Caractersticas morfolgicas, bioqumicas y moleculares de

Metarhizium anisopliae y M. Flaviviridae.

Introduccin
El gnero Metarhizium es, desde los trabajos de Tulloch (1 976) y Rombach et al. (1 987),
generalmente aceptado como Incluyendo slo tres especies: Metarhizium anisopliae
(Metschnikov) Sorokin, M. flavoviride (W. Gams & Rozsypal) y M. Petch lbum. M. anisopliae
est aislado Ms a menudo de insectos en una amplia gama de rdenes (Veen, 1968). Las otras
dos especies tienen aparentemente ms Patrones limitados de ocurrencia y distribucin
(Rombach Et al. 1986, 1987), pero las colecciones no han sido Suficiente para determinar si esta
aparente La rareza es genuina. La taxonoma del gnero sigue siendo Causando controversia
con, por ejemplo, tres nuevas especies Recientemente descrito de China: M. cylindrosporae Q.-t.
Chen & H.4. Guo, M. guizhouense Q.4. Chen y H. - 1. Guo y M. pingshaense P.-t. Chen y H. - 1.
Guo (guo et Al., 1986). Estas especies no han sido estudiadas crticamente Por otros
trabajadores. Guo et al. (1986) acept a M. Anisopliae pero no M.Jlavoviride o M. lbum.
El gnero tiene una distribucin mundial (Brady, 1979a) y M. anisopziae se ha utilizado
ampliamente en Sistemas experimentales para el control biolgico de una
Variedad de plagas de insectos (Gillespie, 1988). Registros de M. Flavoviride son menos
numerosos que los de M. anisopliae

(Por ejemplo Humber y Soper, 1986, R. J. Milner, personal La comunicacin), aunque M.

flavoviride probablemente tiene Una distribucin como M. Anisopliae. Durante una reciente
Programa para desarrollar Deuteromycotina entomopatgena Como mycoinsecticides para el
control de langostas y Saltamontes (Prior et al., 1992), numerosos aislamientos de M.
Los Jlavoviride se recuperaron de huspedes acridides en frica. Aislados de Metarhizium spp.
Tienen un anfitrin muy diferente (Ferron et al., 1972). Las caractersticas culturales Se ha
utilizado para separar algunas poblaciones de M. anisopliae (Yip et al., 1992), pero aislados
individuales no Siempre se distinguen por estos mtodos. Yip et al. (1992) sealan que una
separacin adecuada y precisa de Cepas de Metarhizium spp. Se convertir cada vez ms
Importante como inters en su explotacin para el control de plagas Se intensifica. Se requiere
una "huella digital" nica para Genotipos, por dos razones: proporcionar Organizaciones con la
capacidad de identificar Aislamiento para fines de patente y registro, y Permitir el control del
impacto medioambiental de Particular despus de su uso como un mycopesticide. En Este
ltimo caso si se sospecha algn efecto secundario, como Infeccin en organismos no objetivo,
el aislamiento aadido Distinguirse del gran nmero de personas que Morfolgicamente
idnticos, los aislamientos indgenas presente. En este trabajo se reporta la caracterizacin, por
bioqumica Y mtodos moleculares, de 24 aislamientos de Metarhizium

Spp. Examinado para la virulencia a la langosta del desierto,

Schistocerca gregaria Forskil (Prior et al., 1992). Estas

Aislamientos originados principalmente de huspedes ortpteros, tanto Dentro y fuera de la zona
geogrfica de S. gregaria, Pero algunos colepteros y hompteros aislados tambin fueron
Seleccionados y se incluyen aqu. Los aislados se clasificaron Utilizando tanto la morfologa
convencional como bioqumica Y mtodos moleculares en un intento de determinar claros
Distinciones entre especies y entre genotipos A nivel sub-varietal.

Metodologas
Aislamientos Culturas de los 24 aislamientos de Metarhizium anisopliae y M. Pauoviride (Tabla 1)
se recibieron en agar de Molisch (Speare, 1920) y Mantenido a 4 "C en las pendientes de agar de
extracto de malta (Smith & Onions, 1983). Condiciones de crecimiento. Para el examen
morfolgico se Cultivadas en agar de zanahoria de patata (PCA) (Smith & Onions, 1983) en 21 y 2
"C. Las preparaciones de diapositivas de esporas maduras de 28 d fueron Montado en lactofucsina
para un examen detallado de la morfologa de los conidios Y el tamao. Para otros procedimientos
se cultivaron cultivos en glucosa / extracto de levadura (GYM, Mugnai et al., 1989). Culturas para
el API ZYM Los kits de ensayo se cultivaron en cultivo estacionario a 25 C durante 14 dy se
cultivaron Para la isoenzima y las determinaciones de ADN fueron cultivadas durante 60 h en una
Agitador orbital a 27 "C. Mtodo API ZYM. El fluido de cultivo se recogi del Y se utilizaron como
inculo directo en el kit de prueba API ZYM (BioMrieux). Las tiras de ensayo se inocularon con 50
\ mu l de fluido de cultivo en Cada pocillo, y se incubaron durante 4 h a 35 C. La actividad
enzimtica fue Determinado por reacciones de color despus de aadir los reactivos API ZYM A
Y B. Las tiras reactivas iniciales se inocularon por duplicado. Electroforesis de isoenzimas. El
micelio fngico fue cosechado de Lquido por filtracin con un embudo Buchner, y se lavaron
Tris / glicina buffer (0-3 YO Tris, 1,44 YO (p / v) glicina, pH 8,3). Micelio Se liofiliz por enfriamiento
a 1 C a -45 C y secado para 24 h a 2,2 mbar (Edwards Minifast 3400). El micelio seco fue
Roto por moler en un mortero y un mazo. El micelio de tierra (100-200 mg) se resuspendi en
aproximadamente 1 ml de Tris / glicina En un tubo de 1,5 ml y se clarific por centrifugacin en un
rotor angular En una centrfuga de banco refrigerado Sigma 2K15 a 4 "C a 13000 g para
40 min. El sobrenadante resultante se recogi y la protena total Determinado por el mtodo de
Lowry. La electroforesis se realiz En geles de poliacrilamida al 10% (p / v) para fosfatasa cida, y
8,2 H (P / v) de geles de poliacrilamida para catalasa. Las muestras se cargaron en 10 x 10 x 0,1 cm
geles para dar una carga de 150 pg de protena en cada carril. La electroforesis se llev a cabo a
2,5 mA cm 'en una solucin discontinua Con un tampn de depsito de Tris / glicina y un Tris /
citrato (1,37 YO (p / v) Tris, 0,0525 YOc de cido itrico) tampn de gel. Las isoenzimas de fosfatasa
cida fueron Teidos de acuerdo con el mtodo de Shaw & Prasad (1970) y catalasa
Isoenzimas se tieron de acuerdo con Woodbury et al. (1971). RFLP. El micelio fngico se cosech
y se interrumpi como para Isoenzima. El ADN celular total se extrajo de la En polvo micelio
liofilizado de acuerdo con el mtodo de Raeder & Broda (1985). Las muestras de ADN se
verificaron y cuantificaron Concentraciones conocidas de 1 ADN de fago en un minigel de agarosa
de 1 Oh (p / v). Las muestras de ADN se digirieron durante la noche con HaeIII (Sigma) de acuerdo
con A las condiciones del fabricante y se separaron muestras de 5-10 pg en una 0-7% de gel de
agarosa a 5 V cm 'en tampn Tris / borato / EDTA (0,605% Tris, 0,3085% de cido brico, 0,0372%
de EDTA). Una muestra de un ADN de fago Se incluy en cada conjunto de digestiones y en cada
gel como Control de la restriccin. Los geles se tieron durante 45-60 minutos en 0,5 pg Bromuro
de etidio ml 'y se fotografi sobre Polaroid 667 y 665 Pelcula sobre un transiluminador UV.
Reproducibilidad. La reproducibilidad de los resultados se investig en dos formas. Para la
determinacin de API ZYM y isoenzima, cinco cepas fueron Probado 7 meses despus del estudio
original. Patrones de restriccin de ADN fueron La repeticin de la extraccin, digestin y
electroforesis en Subculturas posteriores de lneas de cultivo comn.
Resultados
Morfologa: El examen con microscopio de luz de los aislamientos La Tabla 1 revel la morfologa
de acuerdo con las descripciones De la especie bajo la cual fueron depositados, Con excepcin del
IMI 333138 que tena una espora Forma ms tpica de M. anisopliae. Dos aislamientos de M.
Jlavoviride, IMI 324673 e IMI 330189, se haban reducidoConidios y por lo tanto pueden colocarse
en la var. Menos (Tabla 2). ARSEF 324 tena morfologa ms cercana a M. Jlavoviride pero el color
verde oscuro de la masa de esporas Fue ms tpico de M. Anisopliae. Todos . Anisopliae cepas
examinadas var. Anisopliae y ninguno perteneca En var. Majus.

Mtodo API ZYM

Los resultados de las tiras reactivas API ZYM de los Fluidos de cultivo se dan en la Tabla 3. Adems,
Se realizaron determinaciones en 7 d fluidos de cultivo; sin embargo, Estos mostraron niveles
mucho ms bajos de actividad enzimtica y Fueron poco reproducibles (datos no mostrados).
Todos los aislamientos Mostr reacciones ampliamente similares despus de 14 d, aunque un
Pocos aislamientos diferan en su P-glucoronidasa, a-glucosidasa Y P-glucosidasa. Todos los
aislamientos recibieron Como M. Flavovirida careca de actividad a-fucosidasa, adems
A la cepa ARSEF 324, recibida como M. anisopliae. Estas Aislados tambin mostr nico API
individual ZYM

Electroforesis de la isoenzima La electroforesis de las isoenzimas de la catalasa dio cuatro

Patrones, designados como A1, A2, B1 y B2. Aislamientos Recibido como M. anisopliae mostr una
banda (patrn A2) o dos bandas (patrn Al). La banda superior de patrn A2 Era comn a todas las
cepas, algunas mostrando un segundo Banda inferior (Al). Aislados recibidos como M. J-lavovivide
Mostr una banda superior que no emigr tan lejos como En M. anisopliae (B2), y algunos aislados
mostraron un segundo Banda inferior del mismo R, como M. anisopliae (Bl). UN
Representacin esquemtica de patrones para seis aislamientos Se muestra en la Fig. 1. Aislar
ARSEF 324 dio una sola banda En la misma posicin que la de las muestras de M.9avovirida
(B2) (datos no mostrados). La electroforesis de las isoenzimas de fosfatasa cida Dos patrones
distintos (Fig. 2). Todas las muestras de M. Anisopliae mostr dos bandas principales cerca de la
parte superior de la Gel (patrn C). Las muestras de M.J-lavovirida mostraron una rea nica de
coloracin difusa aproximadamente equivalente A las dos bandas de M. anisopliae, aunque
distintas No se observaron bandas (patrn D). Adems, en algn gel Las muestras de M. anisopliae
mostraron otras dos bandas Ms cerca del centro del gel (datos no mostrados). Son Recibido como
M. J-lavoviride tambin a veces mostraba dos Otras bandas que, cuando estaban presentes, tenan
diferentes R, Valores que los de M. anisopliae. Aislar ARSEF 324 dio un rea manchada
difusamente similar a otros aislamientos De M. flavoviride.

Mtodos RFLP

RFLP anlisis de HaeIII digiere de total celular El ADN de 11 aislamientos representativos (IMI
047038, 168777ii, 298061, 324673, 330189, IIBC 190 - 574,
ARSEF 324, 435, 443, 1009, 2023) mostraron dos (Fig. 3). HaeIII digiere del ADN total de Aislados
de M. anisopliae mostraron patrones simples de Unas pocas bandas. Se observ una considerable
similitud entre Diferentes aislamientos, aunque los patrones eran nicos Aislar estudiado. Las
digestiones de los aislamientos de M. Jlauoviride eran considerablemente ms complejos, De 20 o
ms bandas. Los patrones complejos Bandas en comn con los simples patrones de M. anisopliae
Pero de otro modo eran muy distintos de ellos. Aislar ARSEF 324 mostr un complejo patrn de
ADN, similar al Las de M. Jlavoviride.

Reproducibilidad
La reproducibilidad de los resultados anteriores fue bueno. Las nicas discrepancias observadas en
los patrones API ZYM Implicaba reacciones dbiles. Se encontraron patrones de isoenzima Ser el
mismo en la repeticin de la obra aunque la menor Las bandas de fosfatasa cida fueron variables
en que A veces manchado dbilmente o no en absoluto. Del mismo modo, la Posesin de la banda
de catalasa inferior, que no Observado en todos los aislamientos, fue ligeramente variable. Estas
diferencias Presumiblemente debido a concentraciones relativas de Diferentes componentes
enzimticos, pero no interfieren Los principales criterios diagnsticos.

Discusin
Morfologa Las mediciones conidiales han sido las Carcter de diferenciacin de especies en el
gnero Metarhizium (Gams y Rozsypal, 1973, Tulloch, 1976; Brady, 1979a, b; Rombach et al.,
1986); sin embargo, Las dimensiones conidiales publicadas para M. anisopliae y M.
Jlavoviride se superponen. Es obvio, por lo tanto, que la espora Las medidas por s solas no
distinguen con precisin los dos especies. Adems, el trabajo de Kamat et al. (1952) Indic que el
tamao de las esporas en M. anisopliae era dependiente Sobre el medio de cultivo empleado.
Tampoco es colonia Confiable, aunque diferentes autores suelen referirse a A M. Jlavoviride como
de color verde plido, grisceo Amarillo-verde u olivceas. M. anisopliae Ha sido descrito como de
color verde amarillento, olivceo, Verde oscuro de la hierba, rosado o vinoso (Brady, 1979 a).
ARSEF 324, con color tpico de M. Anisopliae, Sale con M. Jlavouiride segn otros criterios Utilizado
en el presente estudio.

Metodos Bioquimicos

Aunque la expresin enzimtica depender de Condiciones de cultivo, la tira API ZYM proporcion
una Enzima que diferenciaba entre las especies. un-
La fucosidasa es una enzima que escinde enlaces a la Desoxi-azcar fucosa. En el kit API ZYM esto
est presente Como fucopiransido sustituido con naftilo, donde el Naftilo se detecta
posteriormente con el API ZYM B. Los desoxi-azcares sustituidos se encuentran en una Variedad
de lugares en la naturaleza, incluyendo paredes de clulas bacterianas Y glicsidos vegetales. Los
patrones API ZYM en general De las cepas cambi considerablemente entre 7 y 14 d cultura. Pocas
enzimas degradantes de polisacridos Fueron vistos durante el crecimiento activo, y por lo tanto
dio negativo Reacciones a 7 d. Sin embargo, se detectaron comnmente Una vez que el cultivo se
haba convertido en glucosa limitada. en adicin A la separacin de especies, fue posible distinguir
Entre los aislados individuales de M. Jlavoviride Resultados API ZYM, aunque no entre aislamientos
de M. Anisopliae. Esto puede deberse a la distribucin ms

Los aislados de M. Jlavoviride estudiados, como perfiles idnticos Fueron a menudo mostrados por
aislamientos de M. anisopliae Mismo host y ubicacin geogrfica.
Los patrones de la isoenzima de la catalasa incluyeron una Menor entre los aislamientos de las dos
especies. Esto puede Indican una estrecha relacin gentica entre los dos
especies. Sin embargo, la caracterizacin adicional de la enzima Bandas y, en ltima instancia, los
datos de secuencias Necesario para confirmar esto.
Mtodos moleculares
Varios artculos han reportado el uso de RFLPs Derivados nicamente de ADN restringido, es decir,
sin el uso De una sonda, y algunas enzimas tales como EcoRI, Hind111 Y EcoRV pueden mostrar
distintas bandas dentro de un 'borrn' de ADN total (Coddington et al., 1987). Las enzimas tales
como HaeIII que reconocen cuatro secuencias de bases que consisten en Slo guanina y citosina,
parecen cortar hongos Cromosmico en fragmentos de menos de 1 kb, Mientras que el ADN
mitocondrial se corta menos frecuentemente Dejar fragmentos ms grandes (Marriott et al., 1984,
Cooley, 1992). Se presume en este estudio que la mayora de los Por lo tanto, las bandas
observadas se derivan de las mitocondrias ADN. Sin embargo, esto no se puede afirmar
categricamente, Particularmente con respecto a M. Jlavoviride. Las bandas de ellos . Anisopliae
cepas son en general muy similares, Y la mayora de las diferencias entre las cepas pueden ser
contabilizadas Por cambios relativamente menores en los sitios de restriccin. los
Diferencia entre estas cepas y las de M. Jlavoviride es menos claro. Digestin del ADN de M.
Los aislamientos de Jlavovirida dan lo que parece ser una digerir. El tamao total de los
fragmentos vistos en el M. Las cepas de Jlavoviride tienen ms de 100 kb, lo que es Mitocondrias
fngicas. Las cepas de M. Jlavoviride contienen Las bandas comunes vistas en M. Anisopliae
adems de Otras bandas. Hay un nmero de posibles explicaciones Para esto incluye metilacin
diferencial, contaminacin Componentes, o la presencia de ms de un componente mitocondrial
tipo. Sin embargo, este patrn es representativo de El taxn, por lo que no se requiere una
explicacin exacta El propsito prctico de separar las dos especies. Los tres enfoques utilizados
en este estudio - API ZYM, Anlisis de isoenzimas y Hue111 RFLP determinaciones Fueron capaces
de distinguir entre aislamientos recibidos M. anisopliae y M. Jlavoviride, y en algunos casos Pareca
caracterizar aislados individuales. El nico Discrepancia es ARSEF 324, que ha mostrado
consistentemente Atributos bioqumicos y un patrn RFLP de acuerdo con M . Jlavouiride.
Morfolgicamente esta cepa Mostraron caractersticas de colonias de acuerdo con M. anisopliae,
Aunque pareca ms cercano a M. Jlavoviride de Observacin microscpica. Este aislado se recibi
de La coleccin USDA-ARS de hongos entomopatgenos Y se incluy en un estudio reciente de
isoenzimas en M. Anisopliae (St Leger et al., 1992). El dendrograma de Ese estudio muestra dos
grupos sueltos de 10 aislamientos, nueve De los cuales fueron etiquetados como M. Jlavoviride o
variedades de Esa especie, ARSEF 324 siendo el dcimo aislado. En vista De esto, y los resultados
reportados aqu, parece probable que Este aislado es un miembro de M.Jlauoviride.