PROTOCOLO

EXTRACCCION DE ACIDOS GRASOS POLIINSATURARADOS A PARTIR DE LA LEVADURA

PICHIA KUDRIAVZEVII

El aislamiento de la PICHIA KUDRIAVZEVII se obtendr a partir de frutos podridos (muestras de

fruta podrida de mango, guayaba, naranja, granada, las uvas, el banano y la papaya) para la
produccin de cidos grasos poli insaturados a partir de la levadura.

Se realizara la optimizacin de parmetros fisiolgicos y nutricionales para mejorar la

produccin de biomasa utilizando sustratos baratos tales como glicerol bruto, autolizados de
levadura y licor de maz.

PROCEDIMIENTO

1) Colocar los frutos podridos y recogidos en un medio MGYP que contiene glucosa, 10-
Peptona, 5 Extracto de levadura, 5 Extracto de malta, 3- KH 2 PO4, 1 y MgSO ,47 H2O,
en un erlenmeyer de 250 ml

2) Colocar ampicilina para evitar el crecimiento bacteriano

3) Incubar las muestra 28C durante 48 hrs a 200 rpm para poder enriquecer las
levaduras

4) Posteriormente plaquear sobre placas de agar MGYP incubar a 28C durante 72 h e

identificar las colonias por la morfologa tpica de levadura.

5) Preparar una solucin saturada de Sudan Black B (0,3 g en 100 ml de etanol al 70%
(v / v) y se deja reposar a temperatura ambiente durante 24 h con agitacin ocasional
y se filtra.

6) El cultivo de levadura se emulsiona en una alcuota de 0,5 ml de la solucin de Sudn

Negro B y se deja reposar durante 15 minutos, luego extender sobre una lmina
microscpica y secar al aire.

7) Posteriormente el frotis se trata a continuacin con una solucin acuosa al 1% (p / v)

de safranina brevemente, se lava con agua, se seca y se observa al microscopio.

8) El crecimiento de la levadura se controlara midiendo la densidad ptica (OD) a 600 nm

y determinando el peso de clulas secas (DCW) a intervalos regulares.

9) La composicin total de cidos grasos se determinara por cromatografa en columna

SGE Forte (columna capilar BPX70, longitud 60 m, id 0,25 mm, pelcula 0,25 lm) usando
un detector FID.

10) Se optimizara los parmetros fisicoqumicos y nutricionales para mejorar la produccin

de biomasa entre estos el pH (5,0-7,0), la edad del inculo (6-24 h), la temperatura
(25, 28 o 37 C), el tamao del inculo (5-25% (v / v)), la fuente de carbono (Glucosa,
galactosa, almidn, arabinosa, glicerol, manitol, sacarosa y fructosa a una
concentracin final de 10 g de L1) y fuentes de nitrgeno orgnico e inorgnico
(peptona, triptona, extracto de levadura, extracto de carne de vaca, Licor (CSL), cloruro
de amonio, nitrato de sodio y azufre de amonio a una concentracin final de 5 g de
L1).
11) Las clulas de levadura se rompieron por homogeneizacin a 4C bajo una presin de
800 bares en un homogeneizador de alta presin. Se tomaron cinco muestra y se midi
la reduccin en OD en varios muestras
12) Las clulas homogeneizadas se mezclaron con 10 l de n-hexano y se agitaron durante
1 h a 950 rpm. La mezcla se dej estabilizar durante 10 - 12 h a temperatura ambiente.

13) La capa acuosa inferior se retir; Se aadi alcohol isoproplico (IPA) (2,5 l) para
separar la capa orgnica que se recogi posteriormente y se concentr para recuperar
aceite.

14) Los cidos grasos en el aceite se convirtieron primero en sus steres metlicos por
reaccin de transesterificacin en presencia del catalizador de trifluoruro de boro. Los
steres metlicos de cidos grasos (FAME) se analizaron a continuacin por GC.

15) El aceite de levadura se refin como y trans-esterificado a biodiesel con metilato de

sodio al 30% a 60-65 C durante 2 h. La capa de glicerol inferior se retir y el biodiesel
bruto se someti a lavados con agua caliente para eliminar el jabn y las impurezas.