Repercusin del ciclo circadiano en la desregulacin de los

genes PER1, PER2 y PER3 para presentar cncer de mama

Resumen
Los ciclos circadianos son ritmos biolgicos con una duracin cercana a
24 horas, regulan nuestra actividad metablica, hormonal y conductual
diaria. Se establecen por la actividad transcripcional intrnseca de un
grupo de genes, denominado genes reloj, quienes se expresan
rtmicamente en el cerebro y tejidos perifricos. Estudios
epidemiolgicos recientes sugieren que las alteraciones del ritmo
circadiano representan un factor de riesgo para el desarrollo de cncer
en humanos. Se ha visto que las alteraciones en las protenas
especificas de PER1, PER2 Y PER3 repercuten directamente a la
presencia de cncer de mama sin embargo no se sabe como se alteran
estos y de que manera repercuten. Se utilizo tincin
inmunohistoquimica, PCR especifica de metilacin y mtodos de
secuenciacin directa para analizar los cambios moleculares en los tres
genes ms importantes, los cuales son: PER1, PER2 Y PER3, en el ritmo
circadiano en 55 casos de cncer de mama.

Palabras clave
Ciclo circadiano, desregulacin, genes, PER1, PER2, PER3, metilacin.

Hiptesis
El ciclo circadiano repercute directamente en la desregulacin de
los genes Per1, Per2 y Per3 lo que favorece a presentar cncer de
mama.
Objetivos
Demostrar que los genes Per1, Per2 y Per3 se desregulan
al haber una alteracin en el ciclo circadiano
Demostrar mediante tinciones de imnuhistoquimica la
deteccin de las
alteraciones celulares
Demostrar mediante PCR especfica para la metilacin y
mtodos de
secuenciacin directa para explorar los cambios
moleculares en los tres
genes circadianos ms importantes (PER1, PER2 y PER3)
en los cnceres
de mama.
Demostrar mediante los tejidos obtenidos de los pacientes
los tipos de
carcinoma ms frecuente
Planteamiento del problema:
Los ciclos circadianos son ritmos biolgicos con una duracin cercana a
24 horas, regulan nuestra actividad metablica, hormonal y conductual
diaria. Se establecen por la actividad transcripcional intrnseca de un
grupo de genes, denominado genes reloj, quienes se expresan
rtmicamente en el cerebro y tejidos perifricos. Estudios
epidemiolgicos recientes sugieren que las alteraciones del ritmo
circadiano representan un factor de riesgo para el desarrollo de cncer
en humanos.(23-24) De manera interesante se ha visto que las
alteraciones en las protenas especificas de PER1, PER2 Y PER3
repercuten directamente a la presencia de cncer de mama sin embargo
no se sabe como se alteran estos y de que manera repercuten(24), por
lo cual la intencin del proyecto es investigar de que manera el ciclo
circadiano repercute en las protenas PER1, PER2 Y PER3 y esto favorece
a la expresin tumoral del cncer de mama. Con esta investigacin se
pretende ayudar a detectar de otra manera el cncer de mama y a
observar como repercute en el cuerpo las alteraciones en nuestro reloj
biolgicos. Esta investigacin en el sector salud tendra un alto impacto
debido a que el ciclo circadiano es algo que no se toma en cuenta como
un factor para la presencia de cncer de mama, sin embargo, se ha visto
que el estilo de vida que ha ido adoptando la poblacin mundial ha
aumentado la incidencia del cncer de mama y esto va de la mano con
la alteracin del ciclo y por consiguiente de las protenas (PER1, PER2 Y
PER3), por lo cual se podra a empezar a usar como un marcador
tumoral la alteracin en alguna de las protenas.

Antecedentes
El cncer de mama es una neoplasia maligna comn que afecta a la
mayora de las mujeres adultas, en especial en pases desarrollados. Los
estudios epidemiolgicos nos sugieren mltiples factores de riesgo(1-5).
El mecanismo molecular que rige el desarrollo del cncer de mama es
un proceso de mltiples pasos que incluyen la activacin de genes
oncolgicos (oncogenes), la inactivacin de genes de supresin tumoral,
defectos en los genes de reparacin del ADN y otro genes que se
relacionan con tumores implicados en apoptosis, protelisis, adhesin y
angiognesis (6-9).
A lo largo del tiempo algunos estudios han demostrado que un nuevo
factor de riesgo putativo, el ciclo circadiano, este puede jugar un papel
importante en el desarrollo del cncer de mama(10,11).
En los mamferos, los procesos fisiolgicos y hormonales, as como el
comportamiento, siguen ritmos que son manejados por un reloj
endgeno maestro (ciclo circadiano). Este reloj maestro se encuentra en
el ncleo supraquiasmtico (SCN) del hipotlamo y produce ritmos
circadiano auto sostenidos que se sincronizan mediante estmulos
externos. Estudios han demostrado que el ciclo circadiano es una
estructura maestra y necesaria: el marcapasos maestro (SCN) sincroniza
los osciladores esclavos (tejido perifrico) de los mamferos (12-14).
Recientemente, se han encontrado ciclos circadianos perifricos
similares a los que operan en el SNC en la mayora de las clulas de
mamferos y tejidos perifricos, y estos ciclos son controlados o
sincronizados por el marcapasos central en el SNC (14). El ciclo
circadiano humano esta controlado por al menos nueve genes
circadianos: PER1, PER2, PER3, CRY1, CRY2, CLOCK, BMAL1, CK1e y
Timeless (TIM) (12-18). Los genes de tres periodos (PER) codifican
protenas del dominio PER-ARNT-SIM (PAS) individualizadas que
funcionan en el ncleo pero no se unen directamente al ADN. Los genes
CLOCK y BMAL1 codifican los factores de transcripcin PAS hlice-lazo-
hlice. Los productos de estos genes se ensamblan en un reloj molecular
que esta compuesto de bucles de retroalimentacin entrelazados en la
expresin gnica. El modelo actual de estos osciladores se basa en la
transcripcin auto regulatoria y los bucles de retroalimentacin de la
traduccin de estos genes circadianos en los que los genes PER ocupan
una posicin central (12-18).
La interrupcin del ritmo circadiano puede ser un factor de riesgo en el
desarrollo de cncer de mama (10,11,19-22), pero los cambios
moleculares en estos genes circadianos en las clulas de cncer de
mama estn an sin explorar. En el presente estudio se utilizaron tincin
inmunohistoqumica, PCR especfica para la metilacin y mtodos de
secuenciacin directa para explorar los cambios moleculares en los tres
genes circadianos ms importantes (PER1, PER2 y PER3) en los cnceres
de mama.

Justificacin
En Mxico el cncer es cada vez ms frecuente. Sin embargo, el cncer
de mama es uno de los tipos que ms a tomado fuerza a lo largo del
tiempo, y esto se refleja a nivel mundial ya que es la tercera causa de
muerte en el mundo en el sexo femenino, con tasa de crecimiento anual
de 0.5% y se espera aumente. La mujeres en Mxico han sido sometidas
a campanas del gobierno para hacer conciencia de lo peligroso que es
no tener una cultura de autoexploracin ya que solo el 10% de los casos
son detectados en etapa I por medio de la misma(26, 27,28,29,30). De
aqu la importancia de buscar nuevas formas de deteccin
Este proyecto aborda una propuesta novedosa basada en el estilo de
vida de las personas, que consiste en observar la altercin que se da en
los genes PER cuando hay una variacin en el ciclo circadiano de las
personas.

Metodologa
Muestras
De julio de 2015 a octubre 2016, 55 pacientes con cncer de mama
haban sido operadas, y las muestras de los tejidos obtenidos fueron
usados para su estudio. En total, se recolectaron 55 resecciones de
cncer de mama y tejidos no cancerosos cercanos. Los tejidos cercanos
se obtuvieron de la parte de la mama sin contaminacin de clulas
cancergenas, que fueron confirmados por estudios histopatolgicos. Los
tejidos fueron congelados o fijados en formol inmediatamente despus
de la ciruga y fueron almacenadas en liquido nitrogenado antes de la
extraccin de ADN.
Anlisis de la expresin de las protenas PER1, PER2 Y PER3 por
inmunohistoquimica
Se puso el tejido en parafina en cubos de 4mm sobre portaobjetos
recubiertos de poli-1-lisina. Despus del tratamiento con H2O2 al 3% en
metanol, las secciones se hidrataron con alcohol y buffer salino (PBS), se
incubaron con 10 mm de buffer citrato y, finalmente, calentados a 100C
por 20 minutos en PBS. Despus de la incubacin con anticuerpos para
PER1, PER2 y PER3 por 20 minutos a temperatura ambiente, los porta
objetos se lavaron a fondo 3 veces con PBS antes de ser incubados con
un conjugado de polmero HRP / Fab durante otros 30 minutos. Los sitios
de actividad peroxidasa se visualizaron usando tetracloruro de 3,30-
dinamio-bencidina como sustrato. Se utilizo hematoxilina como contra
tincin. Tambin se incluyeron controles positivos y negativos
Anlisis mutacional de los genes PER1, PER2 Y PER3
La amplificacin de la regin codificadora de los genes PER se llev a
cabo mediante PCR. Los primers de PCR y las secuencias se
proporcionarn a peticin. La PCR se realiz en un volumen final de 50
ml que contena 200 nM de cada primer, 200 mM de cada dNTP, 3.5 mM
de MgCL2, 2 U Taq DNA polimerasa (Promega, Madison, WI) y 1 PCR
buffer. El procedimiento de amplificacin se llev a cabo como sigue: 35
ciclos de reacciones de PCR incluyendo desnaturalizacin a 95C durante
1 min, alineacin a la temperatura dependiendo de la temperatura de
fusin (Tm) de cada conjunto de primers durante 1 min y un ciclo de
extensin a 72C durante 2 min. Los productos de PCR fueron sometidos
a purificacin en gel y secuenciacin directa. La secuenciacin de ADN
se realiz mediante ABI Prism 310 Genetic Analyzer y el BigDye
Terminator cycle sequencing kit (Applied Biosystem, EE.UU.) de acuerdo
con el protocolo del fabricante.
Metilacin especifica, anlisis de PCR de PER 1, PER2 Y PER3.
El ADN genmico se modific con bisulfito de sodio y se realizaron PCRs
especficas de metilacin con algunas modificaciones. Los pares de
primers para la deteccin de las secuencias metiladas y no metiladas en
el promotor de PER1, PER2 y PER3. Brevemente, se desnaturalizaron ~ 4
mg de ADN genmico en 40 ml de H2O mediante incubacin con 10 ml
de NaOH 1 N a 37C durante 10 min seguido de modificacin con 30 ml
de hidroquinona 10 mM y 520 ml de bisulfito de sodio 1,5 M (pH 5,0) a
50C durante 16 h. Las muestras de ADN se diluyeron con 100 ml de
H2O precalentado (65-70C) en un kit de purificacin de ADN de
asistencia (Promega). Se anadieron cincuenta microlitros de 1 N NaOH al
eluyente y la mezcla se incub a temperatura ambiente durante 5 min.
Despus de que el precipitado se precipit con 150 ml de isopropanol al
100% y se lav con etanol al 70%, se resuspendi en 45 ml de H2O. El
ADN modificado se amplific en un volumen total de 20 ml de solucin
que contena 1 tampn de PCR, 1,0 mM de MgCl2, 100 ng de cada
primer, 0,2 mM de cada dNTP y 2,5 U de Taq polimerasa. La PCR se
realiz en un termociclador durante 35 ciclos; Cada ciclo consisti en
desnaturalizacin a 94C durante 1 min, recocido a 60C para primers
tanto metilados como no metilados durante 1 min de extensin a 72C
durante 1 min y una extensin final de 5 min a 72C. Los productos de
PCR fueron entonces cargados y sometidos a electroforesis en geles de
agarosa al 3,5%, tenido con bromuro de etidio y visualizado bajo
iluminacin UV.
Se us ADN genmico tratado con metilasa de CpG (SssI) como control
positivo para cebadores especficos de metilacin. Se utilizaron muestras
de ADN extradas de muestras de sangre de individuos sanos que dieron
negativo en metilacin y positivas en unmetilacin en los tres genes PER
como controles positivos para la desmetilacin. Para garantizar la
especificidad en la metilacin en los tres genes PER, sin modificar las
muestras de ADN genmico de no cancerosos y las partes cancerosas de
los pacientes con cncer de mama tambin se llevaron a cabo como
controles negativos.
Secuenciacin de productos de PCR especficos de metilacin
Para determinar el nmero de sitios CpG metilados, los productos de
experimentos de PCR especficos de metilacin y desmetilacin fueron
sometidos a anlisis de secuenciacin directa. La secuenciacin de ADN
se realiz mediante ABI Prism 310 Genetic Analyzer y el BigDye
Terminator ciclo de secuenciacin kit (Applied Biosystem, EE.UU.) de
acuerdo con el protocolo del fabricante

Recursos financieros
Se contara con recursos financieros para el proyecto por un ano. Las
fuentes de financiamiento son el remanente de un donativo de Conacyt
($350,000.00) y recursos de la Universidad Anhuac al laboratorio
($150,00.00). Debido a que el laboratorio cuenta con los equipos
necesarios, esa cantidad sera ms que suficiente para la adquisicin de
reactivos, kits para evaluacin de la metilacin y cambio en los genes
PER. Adems el laboratorio cuenta con material til libre de cargos
financieros
Compromiso en infraestructura
El laboratorio de la universidad Anhuac cuenta con microscopios
pticos, equipos para practica de biologa molecular, cuarto de cultivo
con campana e incubadora, centrifugas y ultracentrfugas, microscopa
confocal monofotnica, espectrofotmetros, Revcos y cuartos fros y
todo lo necesario para la practica.
Cronograma
Actividad Fecha de Fecha de Productos Impacto en el
inicio trmino esperados programa
receptor
Revisin Enero de Febrero Actualizaci
bibliogrfica 2017 de 2017 n de la
informacin
y ajuste del
protocolo
Recoleccin de Febrero Marzo Tener las Generar un
muestras de 2017 de 2017 muestras manual para la
necesarias obtencin optima
para dar de muestras de
inicio a la cncer de mama
investigaci
n
Estudio Marzo Agosto Determinac Generar un
inmunohistoqum de 2017 de 2017 in de las manual sobre el
ico e alteracione uso correcto de la
histopatolgico s celulares inmunohistoquimi
ocasionada ca en clulas de
s por el cncer de mama
cambio en
el ritmo
circadiano
as como el
tipo de
clula
afectada

Anlisis Agosto Diciembr Demostrar Observar y

mutacional de los de 2017 e de mutaciones supervisar las
genes 2017 en los alteraciones
genes PER
Estudio de Diciembr Diciembr Demostrar Concentrar y
comparacin e de e de los cambios analizar los datos
2017 2017 ocurridos para
entre el incorporarlos a la
control y el base de datos
experiment
o
Metilacin Enero de Febrero Observar Supervisin de la
especifica 2018 de 2018 cambios metilacin
por la
alteracin
 deseada
Anlisis de PCR Mayo de Mayo de Demostrar Supervicin del
2018 2018 que el ciclo uso correcto de la
circadiano PCR
afecta a los
genes PER
Evaluacin de Junio de Julio de Generacin Integracin de
resultados 2018 2018 del reporte resultados
a Conacyt y
escritura de
un draft
para
publicacin.

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