y 2 fueron las que presentaron un porcentaje de
viabilidad ms bajo 68% como se muestra en la tabla 6.
Tabla 6. Porcentaje de viabilidad de la mezcla de las subfracciones de la fraccin
MeOH del extracto Petrol concentraciones 50 g/ml.

% viabilidad
Sf1+ Sf2+Sf3 Sf1+ Sf2 Sf2+Sf3 Sf1+Sf3
Concentracin 16.6 Concentracin Concentracin 25 Concentracin 25
g/ml 16.6 g/ml g/ml g/ml
CSC 1595 71 68 92 84
Las pruebas fitoqumicas determinaron la presencia de esteroides y/o triterpenos
en las subfracciones de la fraccin 3 del extracto EtOH. Las subfracciones S3.1
y S3.2 de la fraccin 3 del extracto EtOH se probaron a la concentracin de 50
g/ml. La subfraccin S3.1 tuvo un porcentaje de viabilidad del 60% y la
subfraccin S3.2 mostr un porcentaje de viabilidad de 61% en la lnea celular
CSC 1595
fraccin 3 del extracto EtOH. Concentraciones 50 g/ml.
Sf1 Sf2
CSC 1595 60 61
EFECTO CITOTOXICO DE LAS SUBFRACCIONES DE

LA FRACCIN 3 DEL EXTRACTO EtOH DEL
EXTRACTO EN LA LNEA CELULAR 1595
62
VIAB
ILID
AD
%
60
s ubf r . 1 Subf r . 2
SUBFRACCIONES
Figura 4. Efecto citotxico de subfracciones de EtOH en lnea celular 1595
DISCUSIN
Los extractos se probaron a una concentracin de 300 g/ml mostrando los
siguientes efectos citotxicos, la lnea tumoral CSC 1595 fue la ms sensible a los
extractos totales petrol y etanlico, con un efecto citotxico del 50% (% de
viabilidad 50%).
En la evaluacin de las fracciones petrol, CH2Cl2, AcOEt y MeOH valoradas a
100 g/mL, se demostr que la ms activa fue la fraccin MeOH con porcentajes
de viabilidad de 32% y 7% en las lneas tumorales de seno MCF-7 y CSC 1595
respectivamente.
La lnea celular obtenida de tumor de paciente colombiano CSC 1595 fue la ms
sensible al efecto de las fracciones CH2Cl2, AcOEt y MeOH con porcentajes de
viabilidad del 43%, 38% y 7% respectivamente, este resultado es interesante si
se tiene en cuenta que esta lnea se considera joven, conservando un buen grado
de similitud entre el tejido tumoral y la lnea celular, opuesto a lo que sucede con
la lneas celulares comerciales como lo menciona Tllez et al (2004). Las
fracciones no fueron activas para la lnea celular de coln Colo 205. Estos
resultados demuestran cierta selectividad de accin frente a las lneas tumorales de
diversa procedencia y origen.
El comportamiento de las fracciones del extracto de EtOH tambin fue similar
para las lneas 1595 y MCF-7. Las fracciones 2, 3, 4, 7, 8 y 9 del extracto EtOH
presentaron porcentajes de viabilidad entre 23 y 50% para las lneas celulares
CSC 1595 y MCF-7, la fraccin 6 tuvo una viabilidad 44% solo para la lnea
celular MCF-7, la lnea celular Colo 205 tuvo un comportamiento diferente al de
las otras dos lneas, siendo las fracciones 4 y 5 las ms activas con un porcentaje
de viabilidad de 41%, opuesto a lo que mostr la viabilidad para el resto de
fracciones y extractos de petrol y EtOH que tuvieron un efecto proliferativo con
porcentajes de viabilidad entre 79 y 162% en esta lnea celular.
Las pruebas fitoqumicas cualitativas muestran que las fracciones del extracto
EtOH y del extracto petrol contienen esteroides y/o triterpenos y saponinas
triterpnicas Tablas 1 y 2, concuerda con la qumica reportada en la literatura
para las especies de Isertia, Arriaga et al (1990), Rumbero et al (1990), Bruix et
al (1993); Um et al (2001).
Los resultados del porcentaje de citotoxicidad para la fraccin MeOH a unas
concentraciones de 100 y 50 g/ml fue de (93% y 35% de efecto citotxico)
respectivamente lo que indica que la CC50 se debe encontrar entre los 50 y 100
g/ml; al subfraccionar la fraccin MeOH que fue la que present el porcentaje
de viabilidad inferior al 7% se quiso determinar el posible efecto sinrgico o
antagnico entre las sustancias que presentaba esta fraccin, se obtuvieron tres
fracciones y la fraccin que present un mayor porcentaje de citotoxicidad fue la
Sf2 (28%), las subfracciones no actuaron de manera similar como la fraccin
MeOH, por eso se hicieron mezclas de las subfracciones para observar cual
presentaba un efecto citotxico moderado, se observ que las mezclas donde se
encontraba la subfraccin 2 presentaron una mejor actividad citotxica explicando

as que las subfracciones 2 y 1 se relacionan de forma sinrgica y la subfraccin 3
presenta un efecto antagnico con respecto a las otras subfracciones.
Segn las cromatografas y las pruebas fitoqumicas cualitativas, los metabolitos
secundarios esteroides y/o triterpenos posiblemente sean los que estn actuando
favorablemente en la actividad citotxica de las fracciones que presentaron un
porcentaje de viabilidad menor o igual al 50%. A los triterpenos y saponinas
triterpnicas se les ha comprobado propiedades farmacolgicas importantes, entre
ellas una buena actividad citotxica en varias lneas celulares derivadas de
tumores humanos, como lo referencia Sparg et al (2004) para varias familias
botnicas y Cheng et al (2002) y Setter et al (2003) para especies de la familia
rubiaceae.
Uno de los gneros ms estudiado ha sido el gnero Uncaria, en la especie U.
rhynchophylla se encontraron varios esteres triterpenos tetracclicos y cidos
uncarnicos, los cuales inhibieron el crecimiento de las lneas celulares de cncer
A-549, HCT-15, MCF-7 y HT-1197. Heitzman et al (2005).
En el trabajo de Cheng et al (2002) sobre Mitragyna inermes se report una 27-
nor-triterpenoide aglycona que haba sido aislada solo de Isertia haenkeana y
Adina rubella. El extracto MeOH fue el que mostr ser citotxico contra un
panel de lneas celulares de cncer humanos, utilizaron como eluyentes de la
columna de slica gel CH2Cl2, AcOEt y MeOH, obteniendo tres fracciones. La
fraccin I present la inhibicin del crecimiento de ms del 50% en la lnea

celular Bel-7402, esta fraccin fue sometida a purificacin sobre columna de
Sephadex LH-20 y se aisl el componente citotxico (un cido quinvico).
Tanto el gnero Uncaria como el gnero Isertia pertenecen a la subfamilia
Cinchonoideae compartiendo caracteres morfolgicos, pero sera preciso acudir a
caracteres quimiotaxonmicos que fortalecieran an ms los aspectos
filogenticos dentro de la subfamilia.
El anlisis estadstico entre los valores de controles y ensayos fueron
interpretados mediante la prueba t (Student), con un nivel de significancia de
(p<0.05). Los valores de t calculados mostraron ser inferiores a los valores de t
de la tabla, s hay diferencias significativas entre los tratamientos y el control, el
efecto citotxico de los extractos y fracciones fue producto de las concentraciones
que fueron probadas y no causado por otros agentes.
LITERATURA CITADA.
-Aquino, R., De Tomis, N., De Simona, F & Pizza, C. 1997. Triterpenes and
quinovic acid glycosides from Uncaria tomentosa. Phytochemistry 45: 1035-
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-Arriaga, F, J., Rumbero-Sanchez, A & Vazquez, P. 1990. Two triterpene
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-Bohrmann, H., Lau-Cam, C., Tashiro, J & Youngken Jr. 1969. Constituens of
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dihydroquinamine from the leaf material. Phytochemistry. 8: 649-652.

-Bruix, M., Rumbero, A & Vazquez, P. 1993. Apodihydrocinchonamine, an
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-Cheng, Z-H., Yu, B-Y. & Yang, X-W. 2002. 27-nor-triterpenoid glycosides from
Mitragyna inermis. Phytochemistry 61: 379-382.
-Garca Barriga, H. 1992. Flora Medicinal de Colombia. Tomos I, II y II. Tercer
Mundo Editores. Bogot.
-Mosmann, T. 1983. Rapid colorimetric assays for cellular growth and survival:
application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of immunological
Methods. 65: 55-63.
-Rumbero-Snchez, A & Vazquez, P. 1991. A nor-triterpene glycoside from

13
Isertia haenkeana and a CNMR study of cincholic acid. Phytochemistry. 30:
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-Setzer, M., Moriarity, D., Lawton, R., Setzer, N., Gentry, G. & Haber, W.
2003. Phytomedicinal potencial of tropical cloudforest plants from Monteverde,
Costa Rica. Revista de Biologa Tropical 51: 647-674.
-Sparg, S.G., Light, J & Staden J.van. 2004. Biological activities and distribution
of plant saponins. Journal of Ethnopharmacology. 94: 219-243.
-Um, B. H., Weniger, B., Lobstein, A., Pouplin, T., Polat, M & Aragon, R. 2001.
Triterpenoid saponins from Isertia pittieri. Journal of Natural Products. 12: 1588-
1589.

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EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD CITOTXICA DE EXTRACTOS Y

FRACCIONES DE Isertia laevis EMPLEANDO LNEAS CELULARES

DERIVADAS DE TUMORES HUMANOS.

SANDRA LILIANA CASTRO DIAZ.

Presentado como requisito parcial

Para optar al ttulo de

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

Artculo 23 de la resolucin No 13 de Julio de 1946

La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus

Yo (nosotros) Alba Nohem Tllez Alfonso y Sandra Liliana Castro Diaz,

a) Reproducir el trabajo en medio digital o electrnico con el fin de ofrecerlo

Alba Nohem Tllez Alfonso.

Sandra Liliana Castro Diaz.

FRACCIONES DE Isertia laevis EMPLEANDO LNEAS CELULARES

DERIVADAS DE TUMORES HUMANOS.

SANDRA LILIANA CASTRO DIAZ.

FRACCIONES DE Isertia laevis EMPLEANDO LNEAS CELULARES

DERIVADAS DE TUMORES HUMANOS.

SANDRA LILIANA CASTRO DIAZ.

TRABAJO PARA OPTAR EL TTULO DE: Biloga.

TTULO COMPLETO DEL TRABAJO: Evaluacin de la Actividad Citotxica

FACULTAD: Ciencias Bsicas.

NOMBRE DEL PROGRAMA: Biologa.

CIUDAD: BOGOT. AO DE PRESENTACIN DEL TRABAJO: 2006.

DESCRIPTORES O PALABRAS CLAVES:

RESUMEN DEL CONTENIDO:

A mis hermanos por su apoyo en todo momento.

direccin del trabajo.

A la Dra. Clemencia de Castro y Tulia de Murcia por proporcionarme las lneas

celulares y por su preciada colaboracin en todo el desarrollo del trabajo.

A los profesores del Laboratorio de Fitoqumica de la Universidad Javeriana por

Al Laboratorio de Virologa e Inmunologa de la Universidad Javeriana por

permitir usar sus instalaciones en el desarrollo del proyecto.

A Andrea y ngela por su ayuda.

2.1 LAS PLANTAS, FUENTE DE NUEVAS SUSTANCIAS 4

2.2 FAMILIA RUBIACEAE 6

2.3 CONCEPTOS GENERALES DEL GNERO ISERTIA. 7

2.3.1 ISERTIA LAEVIS 8

2.3.2 FITOQUMICA DEL GNERO ISERTIA 10

2.4 PLANTAS MEDICINALES CON TRITERPENOS, SAPONINAS

TRITERPNICAS Y SU ACTIVIDAD CITOTXICA Y ANTITUMOR 13

2.4.1 ACCIN CITOTXICA DE ESPECIES DE LA FAMILIA

2.5 CULTIVO CELULAR 18

2.5.1 LNEAS CELULARES 19

2.6 ENSAYOS DE CITOTOXICIDAD IN VITRO 20

2.6.1 MTODO DEL MTT 22

2.7 EL CNCER, ENTRE LAS PRINCIPALES CAUSAS DE

3. FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN 25

3.1 FORMULACIN DE PROBLEMA 25

3.2 PREGUNTA DE INVESTIGACIN 25

4.2 OBJETIVOS ESPECFICOS 27

6.2 DISCUSIN DE RESULTADOS 45

TABLA No 1. METABOLITOS SECUNDARIOS AISLADOS DE ESPECIES

TABLA NO 2. PLANTAS MEDICINALES CON SAPONINAS

TABLA 3. PRUEBAS FITOQUMICAS DE LAS FRACCIONES DEL

TABLA 4. PRUEBAS FITOQUMICAS DE LAS FRACCIONES DEL

TABLA 5. PORCENTAJE DE VIABILIDAD DE LAS CLULAS PARA LOS

TABLA 6. PORCENTAJE DE VIABILIDAD DE LAS CLULAS PARA LAS

TABLA 7. PORCENTAJE DE VIABILIDAD DE LAS CLULAS PARA LAS

TABLA 8. PRUEBAS FITOQUMICAS DE LAS SUBFRACCIONES DE LA

TABLA 10. PORCENTAJE DE VIABILIDAD DE LAS CLULAS PARA LAS

TABLA 11. PRUEBAS FITOQUMICAS DE LA FRACCIN 3 DEL

TABLA 12. PORCENTAJE DE VIABILIDAD DE LAS CLULAS PARA LAS