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Bioqumica
Separacin de biomolculas
Mtodos cromatogrficos
Los mtodos cromatogrficos son aquellos en que los diferentes componentes de una mezcla
de biomolculas se separan al interaccionar diferencialmente con una matriz porosa inmvil
dentro de una columna. El medio mvil (solvente) puede ser lquido o gaseoso, dependiendo
de la tcnica, y puede ser de composicin constante o variable.
La nomenclatura bsica no ha cambiado desde los primeros intentos hechos ya hace casi un
siglo por Tswett: se denomina columna cromatogrfica al tubo en que se realiza la corrida,
eluente al lquido o gas usado como medio mvil y cromatograma al resultado del anlisis
cromatogrfico.
La cromatografa se emplea con fines analticos, en microescala, o preparativos, ya sea en
procesos industriales o de laboratorio, para purificar diversas sustancias: protenas, cidos
nucleicos, medicamentos, etc.
Las columnas son tubos de vidrio, metal o plstico, dependiendo de la tcnica empleada, de
dimetro constante y preferentemente de un material biocompatible, es decir que no cambie la
funcin biolgica del material en estudio ni interaccione con el eluente.
Las interacciones que dan lugar a la separacin se dan sobre la matriz o soporte y pueden ser
de diversa naturaleza. As se tiene la cromatografa de intercambio inico, de interaccin
hidrofbica, de filtracin o exclusin molecular, de afinidad, etc.
Dependiendo de las
necesidades de Bomba
resolucin, diferentes
tcnicas pueden ser
empleadas para la Figura 1
cromatografa, tales
Columna
como HPLC (High
performance liquid
chromatography, FPLC Solvente
(fast protein liquid
chromatography), en
que varan la presin a
la que se administra la Acme Corp.
fase mvil, la 1
0
3
1
Bioqumica - Cromatografa 2
Un soporte muy comn es la celulosa, fcilmente hidratable pero que no permite elevados
flujos debido a su compresibilidad. Est compuesto de fibras de celulosa purificadas. Adems
de su compresibilidad, este soporte no es compatible con algunos solventes orgnicos ni
lcalis, que hidrolizan la celulosa.
De gran uso son las matrices derivadas de dextranos, de polisacridos diversos que pueden
ser mezclados con otros sustancias para dar diferentes caractersticas a la matriz. Se
presentas como microesferas porosas con diferentes tamaos de partcula y poro.
Ejemplos de stas son la Sepharose y el
Figura 2. Partculas de Sepharosa Sephadex. La primera est compuesta por
agarosa, un polmero lineal de residuos alternados
de D-Gal y 3,6 anhidro-L-gal. La agarosa es un
componente del agar, junto a la agaropectina. La
agarosa forma geles debido a la multiplicidad de
puentes H y es un excelente medio debido a su
biocompatibilidad. La tcnica de fabricacin permite
que se formen partculas esfricas, cuentas de
collar, de tamao ms o menos uniforme y alta
porosidad. El Sephadex, por su parte, es un
dextrano entrecruzado. Todos los dextranos son
susceptibles a valores extremos de pH, en especial
en el lado alcalino de la escala. Esto se debe a la labilidad de los enlaces glucosdicos a la
hidrlisis alcalina.
El Sephacryl se prepara por entrecruzamiento covalente de alildextrano con
N,N'metilenbisacrilamida, dando un gel rgido con resistencia a la compresin. El BioGel es un
polmero de acrilamida que es especialmente resistente a valores extremos de pH.
Cuando se requieren velocidades de flujo y presiones elevadas se utilizan matrices ms
rgidas, constituidas por polmeros
sintticos o slica.
Especialmente en soportes para
intercambio inico se usa poliestireno Fase mvil
entrecruzado con divinilbenceno, que
forma una estructura tridimensional
grande de forma esfrica.
Separacin en base al tamao.
Cromatografa de exclusin molecular Molculas pequeas: difusin
Direccin de flujo
(CEM) libre en la fase estacionaria
Figura 2
Las biomolculas de diferente naturaleza
y tamao pueden separarse en base a su
tamao en columnas de filtracin
molecular o filtracin en gel. Esta tcnica Molculas medianas:
se basa en las propiedades separativas difusin en una fraccin limitada
del soporte
de partculas esfricas, porosas, de
dimetro pequeo y ms o menos
constante. Las biomolculas que pasan a
travs de estos geles tienen a su
disposicin caminos de diferente longitud
de acuerdo con su tamao. As, las Molculas grandes:
exclusin de fase estacionaria
molculas pequeas capaces de penetrar
los poros de la matriz se vern retardadas
en comparacin con aquellas de mayor
tamao, que son excluidas del interior de
Figura 3. Cromatografa 2
de exclusin molecular
Bioqumica - Cromatografa 3
la partcula y por lo tanto vern su trnsito a travs de la columna acelerado. El tamao mnimo
que debe poseer una molcula para incluirse, entrar a los poros, se denomina lmite de
exclusin. P.ej. un lmite de exclusin de 106 significa que molculas con tamao mayor a 106
kDa no sern incluidas. Esta tcnica separa no solamente molculas muy grandes de
molculas muy pequeas, como en el ejemplo anterior, sino que adems permite la separacin
de molculas con tamaos parecidos. Esta ltima caracterstica hace que uno pueda calibrar
una columna con patrones de tamao (peso molecular) conocido, los cuales eluirn siempre en
la misma forma, y luego utilizar esta informacin para construir una curva de calibracin. La
cromatografa se realiza sembrando la muestra y eluyendo con un buffer de composicin
constante. 1
No se utiliza el volumen de elucin Figura 4
directamente sino el coeficiente de
particin, que es la relacin:
Abs 280
Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)
0.5
Donde:
Vo es el volumen vaco o de
exclusin, el espacio que queda
por fuera de las partculas del gel,
el nico disponible para las 0
Vo Ve1 Ve2
macromolculas que no se
incluyen en el gel.
Ve es el volumen de elucin de la macromolcula, medido en la altura mxima del pico
(ver Fig. 4)
Vt es el volumen total de la columna
400
angostas, de modo de maximizar el nmero 300 Figura 5
de platos tericos, una medida de su 200
capacidad de resolucin. Una limitacin de
esta tcnica es que el volumen sembrado 100
En este tipo de cromatografa, la matriz contiene un grupo cargado que puede interaccionar
con la macromolcula en estudio de forma de unirse a ella por interacciones electrostticas.
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Bioqumica - Cromatografa 4
Los grupos inicos se hallan unidos en forma covalente a la matriz. Por ejemplo, una protena
con punto isoelctrico menor a 7 o un cido nucleico estarn cargados negativamente a pH 7.0.
De esa manera, si se tiene una matriz con sustituyentes cargados positivamente, por ejemplo
una amina cuaternaria, las macromolculas se unirn a los sustituyentes con una fuerza
proporcional a la carga que detenten al pH al que se realiza la corrida y al nmero y naturaleza
de los sustituyentes presentes en la matriz. Dado que las protenas son iones multivalentes, las
resinas pueden ser de intercambio aninico o catinico, de acuerdo a la carga neta que
posean. Dependiendo de la macromolcula en estudio se usar una u otra. Los ms comunes
son:
Figura 7. Cromatograma obtenido en una CIO de una mezcla de protenas. Luego de la siembra se observa
un pico de Absorbancia (la tcnica de deteccin puede ser otra) que corresponde a la fraccin de protenas
que no se unen a la matriz. Luego de lavar con el mismo buffer de siembra hasta eliminar aquello que no se
une a la matriz, se comienza a elevar la fuerza inica en el buffer y se observa la aparicin de picos que
corresponden a macromolculas unidas. El primero es un pico doble que contiene al menos dos protenas que
eluyen a fuerzas inicas parecidas.
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Interaccin hidrofbica (CIH)
Figura 9
% buffer B
Abs 280 nm
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Activacin por tioles: tiene un espaciador de glutatin que permite unir a travs de
grupos tioles
Figura 11 NH
La elucin se puede realizar incrementando OH O C NHR
la concentracin de sal en el medio de CNBr Derivado de
lavado, por la adicin del ligando en forma tiourea
soluble (ms frecuente) o por cambios en el
pH de la solucin. RNH2
OH OH
La tcnica consiste en cargar la columna con el in metlico, p.ej. una solucin 1 M de Cl2Zn,
luego equilibrar con el buffer, cargar la muestra, y luego eluir con una solucin (o establecer un
gradiente) de EDTA, un quelante que secuestra el Zn y despega por tanto a la protena.
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Otros
Deteccin
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pueden detectarse por absorcin a 260 nm y las protenas tambin a 254 nm (enlace
peptdico). Los hidratos de carbono pueden detectarse haciendo uso de cambios en el ndice
de refraccin. Tambin pueden tomarse alcuotas de los tubos recogidos y hacer all la
determinacin de la concentracin de la macromolcula en cuestin ya sea por sus
propiedades pticas, por su actividad biolgica (actividad enzimtica) o por alguna reaccin
especfica (p.ej. por Coomassie en caso de protenas).
Con respecto a este parmetro, la administracin del solvente se puede realizar por gravedad
o con bombas. El primer caso es posible slo cuando el soporte es suficientemente laxo como
para permitir el flujo sin necesidad de presin adicional. En este caso entran la mayora de
medios cromatogrficos basados en Sephadex. En el segundo caso, pueden usarse equipos
totalmente automatizados que permiten variar el flujo en forma muy controlada y realizar
automticamente los gradientes. La velocidad de flujo est en estrecha relacin con la
resolucin de la tcnica, de modo que este punto se ampla en el siguiente apartado.
En general, se pretende que las corridas duren el menor tiempo posible para minimizar la
prdida de actividad biolgica, pero sin sacrificar la resolucin del mtodo.
La distribucin de las macromolculas en una columna durante la elucin hace que se detecten
a su salida de la columna como picos, 1
caracterizados por su altura y su anchura. Lo
ideal es que cada pico sea tan angosto como Figura 14
sea posible, para separarlo de sustancias
Abs 280
que eluyan en la vecindad. En la Fig. 14 se
observa una separacin completa de los
0.5
picos 1 y 2. Sin embargo, existe un
solapamiento de los picos 3 y 4 , por lo que
las fracciones intermedias entre ambos
contendrn ambos componentes, y
obviamente la purificacin no es en este 1 2 3 4
caso perfecta.
0
Dos procesos causan el ensanchamiento del
pico: la difusin y la turbulencia. La difusin Volumen
es el proceso por el cual la macromolcula, que se concentra en una banda a medida que se
separa de los otros componentes, tiende a difundir hacia atrs y adelante hacia zonas en que
su concentracin es menor. La difusin depende del tiempo, por lo tanto puede controlarse con
corridas cortas, aumentando la velocidad de flujo. Sin embargo, esto causar que el flujo
alrededor de las partculas no sea laminar, formndose turbulencias en el lado de la partcula
cercano a la salida que ensancharn el pico. Por otra parte, muchos soportes no aceptan
velocidades muy altas debido a que al aumentar el flujo aumenta la resistencia al avance y en
consecuencia la presin. Con ello la fase inmvil tiende a comprimirse, dificultando an ms el
flujo y aumentando mas la presin.
La turbulencia puede controlarse haciendo la partcula cada vez ms chica. A su vez, al achicar
la partcula se aumenta la superficie, aumenta el rozamiento con el solvente y esto hace que se
requiera ms presin para poder lograr un flujo determinado. Para esto se usa un equipo
especializado llamado HPLC (High performance liquid chromatography). En HPLC se utiliza un
sistema de bombas de alta precisin, capaz de entregar flujos muy precisos y constantes a
diferentes velocidades y a elevada presin. Este factor determina que se utilicen caeras y
columnas de acero u otros materiales capaces de soportar hasta 6000 psi (400 atm). Los
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soportes utilizados en HPLC tambin poseen caractersticas especiales para permitirles
soportar presiones elevadas. Uno de los materiales ms comunes es la slica, aunque tambin
se encuentran polmeros sintticos de alta resistencia.
El HPLC tiene usos como herramienta analtica pero tambin se puede trabajar en escala
preparativa.
La tcnica de FPLC es un intermedio entre los sistemas de baja presin y el HPLC. En este
caso tambin es posible controlar muy exactamente el flujo mediante un sistema de bombas de
precisin, pero el sistema est limitado a presiones medias, hasta un mximo de 5 MPa. Se
pueden acoplar columnas de diverso tamao y con una variedad de soportes ms amplia que
en el caso del HPLC, aunque no se alcanza la misma resolucin. Su uso se inclina ms a la
parte preparativa (purificacin de protenas, pptidos y ac. nucleicos) que a la analtica.
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