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Fundamento:
La PCR cuantitativa se realiza en un termociclador con capacidad de hacer incidir sobre
cada muestra un haz de luz de una longitud de onda determinada y de detectar la
fluorescencia emitida por el fluorocromo excitado. Este termociclador es un aparato con
capacidad para calentar y enfriar rpidamente las muestras, de modo que se aprovechen
las cualidades fisicoqumicas de los cidos nucleicos y las enzimticas del ADN polimerasa.
El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de cambios de temperatura que se
repiten en 25 - 40 veces, llamados ciclos, donde cada uno posee un mnimo de tres etapas:
la primero, en torno a los 95 C, permite la separacin de los cidos nucleicos de doble
cadena; el segundo, a una temperatura en torno a los 50-60 C, permite el alineamiento de
los cebadores al ADN molde;5 el tercero, a 68 - 72 C, facilita la polimerizacin por parte
del ADN polimerasa. Debido al pequeo tamao de los fragmentos amplificados
usualmente en este tipo de PCR puede omitirse el ltimo paso, pues la enzima es capaz de
amplificar durante la rampa entre la temperatura de alineamiento y la de desnaturalizacin.
Adems, algunos termocicladores aaden a cada ciclo unos segundos a otra temperatura,
por ejemplo 80 C, a fin de reducir el ruido por la presencia de dmeros de cebadores cuando
se emplea un colorante inespecfico. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada
ciclo dependen de gran variedad de parmetros, como: la enzima usada para la sntesis de
ADN, la concentracin de iones divalentes y desoxirribonucletidos (dNTPs) en la reaccin
y la temperatura de unin de los cebadores.
Bibliografa: