ASIGNATURA: GENTICA

DOCENTE: RODRIGUEZ SOTO, JUAN CARLOS

CICLO: III

PRCTICA N: 09

"RECONOCIMIENTO DEL ADN: REACCION DE FUELGEN -

SCHIFF"

ALUMNO: MUDARRA SARE, Josu

TRUJILLO PER
2017
 INTRODUCCIN
Segn Kiernan (1999), el fundamento de este mtodo se basa en la identificacin altamente
especfica de cidos nucleicos del ADN a partir del reconocimiento de los grupos aldehdos de la
pentosa (azcar). Para esto se realizan 2 pasos fundamentales:

La hidrlisis cida, se utiliza para romper los puentes de hidrgeno que unen a la doble hlice,
mediante la desnaturalizacin de la cadena. Para esto se utiliza cido clorhdrico (HCl), que es el
componente reactivo ms crtico del mtodo, controlando la concentracin del cido, temperatura
y tiempo, que depende del tipo de tejido (compactacin de cromatina) y fijador empleado.

Durante la hidrlisis cida suave la mayor parte del RNA se divide en sustancias solubles y se
pierde del tejido, sin ser removidos los grupos ribosil debido a la presencia de un grupo hidroxilo
en la posicin 2' de la ribosa, por lo que, este material no reaccin posteriormente con el reactivo
de Schiff. Mientras tanto el DNA es parcialmente hidrolizado siendo removidas y liberadas las
bases pricas (A y G) de los residuos de desoxirribosa (DEPURINIZACIN) formando cido
apurnico y generando grupos aldehdo (CHO) en el C1 de la pentosa, donde se encontraba unida
la base nitrogenada.

Davidson (1980) seala que, La interpretacin de la reaccin de Feulgen es que el ADN en el

material nuclear del tejido es hidrolizado parcialmente por el HCl caliente, dando sustancias que
permanecen en el lugar de la produccin y originas el color rojo. Las reas ricas en ADN quedan,
por lo tanto, fuertemente teidas. Se cree que el tratamiento con cido rompe los enlaces
glucosidicos entre la desoxirribosa y las bases puricas. Este hecho deja expuestas las
desoxirribosas. La duracin de la hidrolisis es un factor crtico, si se ha utilizado el liquido de
Carnoy como fijador (como en este caso), la duracin optima es de 10 minutos, que corresponde
a la mitad de las bases totales, presumiblemente las purinas. De prolongarse el tiempo de
hidrolisis, se da una progresiva separacin del ADN de la preparacin, con la consecuente
reduccin de la tincin de Feulgen. Tambien hay que tener en cuenta las variables de tiempo
de exposicin a la hidrlisis acida, pH ([ H+]) al que se lleve a cabo la reaccin, temperatura y el
grado de compactacin de la cromatina que depende de la naturaleza del tejido.
 Grafico N1: Reaccin de Feulgen.(1924)

Como segundo paso, segn Kiernan (1999), es la Tincin con Reactivo de Schiff. Los grupos
aldehdos liberados por la hidrlisis de Feulgen son teidos con reactivo de Schiff. Los resultados
son DNA (cromatina nuclear, cromosomas) teido color fucsia y fondo incoloro. La hidrlisis
cida rompe los puentes de hidrgeno separando las hebras de DNA produciendo una
DEPURINIZACIN, por lo tanto, para obtener un mayor nmero de grupos aldehdo reactivos,
identificables con reactivo de Schiff, es necesario realizar una hidrlisis que libere mayor cantidad
de bases pricas.

El objetivo de esta prctica es conocer los fundamentos de una coloracin Feulgen - Schiff y el
protocolo de ejecucin que se debe seguir para realizar una correcta Coloracin.
I. MATERIALES

III.1. MATERIALES

A) Material biolgico:

- Raicillas de Allium cepa (meristemos)

B) Reactivos:
- Fijador Carnoy
- HCl 1M.
- Reactivo de Schiff.

C) Materiales y equipos:
- 03 microscopios.
- 01 vaso de precipitacin.
- 03 Lminas.
- 03 Laminillas.
- 01 Termmetro.
- 01 cocina elctrica.

II. PROCEDIMIENTO

- Remover el fijador de Carnoy de las superficies de las races de allium cepa.

- Sumergimos las races en HCl 0,1 N
- Lavamos en agua corriente durante un minuto, seguido de otros dos lavados
de un minuto en agua destilada con el fin de eliminar la mayor cantidad
posible de impurezas.
- Colocamos las raicillas en tubos de ensayo, que colocamos en bao mara
durante 8 minutos a una temperatura entre 65 - 70C.
- Tratamiento con el reactivo de Schiff, una vez colocadas las muestras en las
lminas portaobjeto sumergimos la muestra en colorante de Schiff durante
 media hora a una temperatura de 25C y en la oscuridad. Se procura que los
portaobjetos tengan la menor cantidad de agua posible al entrar en el reactivo
de Schiff, pero evitando que se sequen. Durante todo el proceso los
portaobjetos son agitados suave y peridicamente.
- Lavado en bao sulfuroso durante un minuto, a temperatura ambiente tres
veces consecutivas para eliminar el exceso de colorante.
- Lavado en agua corriente de 10 minutos de duracin.
- Deshidratacin y montaje de las muestras para su estudio, agregar 1 gota de
aceite de inmersin y observar al microscopio a objetivo de 100x.

III. RESULTADOS
IV. DISCUSION

La capacidad de la fucsina bsica decolorada (reactivo de Schiff) de reaccionar con

los grupos aldehdo da como resultado la aparicin de un color rojo distintivo y es la
base de las reacciones del PAS (cido perydico-reactivo de Schiff) y de Feulgen.
La reaccin del PAS (cido perydico-reactivo deSchiff) tie carbohidratos y
macromolculas con abundancia de carbohidratos. Se usa para detectar glucgeno
en las clulas, moco en varios tipos de clulas y tejidos, la membrana basal que se
encuentra debajo de los epitelios y las fibras reticulares del tejido conjuntivo. La
reaccin de Feulgen, que incluye una hidrlisis cida dbil con HCl, se utiliza para
teir DNA.

Los fundamentos de la reaccin del PAS son los siguientes:

Los anillos de las hexosas (carbohidratos) poseen carbonos adyacentes, cada uno
de ellos con un grupo hidroxilo (OH).
Las hexosaminas de los glucosaminoglucanos tambin poseen carbonos
adyacentes, pero con alternancia de grupos hidroxilo (OH) y grupos amino (NH2).
El cido perydico rompe la unin entre estos tomos de carbono adyacentes y
forma grupos aldehdo.
Estos grupos aldehdo reaccionan con el reactivo de Schiff para dar un color
prpura intenso distintivo.

La reaccin de Feulgen separa las purinas de las desoxirribosas del DNA por medio
de una hidrlisis cida dbil; entonces se abren los anillos de monosacrido y se
forman grupos aldehdo. De nuevo, son los grupos aldehdo de formacin reciente
los que reaccionan con el reactivo de Schiff para dar el color rojo prpura
caracterstico. La reaccin del reactivo de Schiff con el DNA es estequiomtrica y
por lo tanto, puede usarse en mtodos espectrofotomtricos para cuantificar el DNA
en el ncleo de una clula. El RNA no se tie con el reactivo de Schiff porque no
tiene desoxirribosa.
 Esta tcnica de Fuelgen- Schiff consiste en la hidrolizacin del DNA mediante
una dilucin dbil de cido clorhdrico que libera las bases pricas, quedando
libres los radicales aldehdos de las pentosas, y en la coloracin con
leucofuscina, que pone de manifiesto los grupos aldehdo.

V. CONCLUSIONES.

1. Se describi los fundamentos de una Coloracin Feulgen - Schiff, incluyendo a todos

los reactivos que intervienen en dicha coloracin.

2. Se detall el protocolo de ejecucin que se debe seguir para realizar una correcta
Coloracin Feulgen - Schiff.

3. Se observ el ADN teido de color rojo prpura.

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

- Davidson, R. (1980). Bioqumica de los cidos Nucleicos. Editorial Revert S.A.

Mexico, D.F.

- Kiernan, J. (1999) Histological and Histochemical Methods, Theory and Practice.

(3Ed.). Washington D.C, Estados Unidos.

- Martinez, R. & Gragera, R. (2008) Fundamentos Tericos y Prcticos de la

Histoqumica. Consejo Superior de Investigaciones Cientficas. Madrid, Espaa.
ANEXOS