Universidad del Papaloapan

Campus Tuxtepec

Proyecto final:

Propagacin masiva in vitro de

Orqudeas en peligro de extincin en
Mxico

Alumna: Lorena Omega Martnez Hernndez

Materia: Cultivo de Tejidos Vegetales

Profesor: Dr. Enrique Villalobos Amador

Carrera: Ing. En Biotecnologa

Semestre: Octavo

San Juan Bautista Tuxtepec, Oax., a 3 de Julio de 2017

Universidad del Papaloapan Dr. Enrique Villalobos Amador
Campus Tuxtepec
Alumna: Lorena Omega Martnez Hernndez Ing. En Biotecnologa/Octavo semestre

Resumen

La familia de las Orchidaceae es una especie amenazada en Mxico a causa de las actividades humanas de extraccin ilegal
de su hbitat natural, entre otras. Por lo que se han generado alternativas mediante tcnicas de cultivo in vitro de tejidos
vegetales a gran escala para su propagacin a partir de semillas, generacin de callos y subcultivos y as aumentar el nmero
de ejemplares, para ser aclimatadas, trasplantadas y cultivadas de manera individual.

Introduccin

Mxico ocupa el cuarto lugar en biodiversidad a nivel mundial es especies animales y

vegetales, siendo un 54.2 % las especies endmicas de plantas vasculares, ocupando en su
mayor porcentaje la familia de la Orchidaceae (Magaa y Villaseor, 2002). De las 20 mil a
30 mil especies de orqudeas reportadas en el mundo, Mxico cuenta con 1106, de los cuales
181 especies son consideradas en alguna categora de riesgo en la norma oficial mexicana
vigente. El gran problema presentado en estas especies de alta importancia ornamental, es el
dao a los hbitats naturales debido a las actividades humanas, tales como la deforestacin,
incendios forestales, erosin de suelos y extraccin ilegal de especies. Lo que ha ocasionado
un llamado de atencin a las comunidades sociales, polticas y cientficas para el
establecimiento de estrategias de conservacin para esta familia de plantas.

Una de las estrategias de mayor impacto en la actualidad, es la tcnica de propagacin masiva

in vitro o micropropagacin ofrecida por la Biotecnologa Vegetal, la cual consiste en obtener
un nmero muy alto de nuevas plantas partiendo de fragmentos mnimos de tejido vegetal,
cultivados en medios artificiales bajo condiciones controladas (Molphe-Balch, 1995) para su
desarrollo en grandes invernaderos en condiciones ex vivo. Con esto, se puede mantener una
produccin rpida y continua de ejemplares de calidad, para reducir en gran medida la
extraccin de las especies de sus ambientes naturales y conservar aquellas de naturaleza
endmica. Conllevar estos mtodos a escalamiento mayor, empleando herramientas
tecnolgicas y estrategias de produccin, permitir la aceleracin del rescate de muchas otras
especies en peligro al borde de la extincin.

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Antecedentes

Autor (es) Acontecimiento

Nol Bernard, 1900 Primera propagacin in vitro de orqudeas a
partir de la siembra de semillas de manera
simbitica.
Lewis Knudson, 1921 Propagacin in vitro de orqudeas a partir de
la siembra de semillas de manera
asimbitica.
Morel, 1960,1964. Introduccin de la tcnica de meristemos
para la propagacin vegetativa.
Nothern, 1970; Desarrollo de mtodos de propagacin
Leroy y Pike, 1976 sexual a travs de semillas.
Arditti, 1970; Propagacin asexual a travs de explantes
Sagawa y Kinisaki, 1984 vegetativos.
vila-Daz, 2006 Propagacin y mantenimiento in vitro de
orqudeas mexicanas para colaborar en su
conservacin.
Chvez, 2014 Propagacin in vitro de semillas de la
orqudea Comparettia falcata mediante
tcnicas simbiticas y asimbiticas.

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Descripcin de la propuesta

Realizacin de propagacin masiva de variedades de orqudeas endmicas en peligro de

extincin seguida de la siguiente metodologa general:

Resiembra de Adicin de cido

Cultivo in vitro de
explantes de naftalenactico (ANA) al
semillas para generar
pseudobulbos, hojas medio basal MS para la
plntulas.
y protocormos. induccin de callos.

Subcultivo para la
Preparacin para las condiciones
generacin de nuevas
ex vivo en el periodo de
plntulas, multiplicado 50
aclimatacin para trasplantar y
veces a partir del cultivo in
cultivar en modo individual.
vitro inicial.

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Materiales y mtodos

Semillas de cpsulas de orqudea con madurez

Material biolgico fisiolgica

Asepsia superficial de las cpsulas con soluciones de

detergente neutro Hyclin al 15% por 15 min.
Enjuagues con etanol al 70% por 2 min
Establecimiento de Agua oxigenada al 3% por 1 min.
cultivos in vitro Hipoclorito comercial al 1.2 % por 20 min.
Realizar cortes trasnversales y longitudinales para ser
cultivadas.

Medio de cultivo basal MS con 30g/L de sacarosa, 7g/L

Medio de cultivo de agar, pH de 5.75.
Reguladores de crecimiento 0.05 mg/L de ANA

Condiciones de Cuartos de incubacin con lmparas de crecimiento

GrowLEDs 168 Blue, 168 Red y 130 Red/30Blue
cultivo Dual por 16 h y 25C.

Explantes de hojas, protocormos y pseudobulbos de 0.5

cm2 de las plntulas generadas por semillas.
Cultivar en medio MS con reguladores de crecimiento
Micropropagacin ANA para la induccin de callos y generar
protocornos.

Seleccin de plntulas mayores a 3 cm de longitud,

perforar frascos y acondicionarlos a luz y temperatura no
controlables.
Trasplante y Sembrar en sustratos de tezontle y corteza de encino en
cajas de plstico transparentes.
aclimatacin Sembrar de manera individual a los 30 das posteriores al
trasplante.

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Desarrollo del escalamiento

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Desinfeccin de las manos con etanol.

Uso de bata, guantes, cofia y cubrebocas.
Condiciones
Pasar por cmara de esterilizacin para
aspticas
eliminacin de partculas en la superficie
del operador
del cuerpo.

Realizacin de pruebas moleculares a Obtencin de las semillas y realizar los

las plantas donadoras para determinar procedimientos de asepsia y desinfeccin.
la presencia de patgenos
intracelulares (bacterias, hongos y
virus) antes del inicio del cultivo.

Confirmar la
ausencia de
Muestra inicial: 50,000 semillas
patgenos
PCR ELISA

Preparacin de medios de cultivo MS

Asepsia superficial Lavado con etanol

con Hyclin al 15 al 70% por 2 min.
% por 15 min.

Desinfeccin con Lavado con agua

hipoclorito de sodio oxigenada al 3%
al 1.2% por 20 min. por 1 min.
Por 1 frasco: Datos escalamiento:
25 mL de medio Nmero de semillas: 50 000
MS Total de frascos a utilizar = 5 000
10 semillas Vol. Total de medio MS = 25mL*5 000 frascos = 125 000 mL= 125 L
0.75 g de glucosa Sacarosa: 30g/L * 125 L = 3 750g = 3.750 kg
0.175 g agar Agar: 7g/L * 125 L = 875 g = 0.875 kg
0.00125 mg de BA BA: 0.05mg /L * 125 L = 6.25 mg

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Campana de
flujo laminar

Mecheros
Pinzas

Siembra de las semillas esterilizadas

en los medios de cultivo tambin Las rea de siembra debe permanecer
esterilizados por autoclave, en alta esterilidad, cumpliendo con
introduciendo 10 semillas por frasco. los equipos y materiales importantes.

Cultivo de plntulas Germinacin de las

por 4 meses bajo semillas en un tiempo
condiciones de luz y aproximado de 40 das.
temperatura
controladas.

Anlisis estereoscpico para el

estadio de las semillas germinadas.
Lmparas Grow LEDs 168 Blue, 168 Red
y 130 Red/30 Blue Dual por 16 h a 25C.

Obtencin de plntulas de 5 cm Se introducirn

de longitud, el cual, se tomarn 10 explantes por
explantes de hojas, frasco en 25 mL
protocornos y pseudobulbos de medio nuevo
para la generacin de callos. MS, conservando
los mismos datos
de escalamiento.
Se aadir 62.5
mg de ANA en
los 125 L de
Cortes de 2 cm2
medio nuevo MS
total.

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El subcultivo a partir de callos

para generar 50 protocormos
por callo, por lo que en total se
obtendrn:
5 0000callos*50 = 2 500 000
Anlisis plntulas cultivadas.
Generacin de 50 000 callos como producto de la Estereoscpico
misma cantidad de explantes sembrados y adems por
la influencia del cido naftalenactico (ANA).

Al igual que en los cultivos

iniciales, cada frasco tendr
Datos escalamiento de subcultivo: 10 explantes de callos en 25
Total frascos: 250 000 para la siembra de los 2 500 000 explantes. mL de medio nuevo basal
Volumen de MS = 25mL*250 000 frascos = 6 250 000 mL = 6 250 L de MS MS.
Sacarosa = 30g/L*6250L = 187 500g = 187.5 kg
Agar = 7g/L*6 250L = 43 750g = 43.75 kg
ANA = 0.5 mg * 6250L = 3.125 g

Formacin de plntulas con 3cm de

longitud

Incubar bajo las

mismas condiciones
de luz y temperatura
por 4 meses

Tanques de preparacin de medios escala

planta piloto.

30 das (races, velamen 4 meses

y pseudobulbos)
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Para la aclimatacin, las tapas de los

frascos se perforan y se mantienen
durante 24 h.

Siembra de las plntulas en cajas de plstico transparente con tezontle y corteza

de encino como sustratos.
Total plntulas: 2 500 000
Dimensiones de las cajas: 1.5 x 1 m
rea por plntula: 10 x 10 cm
Total de plntulas por caja: 150
Total de cajas: 2 500 000 plntulas/ 150plntulas por caja = 16 667 cajas

150 plntulas
Abrir la cubierta de la caja poco a poco
cada 5 das por 30 das, con roco de
agua diariamente.

1.0m
Separar cada planta y cautivarla en modo
1.5m
individual para su adaptacin ex vivo en
invernaderos.

Obtencin de orqudeas de alta calidad con

fines ornamentales para contrarrestar el
impacto disminucin de ejemplares en
hbitats naturales.

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Resultados y discusin

No hubo presencia de patgenos intracelulares en las plantas donadoras despus de

realizar los ensayos moleculares de PCR y ELISA.
Se obtuvo una tasa de geminacin de las semillas de 100% al emplear el medio
completo MS con adicin del regulador de crecimiento BA.
El plazo de germinacin fue de 40 das.
La concentracin de ANA a 0.5 mg/L fue la ptima para la induccin de callos y
partir de all para la toma de explantes en el subcultivo.

Las condiciones de luz con las lmparas Grow LEDs fueron las adecuadas para la
germinacin, crecimiento y desarrollo de las plntulas.
El porcentaje de supervivencia de las plntulas a las condiciones ex vivo fue de 100%
debido al uso y manejo de los equipos y tcnicas, preparacin de los medios
adecuados y alta esterilidad de los materiales y usuarios.

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Expectativas del proyecto

Generar a gran escala la produccin de varias especies de orqudeas que se consideren

endmicas y en peligro de extincin, haciendo uso de las herramientas
biotecnolgicas para tcnicas de anlisis molecular, cultivo in vitro de clulas y
tejidos vegetales para su propagacin y distribucin, como una alternativa al empleo
de plantas silvestres originarias de su hbitat, que impactan en gran medida a la
reduccin de ejemplares de las mismas.
Se espera que el desarrollo del escalamiento con todas las especificaciones
mencionadas, den resultados favorables en un mediano plazo con los mayores
rendimientos posibles igual o cercanos al 100 %.

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Consultas bibliogrficas

vila Daz, Irene, Propagacin y mantenimiento in vitro de orqudeas mexicanas,

para colaborar en su conservacin, Facultad de Biologa, Universidad Michoacana
de San Nicols de Hidalgo, Michoacn. MX, pp. 138149, 2006

Northen, R. T.1970 Home Orchid

Growing. Third Edition. 95-113

Surez-Quijad, Iris, Propagacin in vitro y aclimatizacin de euchile mariae

(ames) withner (orchidaceae), Jardn Botnico, Instituto de Biologa, Universidad
Nacional Autnoma de Mxico, 2007.

Molphe-Balch, Eugenio, Desarrollo de sistemas para la propagacin masiva y

conservacin de germoplasma in vitro de 20 especies mexicanas de cactceas,
Investigacin y Ciencia, pp 36-42, 1995

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