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Rev Colomb Cancerol.

2016;20(4):150---158

www.elsevier.es/cancerologia

ORIGINAL

Anlisis de metilacin en los genes supresores de


tumores CDKN2B y DBC1 en pacientes colombianos
con diagnstico de leucemia
Laura Mara Medina Gmez, Gonzalo Vsquez Palacio y Carlos Mario Munetn Pena

Unidad de Gentica Mdica, Departamento de Pediatra, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia, Medelln, Colombia

Recibido el 1 de junio de 2016; aceptado el 16 de septiembre de 2016


Disponible en Internet el 28 de noviembre de 2016

PALABRAS CLAVE Resumen


Metilacin del ADN; Objetivo: Analizar la metilacin en los promotores de los genes CDKN2B y DBC1 en muestras
Leucemias; de pacientes con leucemia linfoblstica aguda (LLA), leucemia mieloblstica aguda (LMA) y
LLA; leucemia mieloide crnica (LMC). Adems, correlacionar el perl de metilacin de los pacientes
LMA; con los hallazgos citogenticos.
LMC; Materiales y mtodos: Se evaluaron 56 pacientes con leucemias: 24 con LLA, 16 con LMA y 16
Epigentica; con LMC. El ADN extrado se modic con bisulto de sodio. Se realiz un anlisis de metilacin
Genes supresores en los genes CDKN2B y DBC1 mediante la PCR especca de metilacin (MS-PCR). Las muestras
de tumores positivas por la tcnica MS-PCR fueron secuenciadas.
Resultados: Se encontr una frecuencia total de metilacin del 87,5%. El gen CDKN2B se encon-
tr metilado en el 75% de LLA y de LMC, y del 62% en LMA. El gen DBC1 se encontr metilado en
el 96% de LLA, el 94% de LMA y del 68,8% en LMC. El gen ms frecuentemente metilado en todas
las muestras fue DBC1. De los tres tipos de leucemias, la LLA fue la que present los mayores
porcentajes de metilacin. El 62,5% de la muestras tenan metilado ambos genes. Las muestras
con cariotipo normal presentaron una alta frecuencia de metilacin de CDKN2B y DBC1.
Conclusiones: En este estudio se demostr, por primera vez en pacientes colombianos con
leucemias, que la metilacin de los genes CDKN2B y DBC1 es un evento frecuente. Los hallazgos
indican que la metilacin de genes supresores de tumores es una va molecular alterna que
podra estar relacionada con el desarrollo de neoplasias hematolgicas.
2016 Instituto Nacional de Cancerologa. Publicado por Elsevier Espana, S.L.U. Todos los
derechos reservados.

Autor para correspondencia.


Correo electrnico: carlos.muneton@udea.edu.co (C.M. Munetn Pena).
http://dx.doi.org/10.1016/j.rccan.2016.09.002
0123-9015/ 2016 Instituto Nacional de Cancerologa. Publicado por Elsevier Espana, S.L.U. Todos los derechos reservados.
Anlisis de metilacin en los genes supresores de tumores CDKN2B y DBC1 en pacientes 151

KEYWORDS Methylation analysis of the CDKN2B and DBC1 tumour suppressor genes in leukaemia
DNA methylation; patients in Colombia
Leukaemia;
Abstract
ALL;
Objective: To perform a methylation analysis in the CDKN2B and DBC1 gene promoters in
AML;
samples from Colombian patients with acute lymphoblastic leukaemia (ALL), acute myeloid leu-
CML;
kaemia (AML), and chronic myeloid leukaemia (CML), and to correlate the methylation prole
Epigenetics;
with cytogenetic ndings.
Tumour suppressor
Material and methods: The study included a total of 56 bone marrow samples, 24 from patients
genes
with ALL, 16 from AML patients, and 16 from CML patients. DNA was extracted from these
samples and converted with sodium bisulphite. Methylation analysis was performed using methy-
lation specic PCR (MS-PCR). The samples that were positive for MS-PCR were sequenced to
conrm the results.
Results: A total methylation frequency of 87.5% was found. CDKN2B gene promoter hypermethy-
lation was found in 75% of ALL and CML samples, and 62% in AML; while DBC1 gene promoter
hypermethylation was found in 96% of the samples of ALL, 94% of AML, and in 68.8% of CML.
The most frequently methylated gene in all samples was DBC1. ALL was the type of leukaemia
that had the highest percentages of methylation. Almost two-thirds (62.5%) of the samples had
both methylated genes. Samples with normal karyotype had a high frequency of methylation in
CDKN2B and DBC1 genes.
Conclusions: This study showed, for the rst time in Colombian patients with leukaemia, that
methylation of DBC1 and CDKN2B genes is a common event. Our ndings indicate that methy-
lation of tumour suppressor genes is an alternate genetic pathway related to the development
of haematological malignancies.
2016 Instituto Nacional de Cancerologa. Published by Elsevier Espana, S.L.U. All rights reser-
ved.

Introduccin supresores tumorales (GST), que se asocia con la inactiva-


cin gnica que ocurre por inhibicin de la transcripcin6 .
Las leucemias son enfermedades malignas que se caracteri- La metilacin del ADN es un fenmeno frecuente en
zan por la expansin clonal de las clulas hematopoyticas, leucemias y tumores slidos. Se presenta principalmente
las cuales presentan ventajas en la proliferacin, el desarro- en las islas CpG localizadas en la regin promotora de los
llo y la progresin de las leucemias son procesos complejos genes, por una modicacin covalente que resulta de la
(1). Los subtipos de leucemias ms comunes, de acuerdo con actividad de una familia de enzimas denominada ADN metil-
los tipos de clulas afectadas y a la progresin de la enferme- transferasas (DNMT) que catalizan la transferencia de un
dad, son: la leucemia linfoblstica aguda (LLA), la leucemia grupo metilo desde la S-adenosil metionina hacia el car-
linfoctica crnica (LLC), la leucemia mieloide aguda (LMA) bono 5 de los residuos de citosinas en los dinucletidos
y la leucemia mieloide crnica (LMC)1 . CpG de genes relacionados con: el control del ciclo celu-
Tanto factores genticos como epigenticos se asocian lar, la reparacin del ADN, la apoptosis, la angiognesis y la
con la patognesis de las leucemias y se reconoce que la metstasis5---8 . La hipermetilacin desregula la expresin de
adquisicin de alteraciones genticas en las diferentes fases diversos genes que intervienen en mltiples vas de trans-
tiene una gran importancia en el desarrollo de las neo- duccin celular lo que contribuye a la carcinognesis y a
plasias hematolgicas2,3 . Estas alteraciones comprenden: la inestabilidad cromosmica en las clulas progenitoras de
mutaciones puntuales; amplicaciones gnicas; y anomalas leucemias7 .
cromosmicas estructurales como deleciones, inversiones, En general, la va epigentica puede afectar diferentes
traslocaciones y aneuploidas, que pueden ocasionar la mecanismos moleculares involucrados en la diferenciacin,
inactivacin o la activacin de diversos genes; dichas altera- la apoptosis, la inmortalizacin y la transformacin celular.
ciones afectan la supervivencia y la apoptosis de las clulas Estudios en leucemia informan diversos GST hipermeti-
progenitoras4 . lados que se asocian con la transformacin, el desarrollo
De otro lado, los cambios epigenticos consisten en modi- y la progresin de esta enfermedad. Entre los GST ms
caciones reversibles que afectan la expresin de diversos frecuentemente hipermetilados estn: CDKN2B, CDKN1B,
genes sin alterar la secuencia del ADN y que puede deberse DBC1, RB1, entre otros9---11 . Especcamente, la hipermetila-
a tres fenmenos diferentes: metilacin en el ADN, modi- cin del gen CDKN2B/p15 es el ms comnmente estudiado
caciones en las histonas y en los ARN no codicantes en neoplasias hematolgicas; en sndromes mielodisplsicos
(ncRNA)5 . El cambio epigentico ms ampliamente estu- se ha encontrado hipermetilado este gen en el 50% de los
diado es la hipermetilacin de los promotores de genes casos.
152 L.M. Medina Gmez et al.

Adems, se reporta que la metilacin se adquiere Extraccin de ADN


durante la progresin de la enfermedad y se asocia con
la transformacin hacia leucemia aguda, la cual es de mal La extraccin del ADN genmico se realiz a partir del aspi-
pronstico10,12,13 . Por otro lado, la hipermetilacin del gen rado de medula sea o de sangre perifrica de los pacientes
DBC1, en pacientes con LMA y con cariotipo normal, se pro- y de los individuos sanos, utilizando el kit comercial QIAamp
pone como un biomarcador predictivo de la supervivencia DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) y siguiendo las reco-
libre de enfermedad y la sobrevida global10 . La hipermetila- mendaciones de la casa comercial.
cin de este gen tambin se informa en pacientes con LMC11 . El ADN de cada muestra se cuantic en un espec-
Adems, se ha encontrado que la inactivacin de DBC1 con- trofotmetro NanoDrop 2000c Spectrophotometer (Thermo
duce a la desregulacin del ciclo celular y a la apoptosis Scientic, USA). La calidad y la integridad del ADN se veric
independiente de las caspasas11,14 . en geles de agarosa al 2% tenidos con bromuro de Etidio. Las
Por otra parte, la mayora de los estudios de metila- bandas se visualizaron con luz UV en un fotodocumentador
cin en leucemia analizan pocos GST, sin embargo, en los de geles. El DNA extrado se almacen a -20 C.
ltimos anos, con la introduccin de nuevas plataformas tec-
nolgicas, los estudios en leucemia se han interesado en la
Conversin del ADN con bisulto de sodio
caracterizacin epigenmica empleando tcnicas novedosas
como la de los microarrays con la que es posible evaluar
El DNA extrado se modic con bisulto de sodio, usando
el perl de metilacin de muchos genes, entre los que se
el kit comercial EpiTect Bisulte Kits (Qiagen, Hilden, Ger-
incluyen genes relacionados con la iniciacin y la progre-
many), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
sin de la enfermedad, y tambin establecer una mejor
El ADN modicado se resuspendi en agua y se almacen
clasicacin molecular de los pacientes con malignidades
a---20 C hasta su uso. El tratamiento con bisulto de sodio
hematolgicas10,15---17 .
modic las citosinas no metiladas y que son convertidas
Los estudios de epigentica en neoplasias hematolgi-
en uracilos, mientras que las citocinas metiladas no fueron
cas tienen un gran inters porque la hipermetilacin de
modicadas.
GST podra utilizarse como biomarcadores para el prons-
tico de la enfermedad y la prediccin a la respuestas de
ciertos frmacos18 , dado que las modicaciones epigenti- Amplicacin de ADN por PCR especca
cas son potencialmente reversibles y podran convertirse en de metilacin (MS-PCR)
blancos moleculares para el desarrollo de nuevos agentes
demetilantes para el tratamiento de pacientes con dife- La tcnica de MS-PCR se utiliz para determinar la meti-
rentes neoplasias; de esta manera, estos frmacos podran lacin en los promotores de los genes CDKN2B y DBC1. El
revertir la represin gnica de los GST18,19 . Sin embargo, el ADN modicado con bisulto de sodio se amplic por PCR
impacto del perl de genes hipermetilados con el pronstico en un termociclador Gene Amp PCR System 9700 (Applied
en las malignidades hematolgicas an no est bien denido. Biosystems, USA). La MS-PCR para los dos genes se realiz
El objetivo de este estudio es analizar la metilacin en en un volumen total de 25 l que contena 200 ng de ADN
los promotores de los genes DBC1 y CDKN2B en muestras de modicado. Las secuencias de los cebadores utilizados para
pacientes colombianos con diagnstico de LLA, LMA y LMC la amplicacin de los promotores de cada gen y las con-
y correlacionar el perl de metilacin de los pacientes con diciones de la MS-PCR se realizaron siguiendo protocolos
los hallazgos citogenticos. previamente descritos10 ; para cada gen se utiliz un par de
cebadores que reconocen en el promotor regiones metila-
das y otro par para regiones no metiladas. En la MS-PCR
Mtodos
se utiliz como control negativo DNA a partir de linfoci-
tos de individuos sanos y como control positivo se utiliz
Pacientes y muestras un DNA genmico universalmente metilado in vitro con la
enzima ADN metil transferasa (New England, Biolabs). Los
Se realiz un estudio descriptivo de tipo prospectivo. La productos amplicados por la MS-PCR se corrieron en una
poblacin de estudio estuvo constituida por 56 pacientes con electroforesis en geles de agarosa al 2%, tenidos con bro-
diagnstico clnico y hematolgico de leucemia: 16 con LMA, muro de Etidio. Las bandas se visualizaron directamente en
16 con LMC y 24 con LLA. De los cuales, 49 pacientes tenan un fotodocumentador de geles.
diagnsticos de novo, 4 presentaban recadas y 3 estaban
en tratamiento; 25 de los pacientes eran mujeres y 31 eran
hombres. Secuenciamiento
Las muestras de medula sea o de sangre perifrica de
los pacientes fueron obtenidas por los hematlogos en dife- Los productos amplicados se puricaron con el Kit Wizard
rentes instituciones de salud y remitidas al laboratorio de DNA purication (Promega) y secuenciaron directamente por
Gentica Mdica de la Facultad de Medicina de la Univer- ambas cadenas en un analizador gentico automtico 3730xl
sidad de Antioquia, durante 2011 y 2012. Los pacientes DNA Analyzer (Applied Biosystems).
rmaron el consentimiento aprobado por el Comit de Bio-
tica, Sede de Investigacin Universitaria de la Universidad Anlisis de resultados
de Antioquia, de la ciudad de Medelln. Adicionalmente, se
incluyeron 18 muestras de sangre perifrica de individuos Las secuencias obtenidas se editaron y analizaron con
sanos para control. los programas ContigExpress, Vector NTI y AlignX. En el
Anlisis de metilacin en los genes supresores de tumores CDKN2B y DBC1 en pacientes 153

ContigExpress se ensamblaron las secuencias obtenidas Resultados


con los cebadores forward y reverse para formar un
contig de cada muestra. Una vez obtenido el contig, se Se estudi un total de 56 pacientes con diagnstico de leu-
utiliz el programa Vector NTI para realizar la edicin de las cemia: 24 (42,9%) con LLA, 16 (28,6%) con LMA y 16 (28,6%)
secuencias y nalmente, en el programa AlignX, se aline con LMC. Con relacin al gnero, el 55,4% (31/56) de los
la secuencia editada de cada muestra con la secuencia de pacientes eran hombres y el 44,6% (25/56) eran mujeres. La
referencia para cada gen que se encuentran en el Genbank edad promedio para ambos sexos fue de 36 anos.
(National Center for Biotechnology Information). Para el
gen DBC1 se us la secuencia NM 014618 y para CDKN2B la
secuencia NM 078487.2. Metilacin de los genes CDKN2B y DBC1 en
pacientes con leucemias

La determinacin de la metilacin de los promotores de


Anlisis estadstico los genes CDKN2B y DBC1 en los pacientes con leucemia
analizados se realiz mediante las amplicaciones de regio-
Los resultados se analizaron mediante el programa SPSS nes metiladas y no metiladas por la tcnica MS-PCR. En las
versin 19. En la estadstica descriptiva para variables guras 1 y 2 se muestran los resultados del estado de meti-
cuantitativas se utiliz la media y el rango; las variables lacin de estos dos genes en algunas muestras de pacientes
categricas se presentaron en frecuencias y porcentajes. con leucemia.
Los resultados de la MS-PCR se analizaron como una variable La frecuencia total de metilacin en las 56 muestras de
dicotmica, con base en la presencia o la ausencia de meti- leucemias analizadas fue del 87,5% (49/56) y el 12,5% (7/56)
lacin del gen. Los resultados de las muestras de leucemia y de las muestras no present metilacin. Todos los siete casos
de los controles se compararon mediante la prueba exacta de los pacientes que al momento del estudio estaban en
de Fischer. Se utiliz el valor de p bilateral. Se consider recada o tratamiento presentaron metilacin en los genes
signicativo un valor de p< 0,05. evaluados, similar a los resultados obtenidos en los pacien-

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

158pb

Figura 1 Electroforesis en gel de agarosa que muestra el anlisis de metilacin del gen DBC1 por MS-PCR en muestras de pacientes
con leucemias. Se observa las bandas obtenidas con los cebadores especcos que amplican las regiones metiladas del promotor
del gen. Carril 1 marcador de peso molecular de 100pb (GeneRuler 100 bp DNA Ladder, Fermentas). Carril 2 control positivo (ADN
metilado universalmente; Epitec control DNA, QIAGEN). Carriles 3 al 7, 9 y 10 corresponde a pacientes con metilacin del gen DBC1.
Carril 8 paciente que no presenta metilacin y carril 11 control negativo (sin DNA).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

132pb

Figura 2 Electroforesis en gel de agarosa que muestra el anlisis de metilacin del gen CDKN2B por MS-PCR en muestras de
pacientes con leucemias. Se observa las bandas obtenidas con los cebadores especcos que amplican las regiones metiladas
del promotor del gen. Carril 1 marcador de peso molecular de 100pb (GeneRuler 100 bp DNA Ladder, Fermentas). Carril 2 control
negativo (sin DNA). Carril 3 control positivo (ADN metilado universalmente; Epitec control DNA, QIAGEN). Carriles 4 al 10 corresponde
a pacientes con metilacin del gen CDKN2B.
154 L.M. Medina Gmez et al.

100 Metilacin en pacientes con LMC


80
En este grupo se encontr que el 75% (12/16) eran hombres y
CDKN2B NM
Porcentaje, %

60
el 25% (4/16) eran mujeres; la edad promedio fue de 52 anos
CDKN2B M
DBC1 NM (rango 18-79). La frecuencia de metilacin del gen CDKN2B
40 DBC1 M fue del 75% (12/16) y del gen DBC1 fue del 68,8% (11/16)
(g. 3). De otro lado, se encontr que el 31,2% (5/16) de
20 las muestras analizadas presentaron metilacin en el pro-
motor de un solo gen y el 56,3% (9/16) mostr metilacin en
0 ambos genes y no se encontraron diferencias signicativas
A

C
(p = 0,70). Adems, se encontr que el 12,5% (2/16) de las
LL

LM

LM
Tipo de leucemia muestras analizadas no tena metilacin en ninguno de los
dos genes evaluados.
Figura 3 Se presenta los porcentajes de metilacin de los
genes CDKN2B y DBC1 en las muestras de pacientes con dife- Cariotipo de los pacientes con leucemias
rentes tipos de leucemias analizados. LLA: leucemia linfoide
aguda. LMA: leucemia mieloide aguda. LMC: leucemia mieloide
El 48,2% (27/56) de los pacientes tenan cariotipo normal y el
crnica. NM: no metilado, M: metilado.
41,1% (23/56) present cariotipo anormal; en el 10,7% (6/56)
de las muestras no se obtuvo el resultado del cariotipo. En
las muestras de LLA con cariotipo normal se encontr una
tes con diagnstico de novo. La frecuencia de metilacin frecuencia de metilacin de los genes CDKN2B y DBC1 del
del gen CDKN2B fue del 71,4% (40/56) y para el gen DBC1 69% (11/16) y 100% (16/16) respectivamente, y no se encon-
fue del 87,5% (49/56). En general, comparando los resulta- traron diferencias (p = 1,0). En las muestras de LMA fue del
dos de metilacin de los dos genes con todos los casos de 78% (7/9) y 89% (8/9) para CDKN2B y DBC1 respectivamente,
leucemia analizados, se encontr que el gen DBC1 present y no se encontraron diferencias (p = 0,22).
la mayor frecuencia de metilacin con una diferencia esta- En las muestras de LMC con cariotipo normal la metilacin
dsticamente signicativa (p = 0,035). En las muestras de los de estos dos genes fue un evento infrecuente; no obstante,
controles no se detect metilacin en estos dos genes. en este tipo de leucemia se present la mayor frecuencia de
cariotipos anormales, seguido del grupo con LMA. Por ltimo,
en el grupo de pacientes con cariotipo anormal se encontr
que la alteracin cromosmica ms comn fue la de tipo
Metilacin en pacientes con LLA estructural (translocacin).
Para conrmar los resultados de la metilacin obtenidos
En este tipo de leucemia el 37% (9/24) eran hombres y el 63% por la MS-PCR, se secuenciaron 20 muestras de cada gen
(15/24) mujeres; 37% (9/24) eran ninos; la edad promedio seleccionadas al azar. En los cromatogramas analizados de
fue de 25,7 anos (rango 3-84). La frecuencia de metilacin la regin promotora, que contienen las islas de dinucletidos
del gen CDKN2B en estos pacientes fue del 75% (18/24), CpG, se conrm la metilacin de las islas CpG en todos los
mientras que para el gen DBC1 la frecuencia de metilacin casos. Asimismo, mediante el secuenciamiento directo de
fue del 96% (23/24) (g. 3) y solo en una muestra (4%) no las muestras no metiladas se comprob la conversin com-
se detect metilacin. Se encontr que el 29% (7/24) de pleta con bisulto de sodio de las C no metiladas en T en las
las muestras tenan metilacin en el promotor de un solo islas CpG.
gen, mientras que el 71% (17/24) present metilacin en En los anlisis del secuenciamiento de los promotores
los dos genes y no se encontraron diferencias signicativas para determinar la metilacin se encontr un polimorsmo
(p = 0,14). En todas las muestras de los ninos (9/9) se pre- en el gen DBC1, que est reportado en el Genbank con
sent metilacin y con una mayor frecuencia en el gen DBC1 el cdigo rs2065399. Este polimorsmo se identic en las
(6/9). No se encontraron diferencias signicativas entre los muestras de LLA, LMA y LMC.
resultados de metilacin de ninos y adultos (p = 1,0). En resumen, los resultados de este trabajo mostraron una
alta frecuencia de metilacin de los genes CDKN2B y DBC1
en los pacientes con LLA, LMA y LMC estudiados; el gen ms
Metilacin en pacientes con LMA frecuentemente metilado fue el DBC1 (p = 0,035). Adicional-
mente, se encontr que la metilacin de los genes DBC1 y
CDKN2B es ms frecuente en pacientes con LLA y LMA, que
En este grupo el 75% (12/16) eran hombres y el 25% (4/16)
tenan cariotipo normal.
mujeres; el 12,5% (2/16) eran ninos; la edad promedio fue
de 36,5 anos (rango 2-70). La frecuencia de metilacin del
gen CDKN2B fue del 62% (10/16), mientras que la frecuencia Discusin
de metilacin del gen DBC1 fue del 94% (15/16) (g. 3); una
sola muestra (6%) no estaba metilada. El 44% (7/16) de las Este es el primer estudio de anlisis de metilacin en los
muestras analizadas presentaron metilacin en un solo gen promotores de los genes DBC1 y CDKN2B por MS-PCR que se
y el 56% (9/16) tena metilado ambos genes y no se encon- realiza en 56 pacientes con LLA, LMA y LMC en Latinoam-
traron diferencias signicativas (p = 0,08). Los dos casos de rica. En total, se encontr un alto porcentaje de metilacin
ninos estaban metilados. (87,5%) en las muestras analizadas.
Anlisis de metilacin en los genes supresores de tumores CDKN2B y DBC1 en pacientes 155

En este trabajo se demostr una alta frecuencia de meti- este gen y el segundo en informar el estado de metilacin
lacin de los genes DBC1 y CDKN2B en los diferentes tipos del promotor del gen DBC1 en LMA.
de leucemia evaluados. Estos resultados concuerdan con En el trabajo de lvarez et al.10 , en un subgrupo de
los informados por otros estudios, en los que reportan un pacientes con LMA se encontr que tenan cariotipo normal
alto porcentaje de metilacin de estos genes en neoplasias y una asociacin de la hipermetilacin del gen DBC1 con una
hematolgicas11,12,14,15,20,21 . Por lo tanto, el perl de metila- menor tasa de supervivencia libre de la enfermedad compa-
cin de los casos con recada y tratamiento fueron similares a rado con un grupo de pacientes que no tenan metilado este
los obtenidos con los casos de novo y con los resultados obte- gen. A partir de estos hallazgos concluyeron que la hiper-
nidos se conrm que la metilacin de los promotores de los metilacin del gen DBC1, en este grupo de pacientes, podra
genes DBC1 y CDKN2B es un evento comn en la patognesis considerarse como un marcador pronstico de gran utilidad
de la LLA, la LMA y la LMC. clnica para esta enfermedad.
En las muestras de LLA se encontr que la metilacin En el estudio realizado se encontr en el grupo de pacien-
de los genes DBC1 y CDKN2B fue muy frecuente, con tes con LMA y cariotipo normal una alta frecuencia de
mayor predominio en el primer gen y no se encontraron metilacin similar a la reportada por lvarez et al10 , pero
diferencias signicativas. Estos resultados son consistentes no se encontraron diferencias estadsticas signicativas para
con los reportados por Grnbk et al., quienes obtuvieron esta asociacin, posiblemente debido al tamano de la mues-
una frecuencia de metilacin del 100% en el gen DBC114 . tra. Debe tenerse en cuenta que en este, adems, de ser el
Por el contrario, en otro estudio que incluy 170 muestras primero en Colombia, no fue posible establecer la sobre-
de pacientes con LLA11 , se encontr una baja frecuencia de vida de la enfermedad en los pacientes evaluados por lo
metilacin para este gen comparada con la reportada en que se requiere de futuros estudios que validen los hallazgos
este estudio. No obstante, en este mismo trabajo, se encon- presentados.
tr una alta frecuencia de metilacin de DBC1 en 4 lneas A diferencia de la poca informacin que existe de la meti-
celulares de LLA, similar a lo informado en este trabajo. Las lacin de DBC1 en LMA, para el gen CDKN2B se tiene ms
diferencias encontradas en los anteriores resultados podran conocimientos de la metilacin en este tipo de leucemia.
explicarse por el tamano de la muestra, el cual fue menor Las frecuencias de metilacin informadas por varios estudios
al usado y a diferencias poblacionales en las frecuencias para CDKN2B estn en el rango de 40 al 93%10,20,28---30 . En este
reportadas para este gen. De otro lado, se informa que la estudio se encontr una frecuencia del 62%, este resultado
hipermetilacin del gen DBC1 (The Deleted in Bladder Can- concuerda con el rango informado. No obstante, la frecuen-
cer 1 gene), localizado en la regin cromosmica 9q33.1, cia reportada en este trabajo es mayor a la informada en
es muy frecuente en cncer de vejiga, pulmn y cavidad otros estudios en los que analizaron un mayor nmero de
oral22---24 . La hipermetilacin no permite la expresin de muestras10,29,30 ; tampoco no se encontr asociacin estads-
este gen en las clulas tumorales, por lo que se sugiere ticamente signicativa en los pacientes con LMA respecto al
que la metilacin de DBC1 tiene una gran importancia en el estado de metilacin del gen CDKN2B.
desarrollo de LLA, de algunos tumores slidos10,11,22,23 y se Cabe mencionar que en la poblacin latinoamericana solo
asocia con un mal pronstico de la enfermedad25 . se han realizado dos trabajos de metilacin en LMA. Los
De otro lado, estudios realizados en metilacin del gen resultados presentados concuerdan con los reportados por
CDKN2B en muestras de LLA informan un rango de frecuen- Santos et al. en Brasil30 , pero dieren de los de Reyes et al.10
cia de metilacin del 34% hasta el 100%21,26,27 . La frecuencia en Chile, quienes informaron una frecuencia de metilacin
obtenida en este trabajo est dentro de este rango y con- para CDKN2B tres veces menor a la reportada en este estu-
cuerda con lo informado en la literatura. Dado que los dio con pacientes colombianos. De los anteriores resultados
anteriores resultados se han obtenido de pacientes con LLA se podra concluir que se presenta una variacin geogrca
de diferentes poblaciones, se sugiere que las diferencias en la frecuencia de metilacin de CDKN2B en pacientes con
en la frecuencia de metilacin del gen CDKN2B reportadas LMA.
podran deberse, adems del tamano de la muestra, a varia- En resumen, los diferentes estudios de metilacin en
ciones geogrcas. El gen CDKN2B es uno de los genes ms este tipo de leucemia concluyen que el gen CDKN2B en la
ampliamente estudiados en los mecanismos epigenticos en mayora de los pacientes con LMA se encuentra hiperme-
neoplasias hematolgicas y es el que se ha encontrado ms tilado y que este mecanismo epigentico se podra asociar
frecuentemente hipermetilado12,20,27 . como un mayor riesgo para el desarrollo de este tipo de
En el estudio efectuado se encontr un alto porcentaje leucemia10,30 ; para corroborar la anterior asociacin en los
de metilacin en el promotor del gen CDKN2B en pacientes pacientes colombianos con LMA es necesario realizar ms
colombianos con la LLA, por lo que estos hallazgos sugieren estudios que incluyan un mayor nmero de pacientes y en
que este gen podra estar involucrado en la patognesis de los que se determine la tasa de sobrevida de los pacientes.
la LLA. En cuanto a los hallazgos de metilacin en las muestras
En cuanto a los resultados de metilacin en las muestras de LMC, en este trabajo, se demostr nuevamente una alta
de LMA, se encontr, similar a lo obtenido en la LLA, una frecuencia de metilacin en los dos genes estudiados, similar
alta frecuencia de metilacin del 94% en DBC1, mayor al 52% a lo observado en LLA y LMA. En la literatura existen pocos
informado por lvarez et al., en 244 muestras analizadas10 . estudios sobre la metilacin en pacientes con LMC, lo cual
Hasta la fecha, el estudio de estos autores es el nico que podra explicarse en parte porque la translocacin t (9;22),
se encuentra en la literatura sobre metilacin del gen DBC1 que corresponde a la alteracin cromosmica recurrente
en pacientes con LMA; lo que indica que nuestro trabajo es el que se presenta en estos pacientes y se relaciona direc-
primero en reportar el mayor porcentaje de metilacin para tamente con el origen de la LMC2,32 . La deteccin de este
156 L.M. Medina Gmez et al.

marcador cromosmico usualmente se realiza por mtodos resultado del presente estudio que mostr una diferencia
de citogentica convencional, FISH o qPCR2,18 . Con respecto estadsticamente signicativa (p = 0,035). Este hallazgo es
a la metilacin del gen DBC1 en LMC, solo se encuentra publi- importante porque permitira en futuros estudios proponer
cado un estudio con cinco pacientes, que reporta metilacin al gen DBC1 como un biomarcador epigentico dentro de la
en todos los casos15 . Este resultado concuerda con el obte- patogensis de las leucemias en pacientes colombianos y su
nido en el estudio presentado y que incluy un mayor nmero relacin con el pronstico de la enfermedad. Por otra parte,
de muestras; es el segundo estudio en informar que en tambin se ha informado que la inestabilidad cromosmica
pacientes con LMC se presenta un porcentaje alto de meti- y las modicaciones epigenticas presentan una correlacin
lacin DBC1. De estos hallazgos podra sugerirse que este negativa40 , tal como se observ en este estudio con el grupo
mecanismo epigentico ocurre de forma independiente al de pacientes con LMC. De estos hallazgos se resalta la impor-
de la alteracin cromsomica t (9;22) y que tambin podra tancia de estudiar el efecto de la metilacin en malignidades
estar relacionado con el desarrollo de la LMC. Sin embargo, hematolgicas como una va diferente relacionada con el
se requiere de ms estudios para validar estos resultados. desarrollo de estas enfermedades, especialmente en los
Contrario a lo informado para el gen DBC1 en LMC, varios casos que presentan cariotipo normal porque sera muy til
estudios reportan bajas frecuencias de metilacin del gen para el diagnstico y el pronstico de las enfermedades17,41 .
CDKN2B, desde 0 al 24%15,33---36 . Estos resultados no concuer- La metilacin de novo de las islas CpG localizadas en los
dan con lo observado en el presente trabajo, en el que se promotores de los genes DBC1 y CDKN2B es un mecanismo
obtuvo una alta frecuencia de metilacin para este gen. epigentico frecuente que ocurre en neoplasias hematol-
A diferencia de lo que se informa en LMC para el gen CDKN2B, gicas y tumores slidos, cuyo resultado es la inactivacin
este se encuentra metilado con mayor frecuencia en LLA, gnica3,6,13,14,11,22 . Estos dos genes supresores de tumores
LMA y SMD12,13,20,21 ; los autores concluyen que en la LMC la tienen una regulacin negativa del ciclo celular por lo que
metilacin de CDKN2B es un evento infrecuente. De todo la inactivacin se asocia con una ventaja en el crecimiento,
lo anterior, podra armarse que el presente estudio sera la proliferacin celular y en la trasformacin maligna42,43 .
el primero en reportar una alta frecuencia de metilacin Adems, la metilacin de las islas CpG podra ocurrir en
del gen CDKN2B en pacientes con LMC. No obstante, son etapas tempranas del desarrollo de las neoplasias hemato-
necesarios ms estudios para corroborar este hallazgo. lgicas. Por lo anteriormente mencionado, varios estudios
Las diferencias encontradas en los resultados podran reportan que la metilacin de los genes DBC1 y CDKN2B se
deberse, adems, del tamano de la muestra, a la meto- relaciona con un mayor riesgo de desarrollar malignidades
dologa empleada en cada estudio y al tipo de poblacin hematolgicas8,10,11,13,14,17,31,40,41 ; no obstante, la utilidad
estudiada. En conclusin, similar a lo encontrado en la LLA clnica del perl de metilacin en diversos genes es con-
y la LMA, en la LMC tambin se demostr una alta frecuencia trovertida, por lo que se requiere de futuros estudios para
de metilacin de los genes DBC1 y CDKN2B. demostrar esta relacin.
Adicionalmente, los estudios de metilacin de CDKN2B En el estudio realizado se encontr que la mayora de
en LMC, tambin han evaluado el perl de metilacin en las las muestras analizadas presentaban metilacin en estos dos
diferentes fases de la enfermedad. Nguyen et al.33 , repor- genes, por lo que se sugiere que la inactivacin de ambos
taron en la fase crnica un 7% de metilacin, en la fase genes podra estar relacionada con la patognesis de LLA,
acelerada un 9% de metilacin y en crisis blstica un 16% LMA y LMC en estos pacientes. Adems, en estas mismas
de metilacin. Por otro lado, Jelinek et al.18 informan en la muestras no se podra descartar que otros genes pudieran
fase crnica un 2% de metilacin, en fase acelerada un 17% estar metilados, puesto que se ha demostrado por estudios
de metilacin y en crisis blstica un 27% de metilacin. de metilomas con tcnicas avanzadas de microarrays, que es
En el estudio realizado todos los pacientes con LMC se comn la metilacin de mltiples genes en diversas neopla-
encontraban en crisis blstica lo que podra explicar, en sias, los cuales se relacionan con la iniciacin y la progresin
parte, el alto porcentaje de metilacin encontrado en los del cncer10,15---17,11,44 .
genes DBC1 y CDKN2B. En resumen, se sugiere que el estado En general, los estudios de metilacin en cncer son muy
de metilacin del gen CDKN2B aumenta con la progresin interesantes porque la hipermetilacin de genes supresores
de la enfermedad. Son necesarios ms estudios para esta- de tumores se asocia con un mecanismo epigentico rever-
blecer esta relacin. De otro lado, Jelinek et al18 tambin sible y la re-expresin de los genes metilados en algunos
proponen que en los pacientes con LMC la inactivacin de casos en particular presentan un mejor pronstico de la
genes supresores de tumores, como CDKN2B por mecanismos enfermedad5,6,14,19,11,23 . Por esta razn, la identicacin de
epigenticos, podra ser una de las causas de resistencia al genes hipermetilados en diferentes enfermedades genticas
Imatinib, un medicamento antineoplsico de primera lnea tienen el potencial de ser utilizados como biomarcadores
utilizado en el tratamiento de esta enfermedad. para el pronstico de la enfermedad y tambin como blan-
Por otra parte, en cuanto a la relacin de la metilacin cos moleculares para el desarrollo de nuevos medicamentos
de los genes DBC1 y CDKN2B con el cariotipo, se observ demetilantes5,8,16,45 .
que la mayora de los pacientes con cariotipo normal tenan Dado estos avances, a los pacientes con determinadas
metilados ambos genes, similar a lo reportado por otros malignidades hematolgicas se les suministran terapias epi-
autores10,20,21,29,37,38 . Sin embargo, en este estudio no se genticas con agentes hipometilantes, como la 5 azacitidina
encontraron diferencias signicativas para dicha asociacin, con la que se ha logrado obtener una mejor respuesta al tra-
posiblemente por el tamano de la muestra. Se menciona tamiento y tambin una mejor sobrevida7,8,19,45,46 . Adems,
que otros estudios no logran establecer esta relacin11,39 . estos avances son importantes para establecer el perl de
Se destaca que DBC1 fue el gen ms comnmente metilado metilacin con que se podra lograr una clasicacin mole-
en los tres tipos de leucemias analizadas, este fue el nico cular ms precisa de los pacientes que se benecian de este
Anlisis de metilacin en los genes supresores de tumores CDKN2B y DBC1 en pacientes 157

tipo de tratamientos16,17,38,44 ; sin embargo, la ecacia de los pacientes y/o sujetos referidos en el artculo. Este docu-
agentes hipometilantes en cncer y la utilidad clnica an no mento obra en poder del autor de correspondencia.
estn bien dilucidados.
Este es el primer estudio de anlisis de metilacin en los Financiacin
genes DBC1 y CDKN2B realizado en pacientes colombianos
con LLA, LMA y LMC; tambin es el primero en Latinoamrica Este trabajo de investigacin fue nanciado por la Uni-
que evala el estado de metilacin del gen DBC1 en leuce- versidad de Antioquia, Medelln, Colombia. Programa de
mias. Los resultados aportan informacin bsica importante Sostenibilidad de Grupos 2009-2010, Gentica Mdica, CPT-
del perl de metilacin de estos dos genes en neopla- 0905.
sias hematolgicas para nuestra poblacin, especialmente
la alta frecuencia de metilacin del gen DBC1 encontrada Conicto de intereses
en las muestras de LLA, LMA y LMC. Los resultados de este
estudio conrman hallazgos previos de las frecuencias de Los autores no tienen conicto de inters en relacin con el
metilacin de DBC1 y CDKN2B en LLA y LMA, pero dieren con artculo que se remite para publicacin.
las encontradas en LMC, particularmente con el gen CDKN2B,
siendo el primer estudio en informar una alta frecuencia de
metilacin.
Agradecimientos
Las diferencias de los resultados obtenidos frente a los de
otros estudios podran explicarse por varias razones como: A los pacientes por su participacin voluntaria en este
el tamano de la muestra; las metodologas empleadas; trabajo; al Hospital Universitario San Vicente Fundacin de
la exposicin a determinados agentes medioambientales y a la ciudad de Medelln, Colombia, por su colaboracin con la
la composicin gentica de la poblacin colombiana, la cual remisin de muestras. Al laboratorio de Gentica Mdica de
es considerada histricamente como un aislado gentico la Facultad de Medicina, de la Universidad de Antioquia, por
compuesto por una mezcla tnica de europeos, africanos y suministrar los resultados de los cariotipos de los pacientes.
amerindios47 . Al Dr. Jorge Botero Garcs, por su permanente asesora en
Son necesarios futuros estudios con un mayor nmero los anlisis estadsticos.
de muestras y emplear tcnicas epigenmicas para evaluar
mltiples genes con el n de validar estos hallazgos en la Bibliografa
poblacin de Colombia, como tambin para esclarecer el
valor del diagnstico y del pronstico de la metilacin de 1. Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, Jaffe ES, Pileri SA, Stein
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