LAS SORPREDENTES DINMICAS DE MIGRACIN Y TAMAO

EN LA POBLACIN DEL VIEJO OSO PARDO IBRICO

Cristina Valdiosera, Jos Luis Garca-Garitagoitia, Nuria Garca, Ignacio Doadrio;

Mark G. Thomas, Catherine Hnni, Juan-Luis Arsuaga, Ian Barnes, Michael Hofreiter,
Ludovic Orlando, and Anders Gtherstm

Las poblaciones en peligro de extincin en la Pennsula Ibrica estaban consideradas

como los ltimos fragmentos de las poblaciones de Oso Pardo que recolonizaron
amplias zonas de Europa durante el Pleistoceno. Los esfuerzos de conservacin son
intensos y los resultados se siguen de cerca. Sin embargo, el esfuerzo se basa en la
asuncin de que el Oso Ibrico es una especie nica que evoluciono localmente
durante largo tiempo. Hemos obtenido la secuencia mitocondrial del DNA de los restos
de un viejo Oso Ibrico y lo hemos analizado como una serie de datos, siguiendo los
cambios en la diversidad y existencia de los grupos genticos europeos a lo largo del
tiempo. Usando estos datos, se consigue demostrar que la poblacin ibrica de oso ha
experimentado una historia dinmica evolutiva reciente. La poblacin no solo ha
sufrido el flujo gentico mitocondrial de otros osos europeos, sino que tambin su
tamao efectivo ha fluctuado sustancialmente. Sacamos como conclusin que la
poblacin ibrica de oso pardo ha sido una unidad evolutiva, desarrollada a partir de
evolucin gentica de otras poblaciones y cuellos de botella en las poblaciones, lejos
de tener un equilibrio gentico o estar aisladas de otras poblaciones de oso pardo. As,
la situacin actual es altamente inusual y la poblacin puede ser que est aislada por
primera vez en su historia.

El oso pardo est incluido en la lista de la Unin Internacional para la Conservacin

de la Naturaleza y Recursos Naturales como una especie en peligro de extincin. La
especie ahora mismo se distribuye a lo largo de tres continentes distintos: Asia,
Europa y Norteamrica. Las reas de distribucin se han reducido drsticamente en la
historia reciente. Por ejemplo, en los Estados Unidos, la poblacin se ha reducido en
un 75% en solo un siglo, debido en su mayora a la reduccin de su hbitat. Aunque
est presente de forma abundante en Alaska y Canad y en otro tiempo ocupando
mucho de lo que es hoy Estados Unidos y norte de Mxico, quedan pocos osos en
algunas reas del Norte de Estados Unidos y la especie esta extinguida en Mxico.
Como en Amrica, el oso pardo es abundante en las zonas del norte de Europa, pero
ha sido reducida a pequeas y fragmentadas poblaciones en el sur de Europa. La
mayora de las poblaciones del sur de Europa estn en peligro de extincin. Italia
alberga dos poblaciones aisladas en alto riesgo de extincin y la situacin es similar en
Grecia, los Pirineos y Espaa. La poblacin Pirenaica se redujo a cinco o seis
ejemplares segn las estimaciones de los aos ochenta. Se han hecho dos
reintroducciones desde el 1993, llevando ejemplares de la reserva de Kocevje en
Eslovenia. Las montaas Cantbricas en el norte de Espaa, donde quedan dos
poblaciones, representan el lmite sur-occidental de la presencia del oso en Europa.
Estas dos pequeas poblaciones estn geogrficamente aisladas, la del este con solo
25-30 ejemplares y la occidental con unos 120. Algunas de estas poblaciones
fragmentadas han sido definidas como simples unidades de conservacin. Las
poblaciones cantbricas estn en alto riesgo de extincin y la situacin de los osos
pirenaicos es aun peor.

Aunque hoy da amenazado en el sur de Europa y extinguido de amplias reas de

Centroeuropa, el oso pardo ha sido una parte integral de la fauna europea durante al
menos el ultimo medio milln de aos. Estudios de ADN mitocondrial de las
poblaciones que quedan los dividen en dos linajes, el oriental y el occidental, con la
rama occidental subdividida a su vez en dos ramas, una que comprende los osos
desde los Pirineos, el sur de Suecia y Espaa y la otra los de Italia y los Balcanes. Las
poblaciones Cantbricas son las nicas en las cuales la diversidad gentica no ha sido
alterada por el hombre mediante reintroducciones de osos provenientes de otras
poblaciones. Los dos grupos occidentales se cree que se originaron desde dos
reductos ancestrales de las glaciaciones. El linaje oriental se cree que se expandi
desde otro reducto ubicado en los Crpatos.

El oso pardo ibrico se cree que quedo aislado durante extensos periodos de
tiempo y supuestamente fue el origen de recolonizaciones en Europa despus de
mltiples glaciaciones, incluyendo los ltimos mximos en las glaciaciones (LGM),
hace entre 23 y 18 mil aos. El caudal gentico en la pennsula ibrica se considero de
menor importancia porque el supuesto tamao de las ancestrales poblaciones, en
combinacin con la extincin del oso en las poblaciones de las regiones limtrofes a la
Pennsula Ibrica, excluira contribuciones externas. As que, el oso pardo ibrico
parece haber ocupado de forma continua la pennsula y posiblemente haberse
adaptado a las condiciones locales al menos desde el Pleistoceno. Si este es el caso,
la conservacin del oso ibrico es importante, no solo para la pennsula, sino para
Europa entera, para la cual ha servido como reducto de recolonizacin pos-glacial. Sin
embargo, algunos recientes estudios sugieren que la amplitud del caudal gentico,
suponiendo que proviene de material contemporneo, puede haber sido subestimado
y hay evidencias de que esto es tambin verdad para los verdaderos osos ibricos. De
hecho, el oso ibrico puede haber sido parte de una continua poblacin europea,
aunque aislada en distancia, incluso durante el LGM. Para investigar este extremo
ms profundamente, analizamos secuencias de ADN de osos viejos y modernos.
Usamos estas series de datos para identificar cambios potenciales en el tamao de las
poblaciones, estimar el caudal gentico e investigar la diversidad gentica de la
poblacin ibrica desde el Pleistoceno hasta su actual, aunque reducido, tamao.

RESULTADOS

Afinidades genticas de la poblacin espaola. Amplificamos y secuenciamos

exitosamente ADN mitocondrial de un total de 14 osos usando 20 muestras fsiles y
subfsiles. La serie de datos contena secuencias de viejos osos pardos ibricos, de
las cuales algunas eran de lugares que haban previamente almacenado ADN. Una
muestra fue identificada como de Ursus spelaeus. De las 13 restantes, 4 formaban
una secuencia de 115 bp, mientras que 9 formaban una secuencia de 177 bp (en las
posiciones 1658916650, 1672816792, and 1680016849 de genoma de ADN
mitocondrial del oso pardo, entrada n AF303110). Adems, 24 muestras de osos
pardos modernos (de 177 bp largo, entradas numero EU400184-EU400206) se
obtuvieron de muestras de pelo mudado de la poblacin actual de la Cordillera
Cantbrica en el norte de Espaa. No se detecto contaminacin en ninguno de los
controles negativos que se usaron durante el proceso de extraccin y amplificacin,
Para incluir todo el conjunto de los datos generados en el proceso, creamos dos
grupos de datos, que se extendan 177 bp y 115 bp de la zona de control mitocondrial
(a los que nos referiremos ms abajo como el grupo largo y el corto, respectivamente).
En nuestros anlisis, tambin incluimos halotipos de Oso Pardo Europeo disponibles
en bancos genticos. En conjunto, los grupos largo y corto comprendan 67 y 71
secuencias de oso pardo respectivamente. Todos los anlisis se hicieron usando los
dos grupos de datos independientemente y ofrecieron similares resultados. Obtuvimos
un rbol filogentico de la serie larga (Figura 1), para maximizar la resolucin y
construimos una mnima red expandida usando la serie corta, para visualizar los datos.

La filogenia se estimo con la serie larga usando un grupo muy relacionado (la del
Ursus spelaeus). Aunque sin resolver parcialmente, tiene una topologa similar a
aquella publicada previamente usando series de ADN mitocondrial tanto de osos
existentes como extinguidos. En nuestro rbol, identificamos 3 ramas principales
estadsticamente. Una rama comprende secuencias modernas orientales (Rusia) junto
con los osos ibricos del Pleistoceno, los osos austriacos y un oso alemn del
Holoceno. Otra rama comprende un grupo de halotipos extinguidos, antes descrito
como una colonia del Holoceno en el sur de Francia. La tercera rama se pensaba
previamente que representaba dos grupos monofilicos (ibricos e italianos/balcnicos).
Aunque nuestro rbol nos hace suponer estas dos ramas como grupos monofilicos, no
encontramos argumentos para demostrarlo. Esta ltima rama comprende secuencias
modernas y antiguas. Advertimos que las poblaciones ibricas no entran todas en esta
ltima rama, lo que sugiere diferenciacin gentica entre los halotipos del Pleistoceno
y del LGM.

La red de menor extensin se construy usando un total de 29 halotipos (Figura

1B). Las muestras de los lugares de Arlanpe y Valdegoba muestras halotipos muy
divergentes, junto con los datos publicados previamente de Atapuerca, la Gruta
Beatrice Cinci (Italia) y Muhlberg (Alemania).

Fig. 1. Diversidad gentica antigua y actual. (A), Filogenia Bayesiana generada usando secuencias
de oso pardo europeo antiguo y actual (serie larga) y tres osos de cuevas. Los valores de muestreo se
indican encima del nudo y las probabilidades posteriores se muestran debajo del nudo. El color de cada
cuadro representa el origen, el nmero en itlica indica en halotipo y la n es la frecuencia del halotipo.
(B), Red mnima de expansin indicando la distribucin del halotipo de las secuencias de oso antiguo y
moderno (serie corta). Los nmeros en los crculos indican el halotipo asignado de un total de 29 halotipos
obtenidos.
 Se hicieron anlisis de la varianza molecular (AMOVAs) sobre las series larga y
corta para probar las evidencias del aislamiento de las poblaciones espaola y las del
resto de Europa. A destacar que encontramos niveles significativos de subestructuras
geogrficas en las poblaciones actuales y del Holoceno (serie larga: FSTcurrent _
0.5169, P _ 10_5; FSTHolocene _ 0.3391, P _ 10_4; serie corta: FSTcurrent _ 0.4540,
P _ 10_5; FSTHolocene _ 0.3345, P _ 10_5), pero no en el Pleistoceno (serie larga:
FSTPleistocene _0.17691, P _ 0.1723; serie corta: FSTPleistocene _ 0.1505, P =
0.1885). Los resultados hacen imaginar que el flujo gentico entre Europa y Espaa
fue mayor durante el Pleistoceno que en periodos ms recientes (tanto en tiempos
recientes como en el Holoceno). Estas observaciones se tienen que considerar como
preliminares, debido a que el nmero de halotipos disponibles de periodos antiguos es
limitado y a que la poblacin Ibrica parte claramente del supuesto de que su tamao
es constante, lo que es un prerrequisito para clculos exactos de FST (ver debajo).

Tabla 1. Sumario de estadsticas y test de neutralidad para las diferentes poblaciones de oso

pardo

L, nt Population N N Haplo. Npoly. H Nucleotide diversity Tajima D D(P value) FS FS(P value)

Long

176 Spain, present 27 5 6 0.2792 _ 0.1118 0.276% _0.273% -2.099 0.001* -2.154 0.029*

177 Spain, Holocene 10 5 9 0.6667 _ 0.1633 1.339% _ 0.899% -1.473 0.070 -0.479 0.319

177 Spain, Pleistocene 5 4 20 0.9000 _ 0.1610 8.921% _ 5.631% -0.616 0.365 1.395
0.708

177 Spain, ancient 15 9 30 0.8476 _ 0.0878 6.746% _ 3.627% -0.681 0.274 0.168 0.556

177 Europe, present 11 8 22 0.9273 _ 0.0665 8.273% _ 4.532% 0.870 0.849 -0.005
0.464

177 Europe, Holocene 11 8 26 0.9273 _ 0.0665 6.190% _ 3.442% -0.718 0.244 -0.431
0.382

177 Europe, Pleistoc 4 4 17 1.0000 _ 0.1768 7.664% _ 5.237% -0.117 0.609 0.232
0.321

177 Europe, ancient 15 12 27 0.9619 _ 0.0399 6.599% _ 3.552% -0.211 0.477 -2.828 0.098

Short

114 Spain, present 27 5 5 0.2792 _ 0.1118 0.355% _ 0.377% -2.010 0.003* -2.530 0.013*

115 Spain, Holocene 14 6 8 0.7473 _ 0.1114 1.625% _ 1.109% -1.284 0.108 -1.474 0.137

115 Spain, Pleistoc 5 4 13 0.9000 _ 0.1610 8.358% _ 5.408% -0.279 0.484 0.780
0.560

115 Spain, ancient 19 10 19 0.8596 _ 0.0696 4.917% _ 2.757% -0.962 0.145 -1.774 0.186

115 Europe, present 11 8 15 0.9273 _ 0.0665 8.002% _ 4.499% 0.698 0.803 -1.014
0.263

115 Europe, Holocene 11 8 18 0.9273 _ 0.0665 6.177% _ 3.543% -0.825 0.233 -1.452
0.189

115 Europe, Pleistoc 4 4 11 1.0000 _ 0.1768 7.563% _ 5.293% 0.000 0.661 0.255
0.553

115 Europe, ancient 15 12 19 0.9619 _ 0.0399 6.598% _ 3.658% -0.396 0.360 -4.531 0.009

Diversidad gentica de la poblacin espaola. Usando secuencias de ADN de

24 osos ibricos modernos y 13 antiguos, en combinacin con las secuencias
publicadas de siete osos ibricos antiguos y uno moderno (ver SI en la figura 3),
somos capaces de determinar el grado de diversidad gentica en la pennsula a travs
de los tiempos, desde el Pleistoceno hasta aqu. Para probar si los cambios en la
diversidad muestran desarrollos paralelos en el resto de Europa, hicimos anlisis
similares para las muestras de poblaciones no ibricas, aprovechando los halotipos
expuestos con anterioridad (4, 18-20, 23). Merece la pena indicar que la diversidad
gentica de la poblacin de oso pardo espaol decrece continuamente desde el
Pleistoceno hasta los tiempos recientes (tablas 1). El modelo se observa para las
diferentes estadsticas que usamos como estimacin de la diversidad gentica (S, H y
diversidad nucletido). Tal modelo no se observa en el mismo grado en la poblacin
europea, lo que sugiere que la reduccin de la diversidad gentica entre el Pleistoceno
y hoy en da es especifica de la poblacin espaola. Tal situacin puede haber sido el
resultado del reciente cuello de botella demogrfico, seguido de una expansin en la
poblacin, como se sugiere del significativo valor estadstico negativo Tajima D y Li en
la poblacin existente (Tablas 1).

Continuamos estimando el parmetro de mutacin de la poblacin, , y usado esto

en combinacin con las estimaciones de la tasa de mutacin para deducir el tamao
efectivo (ver Materiales y mtodos) de la poblacin actual de oso pardo espaol y la
del Holoceno y Pleistoceno (SI tabla 2; hay que recordar que tales valores han sido
probablemente sobreestimados porque no todas las muestras del Holoceno y del
Pleistoceno son de la misma edad). Primero, calculamos dos estimadores (s y ).
Merece la pena hacer notar que aunque estos dos valores permanecen constantes
para la poblacin europea a lo largo de los tres periodos de tiempo distintos, decrecen
sobre el 60-85% post LGM (transicin Pleistoceno/Holoceno) y en un 48-80% ms de
reduccin en tiempos recientes (del Holoceno a tiempos actuales). Estos resultados
sugieren dos cuellos de botella sucesivos que afectaron a la poblacin de oso pardo
en Espaa en la transicin Holoceno-Pleistoceno (hace unos 10.000 aos) y durante
los ltimos 350 aos (ya que el halotipo mas reciente considerado como un miembro
de la poblacin del Holoceno es de unos 350 aos ms antiguo en nuestras series de
datos, ver Materiales y Mtodos). Un patrn similar se obtiene si el parmetro es
estima usando una cadena combinada de muestreo gentico de Markov-Montecarlo
(MAMARC 2.0) en un mximo de probabilidad en el marco Bayesiano, excepto que
notamos una reduccin positiva de la poblacin de oso europeo al final del Holoceno
(SI Tabla 3). Por consiguiente, lo ms probable es que cambios en son indicativos de
una reduccin del 54-69% en el tamao efectivo del oso pardo en Espaa post-LGM y
del 20-31% de reduccin en tiempos recientes.
 Se hicieron simulaciones de series combinadas para probar si los cambios en las
diversidades genticas en ambas transiciones se pueden observar bajo un modelo de
tamao constante de la poblacin. (Figura 2, SI, fig 4 y SI tablas 4-9). Es interesante
observar que no fue posible detectar un cambio igual o mayor que el que se observa
del Holoceno a hoy en da en ms de un 5% de nuestras simulaciones de series
combinadas, en tanto que el tamao efectivo era mayor en unos 500-1000 ejemplares
(SI tablas 4 y 5). Por otra parte, un cambio similar a lo que se observa post-LGM
(transicin Pleistoceno-Holoceno) aparece en ms del 5% de nuestras simulaciones
de series combinadas solo para tamaos efectivos por debajo de 5000-10000
individuos o 10000-15000 individuos, dependiendo de la tasa de mutacin que
consideremos (rpida y lenta, respectivamente; SI tablas 4 y 5).

Discusin

Presentamos una serie de datos de secuencias de ADN mitocondrial del 177bp y

115bp, respectivamente, que varan en edad desde el Pleistoceno hasta la actualidad.
Aunque son pequeos fragmentos, nos aportan datos suficientes para tener una una
idea de la importancia estadstica en un abanico de anlisis. Los resultados indican un
posible cambio en el tamao de la poblacin desde el Pleistoceno y la presencia de
halotipos del linaje oriental en Iberia durante la Prehistoria.

Bajo las hiptesis tradicionales de refugio glacial (4, 17), la estructura filogeografica
del oso pardo actual deriva del refugio glacial ancestral: el linaje occidental que se
origina desde Iberia, Italia y los Balcanes y el linaje oriental posiblemente derivado de
un refugio en los Crpatos (14, 16). En contraste con ese estricto modelo de refugio,
pero en concordancia con una poblacin prehistrica europea continua de oso pardo
ibrico desde Arlanpe (Pas Vasco) que pertenece a la estirpe oriental. En nuestros
anlisis, tales asignaciones filogeograficas se basan en probabilidades posteriores
mximas (Fig 1, A). Este patrn se basa despus en tres secuencias de oso pardo del
Pleistoceno de Valdegoba (norte de Espaa) cuyo grupo con una secuencia publicada
previamente de Atapuerca (norte de Espaa) y con varias secuencias de osos
modernos italianos y de los Balcanes.
 Fig. 2. Cambios en la diversidad gentica entre diferentes perodos, asumiendo un tamao
constante de la poblacin. Tasa de mutacin: 29,8% reemplazo por lugar por milln de aos (A) y 10,0%
de reemplazo por lugar por milln de aos (B). Los colores hacen referencia a la proporcin de
simulaciones que llevan al correspondiente aumento en la diversidad gentica. Trece posibles tamaos
efectivos se simularon (100, 500, 1,000, 2,000, 5,000, 10,000, 15,000, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000,
40,000, and 45,000 individuos). Las lneas rojas indican cambios observados en la diversidad gentica
(serie larga)

Adems, AMOVAs sugieren pequeas subestructuras geogrficas entre las

poblaciones de oso ibrico y las europeas del Pleistoceno. Estos nuevos datos
confirman la falta de discontinuidad filogentica en el oso europeo despus de la LGM.
Aunque las poblaciones espaolas y europeas del Holoceno, aparecen
geogrficamente diferenciadas en nuestros AMOVAs, un estudio reciente ha sugerido
que el flujo gentico pudo haber continuado desde el Pleistoceno al Holoceno. Un oso
pardo ibrico, datado de la poca de la LGM en Atapuerca, Burgos, en el norte de
Espaa, estaba ms relacionado con los osos italianos y balcnicos que con los
propios ibricos. Es ms, durante el Holoceno, en el Mont Ventoux (sur de Francia) se
han encontrado tres grupos mitocondriales entre 1.570 y 6525 aos: uno perteneciente
al grupo ibrico, otro al italiano/balcnico y un tercero no asociado a ninguno de los
tres refugios principales glaciares. Resalta, sin embargo, que el apoyo de las ramas
espaola e italo/balcnicas son bajas en nuestro rbol. En este estudio, hemos
encontrado tres individuos diferentes de Valdegoba, un lugar en Burgos del
Pleistoceno tardo, que casa con el grupo de la muestra de Atapuerca.
 Nuestros datos tambin indican que el tamao de la poblacin ha variado
significativamente a lo largo del tiempo. La cada en la poblacin en los ltimos siglos
(XV-XX) est bien documentada y tambin es visible en nuestros anlisis de diversidad
gentica. Sin embargo, hay un posible aumento en el tamao de la poblacin en la
transicin del Pleistoceno al Holoceno, como viene indicado por cambios en el valor en
el tiempo de las distintas estimaciones . Este aumento es estadsticamente
significativo, asumiendo rangos de poblacin efectivas (de ms de entre 2 y 10 mil o
mayor de 10 a 15 mil, considerando la rapidez o lentitud de las tasas de mutacin,
respectivamente).

Consideramos que tal tamao de poblacin es probable por los siguientes motivos.
Usando una tasa de mutacin rpida, estimamos que la poblacin de oso espaol
habra llegado a una media de entre 7,3 y 12 mil ejemplares (dependiendo de las
muestras tomadas y del mtodo de estimacin: tabla 1 y SI tabla 2). Asumiendo tales
poblaciones efectivas (de unos 10 mil individuos), solo un porcentaje despreciable
(0,8% y 0,0% de las muestras largas y cortas, respectivamente) de las simulaciones
en serie pueden replicar el aumento observado en la diversidad gentica en la
transicin Pleistoceno/Holoceno sin cambio efectivo en los tamaos de las poblaciones
(SI tablas 4 y 5). Lo mismo es vlido para el caso de la tasa de mutacin lenta, ya que
entre el 0,6 y el 0,9% de las simulaciones en serie nos llevan al aumento observado en
la diversidad gentica en la transicin Pleistoceno/Holoceno, asumiendo volmenes
efectivos constantes de entre 25 y 35 mil individuos (21.818 a 35.686; SI tablas 4 y 5).
Adems, debe hacerse notar que el volumen de poblacin efectivo en el Pleistoceno
no se refiere solamente a la poblacin espaola, ya que hemos demostrado un flujo
gentico significativo entre los osos espaoles y los europeos tanto orientales como
occidentales durante el Pleistoceno. Aadir que las diferentes estimaciones para la
poblacin espaola estn en el rango de lo que se observa para la poblacin europea
considerada en su conjunto (tabla 1 y SI tabla 2). Por lo tanto, la poblacin efectiva es
probable que fuese grande y en torno a mas de 26 mil ejemplares (el mnimo del 95%
del rango de confianza, estimado en Saarno et al).

Fuentes histricas y paleontolgicas nos dan mas informacin acerca de los

cambios en el rango del hbitat del oso y por lo tanto, podemos usarlas como
herramientas adicionales para deducir el tamao de las poblaciones. Tan reciente
como en el siglo XIV, el oso habitaba la mayora de las montaas y los bosques de la
pennsula ibrica. Su hbitat variaba desde el macizo gallego-portugus, hasta los
bosques de Andaluca en el sur de Espaa, donde ya no existen, y hasta las montaas
cantbricas y los Pirineos, donde aun hoy habitan. El uso de armas de fuego para la
caza desde el siglo XVI, entre otras actividades humanas, puede haber sido el motivo
de la reduccin de la extensin de su hbitat, restringiendo al oso pardo a la franja
norte de Espaa, sobre el siglo XVIII.