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Proteccin de cultivos

Deteccin por PCR de Colletotrichum lindemuthianum en


cultivos y semillas de frijol en Antioquia, Colombia
PCR detection of Colletotrichum lindemuthianum in seeds and crops of common
bean from Antioquia, Colombia

Leonardo Martnez Pacheco1, Katherin Vanegas Berrouet2, Mauricio Salazar Yepes2,


Pablo Gutirrez Snchez1 y Mauricio Marn Montoya1
1
Universidad Nacional de Colombia sede Medelln, Facultad de Ciencias, Laboratorios de Microbiologa Industrial y Biologa
Celular y Molecular, Colombia. 2 Universidad Nacional de Colombia sede Medelln, Museo Micolgico-MMUNM. Autor para
correspondencia: mamarinm@unal.edu.co

Rec.: 13.02.2014 Acep.: 05.06.2014

Resumen
Colletotrichum lindemuthianum, agente causal de la antracnosis del frijol, es uno de los patgenos ms
limitantes en la produccin de este cultivo. La deteccin y correcta identificacin de este hongo resulta
fundamental para el manejo de la enfermedad, siendo las pruebas moleculares alternativas rpidas y
sensibles para este fin. Mediante la tcnica de PCR se evaluaron cuatro juegos de cebadores (CY1/CY2,
CD1/CD2, ClF4/ITS4 y ClF432/ClR533) para la deteccin de C. lindemuthianum a partir de tejidos
foliares, de vainas y de semillas procedentes de cultivos de frijol de Antioquia, Colombia. Los resultados
indicaron que el par CD1/CD2, dirigido al pseudogen de permeasa de hierro Ftr1, fue el ms efectivo
para detectar el hongo en tejidos y semillas de frijol, as como para identificar aislamientos en cultivos
microbiolgicos. Para los cebadores CY1/CY2, dirigidos a los ITS del rDNA, se recomienda un esquema
de PCR-RFLPs con MseI (=Tru1I) para la diferenciacin con las especies C. orbiculare y C. trifolii. Estos
cebadores generaron resultados consistentes cuando se utilizaron en combinacin con ITS1 (ITS1/CY2)
e ITS4 (CY1/ITS4). Finalmente, los cebadores ClF4/ITS4 resultaron en amplificaciones inespecficas y
ClF432/ClR533 en fragmentos de difcil resolucin en electroforesis de agarosa. Este estudio servir
de apoyo para los programas de certificacin de semilla y mejoramiento gentico de frijol.
Palabras clave: DNA ribosomal, antracnosis, permeasa de hierro, Phaseolus vulgaris, RFLPs.

Abstract
Colletotrichum lindemuthianum, the causal agent of anthracnose in common bean, is one of the most
important pathogens of this crop around the world. Accurate detection and identification of this fungus
is of paramount importance for adequate management of this disease; in this respect, molecular tests
are the fastest and most sensitive methods. In this work, the usefulness of four primer sets (CY1/CY2,
CD1/CD2, ClF4/ITS4 and ClF432/ClR533) for PCR detection and identification of C. lindemuthianum
was evaluated using leaf, pod and seed tissues of common bean crops from Antioquia, Colombia. The
results suggest that primers CD1/CD2, targeting iron permease pseudogen Ftr1, were the most effective
in detecting DNA from both microbiological isolates and infected bean tissues, including seeds. In the
case of primers CY1/CY2 targeting the rDNA ITS region, a PCR-RFLP strategy is recommended using MseI
(=Tru1I) to differentiate C. lindemuthianum from C. orbiculare and C. trifolii. These primers produced bet-
ter results when combined with universal primers ITS1 (ITS1/CY2) and ITS4 (CY1/ITS4). Primers ClF4/
ITS4 were non-specific while ClF432/ClR533 result in bands with poor resolution in agarose gels. This
study will serve as support of seed certification and genetic improvement programs in common bean.
Key words: Anthracnose, Iron permease, PCR, Phaseolus vulgaris, RFLPs, Ribosomal DNA.

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Introduccin genotipos identificados con marcadores mo-


leculares como RAMS, RAPDS, Rep-PCR y
Colletotrichum lindemuthianum (Sacc. & Mag-
AFLPs (Balardin et al., 1997; Mahuku y Rias-
nus Briosi & Cavara) causa la antracnosis del
cos, 2004; Damasceno e Silva et al., 2007).
frijol (Phaseolus vulgaris L.), una de las enfer-
Ya que este hongo se dispersa princi-
medades ms limitantes en la produccin de
palmente por residuos de cosecha y semilla
este cultivo en el mundo. Esta enfermedad
sexual (Melotto et al., 2000; Schwartz et al.,
ocasiona prdidas de rendimientos de hasta
2005) es fundamental disponer de sistemas
el 95%, especialmente cuando se cultivan
de deteccin altamente sensibles y especfi-
variedades de frijol susceptibles al patgeno
cos. Los mtodos basados en PCR, conven-
en regiones con altos niveles de humedad,
cional o en tiempo real, son ideales para este
temperaturas moderadas y precipitaciones
fin, ya que son rpidos, precisos y presentan
frecuentes. Esto ocurre en los Andes colom-
altos niveles de sensibilidad (Chen et al.,
bianos, donde se siembran principalmente 2007; 2012; Wang et al., 2008).
las variedades Radical y Cargamanto (Pas- Colletotrichum lindemuthianum es parte
tor-Corrales y Tu, 1989; Fenalce, 2010). La de un complejo de especies cercanas que in-
siembra de frijol en Colombia se extiende a cluyen a C. orbiculare (Berk. y Mont.) Arx y
120,000 ha, siendo el departamento de An- C. trifolii Bain (Liu et al., 2007) cuya relacin
tioquia uno de los principales productores filogentica fue recientemente confirmada por
con cerca de 26,000 ha (Santana y Mahuku, Cannon et al. (2012). Esto puede representar
2002; Fenalce, 2010). problemas para la deteccin molecular espe-
El hongo afecta principalmente la calidad cfica de los hongos pertenecientes a dichas
de las vainas de frijol, al inducir lesiones car- especies, debido a que sus genomas pueden
nosas oscuras que se transforman en chan- presentar secuencias idnticas en las regiones
cros hundidos con centros de color salmn; de unin de los cebadores utilizados en las
pero tambin afecta pecolos y tallos (Chaves, pruebas de PCR. En este trabajo se evalu la
1989; Schwartz et al., 2005). Las semillas utilidad de cuatro juegos de cebadores para la
pueden presentar decoloracin, aunque es deteccin especfica de C. lindemuthianum a
frecuente que aun estando infectadas se pre- partir de tejidos foliares, vainas, semillas de
senten asintomticas (Melotto et al., 2000). frijol y aislamientos microbiolgicos obtenidos
El manejo de la antracnosis del frijol se en cultivos de frijol en el Departamento de
fundamenta en la utilizacin de semilla cer- Antioquia, Colombia.
tificada libre del patgeno, control qumico
con fungicidas sistmicos y protectantes y la
Materiales y mtodos
siembra de variedades resistentes. Este lti-
mo aspecto es fundamental para el manejo de Obtencin de muestras
la enfermedad, especialmente en sistemas de Se realizaron recolecciones de tejidos foliares,
produccin con pequeos productores, donde vainas y semillas de frijol de la var. Carga-
el acceso a semilla comercial y fungicidas manto, con y sin sntomas de antracnosis
es muy limitado por motivos econmicos y (Foto 1C), provenientes de seis diferentes re-
ambientales. La generacin de variedades giones cultivadoras de Antioquia, Colombia
de frijol con resistencia duradera a C. linde- (Cuadro 1). En 10 de las muestras se realiz
muthianum es difcil de lograr, debido a los un aislamiento inicial de C. lindemuthianum,
altos niveles de variabilidad gentica y pato- con el fin de evaluar los cebadores por PCR.
gnica del hongo, del cual hasta el momento Los tejidos se desinfestaron en una solucin
se han identificado ms de 100 razas en el de hipoclorito de sodio al 1% durante 1 min,
mundo (Apostolos et al., 2009; Pinto et al., posteriormente se lavaron con agua destilada
2012). Los estudios de diversidad gentica estril y se procedi al aislamiento del agente
de C. lindemuthianum han confirmado los causal en medio de cultivo Papa Dextrosa
altos niveles de variacin intra-especfica del Agar (PDA) suplementado con penicilina y
patgeno, aunque es frecuente que se reporte tetraciclina (100 mg/lt). Los cultivos se in-
la ausencia de relacin entre los patotipos y cubaron a temperatura ambiente (20 - 24C)

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Deteccin por PCR de Colletotrichum lindemuthianum en cultivos y semillas
de frijol en Antioquia, Colombia

Cuadro 1. Municipios de Antioquia donde se recolectaron muestras de tejidos y semillas de frijol var. Cargamanto para la
deteccin por PCR de Colletotrichum lindemuthianum.
Recoleccin Municipio Coordenadas Altitud
(no.) (m.s.n.m.)
1 El Carmen de Viboral 060506N 752019O 2150
Guarne 061650N 752637O 2150
Rionegro 060919N 752225O 2125
2 Sonsn 054244N 751850O 2475
3 Santa Rosa de Osos 063851N 752737O 2475
Belmira 063618N 753958O 2500
4 San Vicente Ferrer 043451N 740820O 2150
5 Urrao 061855N 760803O 1800
6 Marinilla 061036N 752021O 2120

durante 5 - 7 das. En el momento en que se ml). La concentracin y pureza del DNA ob-
observaban colonias presumiblemente perte- tenido se determin por lecturas a 260 nm
necientes a C. lindemuthianum ,se confirm y 280 nm (260 nm/280 nm) en un equipo
su identidad morfolgica por microscopa y Nanodrop 2000C (Thermo, EEUU).
se realizaron repiques a nuevas cajas con
medio PDA. Adicionalmente, se realiz una PCR y secuenciacin
nueva salida de recoleccin a cultivos de frijol Inicialmente, se confirm la identidad taxo-
del municipio de El Carmen de Viboral con el nmica de 10 aislamientos del hongo proce-
fin de evaluar la utilidad de los cebadores en dentes de las diferentes regiones cultivadoras
la deteccin directa del patgeno a partir de de frijol en Antioquia (Cuadro 2). Para ello
DNA de muestras foliares, vainas y de semi- se realiz la amplificacin por PCR y se-
llas procedentes de vainas con y sin sntomas cuenciacin posterior de las regiones ITS del
de antracnosis. rDNA, utilizando los cebadores universales
ITS1 (5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3) e
Extraccin de DNA ITS4 (5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3) y el
El DNA de cada aislamiento fue obtenido uti- procedimiento estndar descrito por White
lizando el mtodo del CTAB 3X (Doyle y Doyle, et al. (1990). Posteriormente, este grupo de
1990). Tambin se utiliz el Kit comercial aislamientos fue utilizado para evaluar por
DNeasy Plant Mini kit (Qiagen, Alemania) PCR los cebadores especficos para C. linde-
para extraer el DNA directamente de tejidos muthianum: CY1CY2 (CY1: 5-CTTTGTGA-
de frijol. La integridad del DNA se determin ACATACCTAACC-3; CY2: 5-GGTTTTACGG-
por electroforesis en gel de agarosa al 0.8%, CAGGAGTG-3), CD1 CD2 (CD1: 5-ACCT-
suplementado con bromuro de etidio (10 mg/ GGACACATAAGTCAAAG-3; CD2: 5-CAA-

Cuadro 2. Parte de planta, procedencia y amplificacin de diez aislamientos de Colletotrichum lin-


demuthianum de Antioquia (Colombia) inicialmente evaluados en el estudio.
Aislamientos Parte planta y Amplificacin con
procedencia CD1/CD2 -CY1/CY2
L3 Vaina, Marinilla +/+
L6 Vaina, Marinilla +/+
L20 Vaina, Urrao +/+
L21 Vaina, Urrao +/+
L59 Fololo, Guarne +/+
L70 Fololo, Belmira +/+
L79 Fololo, Sonsn +/+
L80 Fololo, Sonsn +/+
L83 Vaina, Guarne +/+
L84 Fololo, Rionegro +/+

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CAATGCCAGTATCAGAG-3) (Wang et al., partir del DNA de otros 50 aislamientos de


2008), ClF4/ITS4 (ClF4: 5-TCCCCCCTGCCC- C. lindemuthianum obtenidos en el estudio.
CGCTCG-3) (Chen et al., 2007); ClF432/ En adicin, se evalu la utilidad de los ceba-
Cl R533 (ClF432: 5- GGAGCC T CC T T T- dores para la deteccin directa del patgeno
GCGTAGTAAC-3; ClR533: 5-ACCTGATCC- en 15 muestras de tejidos foliares, 15 de
GAGGTCAACCTTGTT-3) (Chen et al., 2012), tejidos de vainas y 30 de semillas de frijol.
siguiendo las condiciones descritas por sus Las condiciones de PCR y electroforesis fue-
autores. Los amplicones del tamao esperado ron similares a las descritas anteriormente,
se purificaron directamente del gel mediante utilizando como controles positivos DNA de
el kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen) y se los aislamientos previamente secuenciados.
realiz su secuenciacin directa en un se- Todas las reacciones de PCR incluyeron ade-
cuenciador ABI Prism 3730XL (PE Applied ms un control negativo que careca del DNA
Biosystems) en la compaa Macrogen (Corea molde del patgeno.
del Sur). Las secuencias obtenidas con cada
cebador fueron editadas y ensambladas para PCR-RFLPs
obtener los consensos con el programa Bioedit Debido a los altos niveles de identidad de las
6.0.6. (Hall, 1999), comparando con la base regiones ITS del rDNA de C. lindemuthianum,
de datos GenBank del National Center For C. orbiculare y C. trifolii, se dise una prueba
Biotechnology Information (NCBI), mediante basada en la amplificacin de esta regin,
el programa Blastn (http://www.ncbi.nlm. bien con los cebadores especficos CY1/
nih.gov/BLAST). CY2 o con una combinacin de estos y los
Las secuencias obtenidas con los cebadores cebadores universales ITS1 e ITS4 (ej. CY1/
ITS1/ITS4 y aquellas de referencia de dife- ITS4, ITS1/CY2). Las secuencias obtenidas
rentes especies de Colletotrichum, se utili- en este trabajo para dichos amplicones en
zaron para realizar un alineamiento con el C. lindemuthianum y aquellas depositadas
algoritmo Clustal W incluido en el software en GenBank para las otras especies filoge-
Bioedit 6.0.6. (Hall, 1999). La matriz obte- nticamente afines de Colletotrichum fueron
nida fue empleada para realizar un anlisis utilizadas para realizar un anlisis in silico
filogentico basado en el mtodo de Neighbor de RFLPs (polimorfismo en la longitud de los
Joining (NJ) con distancia gentica calcula- fragmentos de restriccin) mediante el pro-
da por el mtodo dos-parmetros de Kimura grama Webcutter (htpp:/rna.lundberg.gu.se).
y anlisis de bootstrap con 1000 iteraciones, Al final, dada su adecuada resolucin en la
mediante el software Mega 5.0 (Tamura et separacin de dichas especies, se seleccio-
al., 2011). Para el caso de las secuencias naron las enzimas de restriccin CfoI, MspI
obtenidas con los cebadores CD1/CD2 se y MseI (=Tru1I) para confirmar su patrn de
realizaron comparaciones con GenBank digestin sobre cinco amplicones de regiones
usando Blastx, determinando el marco de ITS de C. lindemuthianum. Las reacciones
lectura correcto y la traduccin respectiva consistieron de 10 l, conteniendo 1 l de
con la herramienta translate del servidor buffer de enzima 10X, 1 U de cada enzima
Expasy (www.expasy.org). Los nmeros de de restriccin (Thermo), 5 l del amplicon y
accesin de las secuencias depositadas en 1 l de agua. Las reacciones fueron incu-
GenBank de este trabajo corresponden al badas al bao Mara a 37 C durante 12 h.
rango KJ956028-KJ956037. La separacin y visualizacin se efectu por
electroforesis en gel de agarosa al 2.5%, tal
Evaluacin de cebadores en la totalidad como se indic anteriormente.
de aislamientos
Los pares de cebadores CY1/CY2 y CD1/CD2 Resultados y discusin
que generaron los fragmentos del tamao
esperado en los 10 aislamientos inicialmen- Aislamientos y extracciones de DNA
te evaluados, fueron seleccionados para su En total se obtuvieron 60 aislamientos de C.
utilizacin en reacciones de PCR dplex a lindemuthianum en el estudio. En los aisla-

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Deteccin por PCR de Colletotrichum lindemuthianum en cultivos y semillas
de frijol en Antioquia, Colombia

mientos en los que se present esporulacin 100 a 1500 ng/l, promedio de 978 ng/l (SD:
fue posible confirmar morfolgicamente su 354 ng/l) y relaciones de 260 nm:280 nm
identidad, al presentar conidias hialinas, de 1.7 a 2.1 (promedio: 1.9, SD 0.11). En el
cilndricas, no septadas, con terminaciones caso particular de las extracciones de DNA a
obtusas, de 13 - 18 m x 3.75-5 m (promedio partir de tejidos de frijol (incluyendo semillas),
SD: 15.75 2.44 x 4.76 0.46) (Foto 1A). el uso del kit comercial fue muy efectivo en
Conidiforos no septados, hialinos y ciln- trminos de la calidad del DNA obtenido para
dricos, micelio septado, inicialmente hialino adelantar las reacciones de PCR posteriores.
pero rpidamente tornndose de color gris
a negro oliva (Foto1B), con colonias planas Anlisis filogentico de regiones ITS del rDNA
cubiertas de micelio areo esparcido y masas Las reacciones de PCR con los cebadores ITS1
de esporas de color salmn producidas en el e ITS4 generaron fragmentos de cerca de 600
centro de los cultivos. Las metodologas de pb a partir del DNA de los aislamientos bajo
extraccin basadas en los mtodo del CTAB anlisis, siendo evidente la uniformidad del
3X y el kit comercial permitieron obtener tamao de esta regin en la especie C. linde-
DNA en cantidades suficientes y adecuada muthianum. La comparacin de las secuen-
calidad, con concentraciones en el rango de cias con respecto al GenBank present como

Foto 1. (A) Conidias hialinas cilndricas y (B) colonia de un aislamiento de C.


lindemuthianum obtenido en Antioquia (Colombia). (C) Sntomas de
antracnosis en fololos y vainas de frijol variedad Cargamanto.

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primeros hits secuencias de C. lindemuthia- C. lindemuthianum de diferentes orgenes


num o de su estado sexual Glomerella linde- geogrficos; adems de secuencias de C.
muthiana Shear (ej. accesiones EU400129, orbiculare y C. trifolii; aunque los represen-
AJ301947 y AJ301958) con 100% de identidad tantes de dichas especies se presentaron en
y valores e de 0.0 (100% cobertura), lo que en subclados individuales. El segundo clado
conjunto con las observaciones coloniales y present secuencias de C. dracaenophilum,
microscpicas, condujo inequvocamente a C. yunnanense y C. tropicicola; mientras que
confirmar la identidad de los aislamientos. el tercer grupo correspondi a C. gloeosporioi-
En el rbol filogentico se observ la des y C. fructicola. El cuarto clado incluy
formacin de cinco clados principales (1 a 5) aislamientos de C. coccodes y C. nigrum y
con altos soportes de bootstrap (> 84%). El finalmente el quinto grupo correspondi a C.
primero de ellos agrup las 10 secuencias acutatum (Figura 1).
obtenidas en este estudio con aquellas de

L6 Marinilla (Antioquia, Colombia)


L80 Sonsn (Antioquia, Colombia)
L59 Guarne Marinilla (Antioquia, Colombia)
L3 Marinilla (Antioquia, Colombia)
L70 Belmira Marinilla (Antioquia, Colombia)
L20 Urrao (Antioquia, Colombia)
L83 Guarne Marinilla (Antioquia, Colombia)
L21 Urrao (Antioquia, Colombia)
L79 Sonsn (Antioquia, Colombia)
L84 Rionegro (Antioquia, Colombia)
EU400129 Glomerella lindemuthiana
AJ301947 Colletotrichum lindemuthianum CBS 132.57 1
JX546809 Glomerella indemuthiana CBS 146.31
98 EU400136 Colletotrichum trifolii DAOM225587

80 AB087223 Colletotrichum trifolii


AY841133 Colletotrichum orbiculare MX-2153
JX997427 Colletotrichum orbiculare 10-151
JX997423 Colletotrichum orbiculare 11-061
JX546816 Glomerella lindemuthiana CBS 524.97
93 JX546809 Glomerella lindemuthiana CBS 146.31(2)
JX546807 Glomerella lindemuthiana CBS 133.57
JX546806 Glomerella lindemuthiana CBS 132.57.1
JX546818 Glomerella lindemuthiana CBS 571.97
93 JX546805 Glomerella lindemuthiana CBS 131.57

88 EU003533 Colletotrichum dracaenophilum CBS 121453


84 JX546804 Colletotrichum yunnanense CBS 132135 2
JN050240 Colletotrichum tropiciola L58/LC0598
83 DQ084498 Colletotrichum gloeosporioides P-1
AY902476 Colletotrichum gloeosporioides
100
JN943082 Colletotrichum fructicola LC0903
3
JQ936218 Colletotrichum fgloeosporioides C55.2
100 KC436058 Colletotrichum coccodes
JX546850 Colletotrichum nigrum IMI 363582
4
EU008866 Glomerella acutata M40
100 AF090853 Colletotrichum acutatum 5
HQ330982 Glomerella acutatum Ca262
EU167575 phoma medicaginis CBS 533.66

0.05

Figura 1. rbol filogentico basado en secuencias ITS del rDNA de aislamientos de Colletotrichum lindemuthianum de Antioquia
(Colombia) y de secuencias de referencia del gnero Colletotrichum obtenidas del GenBank. Mtodo de Neighbor Joining
(NJ), distancia por Kimura 2P y anlisis de bootstrap con 1000 iteraciones. Los valores de bootstrap (> 80%) se presentan
sobre las ramas y los nmeros de clados referidos en el texto se presentan sobre las barras en la parte externa.

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Deteccin por PCR de Colletotrichum lindemuthianum en cultivos y semillas
de frijol en Antioquia, Colombia

Evaluacin inicial de cebadores muthianum (ej., 99% de identidad y cobertura,


De los cuatro juegos de cebadores evaluados e = 0.0 con respecto a JX546806, EU400129).
en el estudio, slo dos (CD1/CD2 y CY1/CY2) Sin embargo, cuando se probaron los ceba-
demostraron ser tiles en la deteccin mole- dores CY1/CY2 sobre DNA total obtenido de
cular de aislamientos de C. lindemuthianum tejidos de frijol, los resultados mostraron ser
en Antioquia, al generar fragmentos nicos inconsistentes, ya que no siempre permitan
de 638 pb y 442 pb, respectivamente (Figura la obtencin del amplicon en muestras con
2A). Por otra parte, las amplificaciones con sntomas de antracnosis (Figura 2B). Este
los cebadores ClF4/ITS4 fueron inespecficas, resultado est acorde con lo reportado por
aun cuando se variaron condiciones de PCR Wang et al. (2008), quienes indican que di-
como la temperatura de anillamiento y las chos cebadores no resultaron completamente
concentraciones de MgCl2, DNA y cebadores especficos, al amplificar tambin DNA de
(Figura 2C). Para el caso de los cebadores aislamientos de C. orbiculare. Por esto, se
ClF432/ClR533 se produjeron los fragmentos decidi la evaluacin de las combinaciones
del tamao esperado (101 pb) (Figura 2D), de estos cebadores con los universales ITS1
pero no fueron tenidos en cuenta por los e ITS4, con lo que se obtuvieron los fragmen-
problemas de separacin y visualizacin de tos del tamao esperado (~480 pb) en ambas
amplicones pequeos en esquemas de electro- combinaciones (CY1/ITS4 e ITS1/CY2) (Figu-
foresis estndar. Sin embargo, este resultado ra 3). Para el caso del uso de los cebadores
confirma su utilidad en sistemas de PCR en CD1/CD2 sobre DNA de tejidos de frijol, in-
tiempo real, para lo cual fueron originalmente cluyendo semillas, nuevamente se obtuvieron
diseados (Chen et al., 2012). los amplicones del tamao esperado, aunque
con variaciones en los niveles de intensidad,
Evaluacin de los cebadores en la totalidad de lo que es frecuente dadas las diferencias
aislamientos y en tejidos vegetales propias en la calidad del DNA obtenido de
Los cebadores CD1/CD2 y CY1/CY2 permi- diversos tejidos vegetales. Ya que los autores
tieron obtener los amplicones del tamao es- de dichos cebadores (Wang et al., 2008) no
perado en los aislamientos evaluados (Figura reportaron sus regiones diana, se realiz su
2A), siendo confirmada su naturaleza como secuenciacin y no fue posible encontrar por
parte de la regin ITS del rDNA de C. linde- Blastn hits significativos con respecto a la

Figura 2. Productos amplificados por PCR con los cebadores CD1/CD2 y CY1/CY2 en reacciones dplex a partir de DNA obtenido
de (A) micelio de aislamientos Colletotrichum lindemuthianum y (B) de tejidos de frijol con sntomas de antracnosis en
cultivos de Antioquia (Colombia). (C) Productos amplificados con los cebadores ClF4/ITS4 y (D) ClF432/ClR533. (E)
PCR-RFLPs de regiones ITS del DNA ribosomal amplificadas con los cebadores ITS1/ITS4 y digeridas con las enzimas
CfoI (2-6), MspI (8-12) y MseI (14-18); 19: amplicon sin digerir; 20: control negativo. Todos los geles tienen el marcador
de peso molecular 100 pb plus (Thermo) (las bandas ms oscuras en el marcador corresponden a 500 y 1000 pb).

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1 2 3 4 5 6 7 8 9

Figura 3. Productos amplificados (~480 pb) por PCR con los cebadores CY2/ITS1 (arriba) y CY1/
ITS4 (abajo) a partir de DNA obtenido de micelio de aislamientos de Colletotrichum
lindemuthianum y de tejidos de frijol con sntomas de antracnosis en cultivos de
Antioquia (Colombia). Lnea 1: Marcador de peso molecular 100 pb plus (Thermo);
Lneas 2 a 4: DNA directo de micelio del hongo, lneas 5 a 8: DNA directo de tejido
de frijol.

base de datos del GenBank (cobertura: 6%, de este pseudogen y de los genes funcionales
y valores e: 3.7), por lo que se procedi a rea- que participan en las rutas de absorcin y
lizar bsquedas con la herramienta Blastx. transformacin del hierro en C. lindemuthia-
En este caso los resultados indicaron hits num, realizando una evaluacin genmica
con niveles de identidad de 34 a 37% (valores mediante pirosecuenciacin 454 (Roche), que
e: 1x10 -12,-14, coberturas: 71 - 74%) con res- confirm la naturaleza de esta regin SCAR
pecto a secuencias de permeasas de hierro como un pseudogen de Ftr1 (Gutirrez et al.,
de hongos, incluyendo miembros del gnero 2014). De gran inters resultar en el futuro
Colletotrichum (ej., Accesiones EJP66635, obtener la secuencia del gen funcional de la
EGX90976). Este resultado condujo a plan- permeasa de hierro de C. lindemuthianum,
tear que dicha regin obtenida por SCARs para realizar comparaciones con el pseudo-
(secuencias caracterizadas de regiones am- gen aqu reportado y con los genes encontra-
plificadas al azar) por parte de Wang et al. dos en otras especies de Colletotrichum, de
(2008), corresponda a un pseudogen, siendo manera que se evale su utilidad como un
evaluada dicha hiptesis a partir del anlisis posible marcador molecular en este gnero
de la traduccin del fragmento secuenciado. de hongos.
En este caso se encontr que efectivamente
la secuencia resultante presentaba codones PCR-RFLPs
de parada internos, altas tasas de variacin Debido a la agrupacin en el primer clado
y niveles de identidad inferiores que 0.38 con del rbol filogentico de C. lindemuthianum
respecto a secuencias de otras permeasas de con otras dos especies de Colletotrichum, se
hierro. Estos hallazgos condujeron al grupo realiz un anlisis de identidad gentica, en-
de investigadores a profundizar en el estudio contrando que los aislamientos en el presente

384
Deteccin por PCR de Colletotrichum lindemuthianum en cultivos y semillas
de frijol en Antioquia, Colombia

estudio compartan niveles de identidad de presentan cuatro sitios de corte T/TAA (132,
0.998 con respecto a los de C. lindemuthianum 177, 480, 523), mientras que en C. orbiculare
de otras regiones del mundo, y que dichos tres (135, 180, 526) y en C. trifolii slo dos
niveles disminuan a 0.986 y 0.981 con las sitios de corte (124, 169) (Cuadro 3). La con-
especies C. orbiculare y C. trifolii, respectiva- firmacin in vitro de dichas predicciones se
mente, siendo inferiores que 0.90 en relacin realiz utilizando cinco aislamientos de C.
con las dems especies del gnero (matriz no lindemuthianum obtenidos en este estudio y
incluida). Esto represent una oportunidad amplificacin por PCR de la regin ITS del
para utilizar la regin ITS del rDNA como rDNA con los cebadores ITS1/ITS4 (ver Figura
base para la deteccin molecular de C. lin- 1E). En trabajos previos adelantados por Liu
demuthianum. Por esta razn se procedi a et al. (2007) se haba propuesto una prueba
realizar un anlisis in silico de RFLPs, que de RFLPs para diferenciar las especies C.
incluy diferentes secuencias de referencia orbiculare, C. lindemuthianum, C. trifolii y C.
del gnero Colletotrichum, encontrando que malvarum utilizando RFLPs de un intron de
efectivamente tres endonucleasas (CfoI, MspI 900 pb del gen glutamina sintetasa; sin em-
y MseI (=Tru1I)) presentaban diferentes sitios bargo, dado el bajo nmero de copias de este
de corte entre las secuencias de las espe- gen, su deteccin resulta menos sensible que
cies ms cercanas C. lindemuthianum y C. el uso de regiones ITS del rDNA, que puede
orbiculare. Adems, dichas especies pueden tener de varios cientos a miles de copias por
ser fcilmente identificadas mediante RFLPs genoma (White et al., 1990), siendo preferible
con respecto a C. trifolii usando MseI, ya que su utilizacin como prueba de diagnstico
en la regin ITS de C. lindemuthianum se molecular.

Cuadro 3. Anlisis in silico de sitios de corte de tres enzimas de restriccin en las regiones ITS1, 5.8S e ITS2 del DNA ribosomal
amplificadas con diferentes cebadores (ITS1/ITS4 y CY1/CY2) en aislamientos de Colletotrichum lindemuthianum
y otras especies cercanas.

Especies CfoI MseI (= Tru1I) MspI Tamao


amplicn*
Cortes Sitios de Cortes Sitios de Cortes Sitios de
(no.) corte* (no.) corte (no.) corte

Amplificacin con ITS1/ITS4

C. lindemuthianum (este estudio) 2 104.286 4 132.177. 480.523 2 109.439 550 pb

C. lindemuthanum 2 104.286 4 132.177. 480.523 2 109.439 550 pb


CBS 132.57 (AJ301947)

C. orbiculare (JX997427) 1 289 3 135.180. 526 3 86.110.442 550 pb

C. orbiculare (JX997423) 1 289 3 135.180. 526 3 86.110.442 550 pb

C. trifolii (AB087223) 2 94.278 2 124.169 3 75.99.431 550 pb

C. acutatum (AF090853) 3 119.145.326 3 208.217.419 4 114.120. 150.441 554 pb

Amplificacin con CY1/CY2

C. lindemuthianum (este estudio) 2 62.244 2 90.135 2 67.397 430 pb

C. lindemuthanum 2 63.244 2 91.135 2 68.397 430 pb


CBS 132.57 (AJ301947)

C. orbiculare (JX997427) 1 248 2 94.139 3 45.69.401 434 pb

C. orbiculare (JX997423) 1 248 2 94.139 3 45.69.401 434 pb

C. trifolii (AB087223) 2 64.248 2 94.139 3 45.69.401 434 pb

C. acutatum (AF090853) 3 60.86.267 3 149.158.360 4 55.61.91.382 450 pb

* Sitios de corte: se refiere a las posiciones de corte de cada enzima de restriccin en las secuencias bajo anlisis.

385
Acta Agronmica. 63 (4) 2014, p 377-387

Se espera que las herramientas de de- Agradecimientos


teccin molecular de C. lindemuthianum
Este trabajo fue financiado por la Vicerrecto-
evaluadas en el presente estudio sean
ra de Investigaciones de la Universidad Na-
efectivamente incorporadas por los orga-
cional de Colombia, proyecto: 20101009932.
nismos de sanidad vegetal estatal, gremios
Convocatoria Nacional para el fortalecimiento
de agricultores y productores de semillas,
de los Grupos de Investigacin y Creacin
para mejorar los sistemas de certificacin de
Artstica de la Universidad Nacional de Co-
semilla de frijol, fortalecer los programas de
lombia. 2010-2012.
vigilancia cuarentenaria y apoyar estudios
epidemiolgicos y de mejoramiento gentico
por resistencia a este hongo que se adelan- Referencias
tan en Colombia y otros pases como Brasil, Apostolos, B. J.; Koutita, O.; y Klonari, K. T. 2009.
EE.UU. y Mxico. Molecular diversity and assessment of biological
characteristics of Greek Colletotrichum lindemuthia-
num populations. J. Phytopath. 157:311 - 318.
Conclusiones
Balardin, R. S.; Jarosz, A.M.; y Kelly, J. D. 1997. Vi-
En esta investigacin se evalu el uso de rulence and molecular diversity in Colletotrichum
cuatro grupos de cebadores (CY1/CY2, lindemuthianum from South, Central, and North
CD1/CD2, ClF4/ITS4 y ClF432/ClR533) America. Phytopath. 87:1184 - 1191.
para su utilizacin en pruebas de deteccin Cannon, P. F.; Damm, U.; Johnston, P. R.; y Weir,
e identificacin molecular de aislamientos B. S. 2012. Colletotrichum current status and
de C. lindemuthianum obtenidos en dife- future directions. Stud. Mycol. 73:181 - 213.
Chaves, G. 1989. Anthracnose. En: Schwartz, H. y
rentes subregiones cultivadoras de frijol
Galvez, G. (eds.). Bean production problems. Cen-
del departamento de Antioquia (Colom- tro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT),
bia). Los cebadores CD1/CD2 resultaron Cali. p. 39 - 54.
en amplificaciones por PCR ms robustas Chen, Y. Y.; Conner, R. L.; Gillard, C. L.; Boland,
y especficas; sin embargo su utilizacin G. J.; Babcock, C.; Chang, K. F.; Hwang, S. F.;
para la deteccin de C. lindemuthianum en y Balasubramanian, P. M. 2007. A specific and
otras regiones de Colombia y en diferentes sensitive method for the detection of Colleto-
pases, requiere de una evaluacin previa trichum lindemuthianum in dry bean tissue. Plant
de las caractersticas genticas de las po- Dis. 91:1271 - 1276.
blaciones del hongo. Chen, Y. Y.; Conner, R. L.; Gillard, C. L.; McLaren,
Como prueba confirmatoria para la de- D. L.; Boland, G. J.; Balasubramanian, P. M.; et
teccin de C. lindemuthianum a partir de al. 2012. A quantitative real-time PCR assay for
detection of Colletotrichum lindemuthianum in
DNA de micelio y tejidos de frijol, en este
navy bean seeds. Plant Pathol. 62:900 - 907.
trabajo se propone el uso de una prueba Damasceno e Silva, K. J.; de Souza, E. A.; y Ishikawa,
de PCR-RFLP de la regin ITS del rDNA F. H. 2007. Characterization of Colletotrichum
y la digestin con la enzima MspI que lindemuthianum isolates from the state of Minas
genera dos sitios de corte C/CGG en C. Gerais, Brazil. J. Phytopath. 155:241 - 247.
lindemuthianum, en contraste con tres en Doyle, J. J. y Doyle, J. L. 1990. Isolation of plant
C. orbiculare y C. trifolii. En caso de ser re- DNA from fresh tissue. Focus 12:13 - 15.
querido, dichas especies pueden, a su vez, Fenalce (Federacin Nacional de Cereales). 2010. El
ser diferenciadas por la digestin con CfoI cultivo de frijol. Historia e importancia. El cerea-
que produce dos sitios de corte GCG/C en lista, mayo-junio. p. 30.
C. trifolii y un slo corte en C. orbiculare. Gutirrez, P.; Salazar, M.; Alzate, J. F.; Vanegas, K.; y
Como prueba confirmatoria a la amplifica- Marn, M. 2014. The CD1/CD2 marker for specific
detection of Colletotrichum lindemuthianum is an
cin con CD1/CD2 para la deteccin de C.
iron transporter pseudogene. Trop. Plant Pathol.
lindemuthianum en tejidos de frijol (fololos, 39:275 - 283.
vainas, semillas) se recomienda el empleo Hall, T. A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological
de los cebadores ITS1/CY2 o CY1/ITS4, sequence alignment editor and analysis program
que generan amplicones ms robustos que for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symp. Ser.
aquellos logrados con CY1/CY2. 41:95 - 98.

386
Deteccin por PCR de Colletotrichum lindemuthianum en cultivos y semillas
de frijol en Antioquia, Colombia

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