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Cuaderno
Cuaderno
AREA DEMICROBIOLOGA
DEPARTAMENTO DE BIOLOGA APLICADA
ESCUELA POLITCNICA SUPERIOR
UNIVERSIDAD DE ALMERA
NDICE
Introduccin
Prcticas
Anlisis de alimentos y aguas
Microbiota aerobia mesfila
Enterobacterias totales
Hongos y levaduras
Microorganismos psicrtrofos
Recuento e identificacin de coliformes totales y fecales
Recuento e identificacin de Salmonella
Deteccin de Staphylococcus aureus en portadores sanos
Elaboracin de Alimentos
La levadura como agente esponjante de la masa panaria
Elaboracin de alimentos por fermentacin cido-lctica: Yogurt
Temporalizacin
Microbiologa de los Productos Agroalimentarios
Guin de prcticas
INTRODUCCIN
Los alimentos, al igual que el agua, no son, en general, productos estriles. En el caso del
agua, sobre todo en el caso del agua potable, adems de presentar una baja carga
microbiana, determinadas especies microbianas deben estar ausentes. En el caso de los
alimentos, la carga microbiana vara dependiendo del tipo de alimento.
La calidad microbiolgica del agua y de los productos alimentarios hace referencia a
dos aspectos fundamentales: la calidad higinico-sanitaria y la calidad comercial. La
primera tiene una gran importancia debido a que su ausencia conlleva un considerable
riesgo para la salud del consumidor, ya que tanto el agua como los alimentos pueden ser
vehculos de microorganismos patgenos. Respecto a la segunda, cabe sealar que hay
microorganismos que aunque carezcan de significado sanitario, pueden ser causa de la
alteracin del agua o alimento, modificando el color, aroma, sabor, consistencia o
aspecto.
TIPOS DE MICROORGANISMOS
Los anlisis microbiolgicos de aguas y alimentos, estn destinados a la bsqueda de
agentes infecciosos o toxignicos o de indicadores de una contaminacin no admisible,
de modo que se asegure la calidad higinico-sanitaria de los mismos. Aunque los
microorganismos ms importantes en cuanto a la salud pblica son aquellos que
desarrollan patologas, tales como Salmonella, Staphylococcus aureus, Psedomonas
aeruginosa, etc., existe un grupo de microorganismos de especial relevancia higinico-
sanitaria, los llamados "indicadores". Estos microorganismos no son necesariamente
patgenos, y su presencia se relaciona con la existencia de contaminacin, avisando de
la posible existencia de patgenos y otros microorganismos que pueden alterar el
producto. Estos microorganismos "indicadores" se analizan de forma rutinaria, y de
hecho, en la legislacin se considera su anlisis como un parmetro de calidad
microbiolgica.
El inters de la determinacin de estos grupos indicadores se centra en la
biodiversidad que los diferentes hbitats pueden presentar. Cada entorno se caracteriza
por albergar determinadas asociaciones microbianas, entre las que se pueden incluir
especies patgenas. Dichas especies no siempre resultan detectables de forma sencilla,
por lo que en numerosas ocasiones se determinan de forma indirecta a travs de otras
especies o grupos pertenecientes a la misma asociacin.
ESQUEMA GENERAL:
Los puntos bsicos a desarrollar en el anlisis microbiolgico de un alimento o de agua
son los siguientes:
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Microbiologa de los Productos Agroalimentarios
Guin de prcticas
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Microbiologa de los Productos Agroalimentarios
Guin de prcticas
PRCTICAS
HOMOGENEIZACION DE MUESTRAS
Material
Bolsas estriles.
Balanza.
Matraz con 90ml de caldo nutritivo.
Stomacher.
Esptulas estriles.
Procedimiento:
Pesar 10 g del alimento e introducir en bolsas estriles.
Adicionar los 90 ml de caldo nutritivo estril a las bolsas con alimento.
Introducir en stomacher y homogeneizar durante unos 30".
La suspensin obtenida se puede volver a pasar al matraz estril (donde originalmente
se localizaba el caldo nutritivo) para su mejor manejo. Esta suspensin se utilizar para
realizar todos los anlisis a la muestra.
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Microbiologa de los Productos Agroalimentarios
Guin de prcticas
Material
Tubos de ensayo 16x160mm con solucin salina.
Pipetas estriles de 1ml.
Estufa de cultivo.
Placas petri.
Tubos con Agar PCA (Plate Count Agar) a sobrefusin.
Procedimiento:
Deteccin y Recuento
Preparar diluciones decimales seriadas del alimento (10 -1 a 10-4).
Sembrar 1 ml de las dos ltimas diluciones en placas petri vacas.
Verter el Agar PCA a sobrefusin sobre las placas y homogeneizar con la muestra.
Incubar a 37C durante 24 y 48 horas.
Realizar lecturas a las 24 y 48 horas.
Lectura:
Contar las placas cuyo nmero de colonias est comprendido entre 30 y 300.
Multiplicar por el factor de dilucin y el volumen inoculado.
Expresar el resultado en UFC/g de alimento.
Resultados:
Material
Tubos de ensayo 16x160mm con solucin salina.
Pipetas estriles de 1ml.
Estufa de cultivo.
Placas petri con Agar PCA (Plate Count Agar).
Procedimiento:
Deteccin y Recuento
Preparar diluciones decimales seriadas del alimento (10 -1 a 10-4).
Sembrar 0,1 ml de las dos ltimas diluciones en placas petri.
Extender el volumen inoculado por toda la superficie.
Incubar a 37C durante 24 y 48 horas.
Realizar lecturas a las 24 y 48 horas.
Lectura:
Contar las placas cuyo nmero de colonias est comprendido entre 30 y 300.
Multiplicar por el factor de dilucin y el volumen inoculado.
Expresar el resultado en UFC/g de alimento.
Resultados:
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Guin de prcticas
Material
Tubos de ensayo 16x160mm con solucin salina.
Pipetas estriles de 1ml.
Estufa de cultivo.
Placas petri con Agar Rosa de Bengala.
Procedimiento:
Deteccin y Recuento
Preparar diluciones decimales seriadas del alimento (10 -1 a 10-3).
Sembrar 0,1 ml de las dos ltimas diluciones en placas petri.
Extender el volumen inoculado por toda la superficie.
Incubar a 25C durante 4 das y realizar lectura.
Lectura:
Contar las placas cuyo nmero de colonias est comprendido entre 20 y 80.
Multiplicar por el factor de dilucin y el volumen inoculado.
Expresar el resultado en UFC/g de alimento.
Resultados:
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Guin de prcticas
Bajo este nombre genrico se agrupan todas aquellas especies con capacidad para crecer
a temperaturas de refrigeracin, comprendidas entre 4 y 20C. De forma estricta, los
microorganismos psicrotrfos presentan una temperatura ptima de desarrollo entre 10 y
20C, aunque pueden llegar a crecer a valores inferiores a 5C. Seran, por tanto,
especies tolerantes. En oposicin, existen microorganismos que no slo toleran, sino que
demandan valores trmicos en torno a 0C para mostrar un correcto grado de
crecimiento. Son los denominados psicrfilos.
Material
Tubos de ensayo 16x160mm con solucin salina.
Pipetas estriles de 1ml.
Estufa de cultivo.
Placas petri con Agar PCA.
Procedimiento:
Deteccin y Recuento
Preparar diluciones decimales seriadas del alimento (10 -1 a 10-3).
Sembrar 0,1 ml de las dos ltimas diluciones en placas petri.
Extender el volumen inoculado por toda la superficie.
Incubar a 20C durante 5 das y realizar lectura.
Lectura:
Contar las placas cuyo nmero de colonias est comprendido entre 30 y 300.
Multiplicar por el factor de dilucin y el volumen inoculado.
Expresar el resultado en UFC/g de alimento.
Resultados:
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Guin de prcticas
Material
Pipetas de 1ml estriles.
Asa de cultivo.
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Guin de prcticas
Procedimiento:
Deteccin y recuento
Realizar diluciones decimales seriadas del alimento (10 -1 a 10-4).
Depositar 1ml de cada dilucin en placas Petri estriles.
Verter 15ml de V.R.B.G. atemperado a 45-47C.
Mezclar cuidadosamente, dejar solidificar e incubar a 37C durante 18-24 horas.
Anlisis Presuntivo:
Contar colonias teidas de color rojo-violeta con halo prpura de precipitado de sales
biliares o todas las colonias, en caso de utilizar MacConkey. Estos medios permiten a la
vez diferenciar entre los dos grupos principales de enterobacterias:
Lactosa positivas: En este grupo se incluyen los coliformes, que estudiaremos con
ms detalle en la prctica siguiente.
Lactosa negativas: Grupo en el que se incluye la mayora de enterobacterias
patgenas (ej. Salmonella, Shigella, Yersinia).
Anlisis confirmativo:
Tomar colonias de distinta morfologa rodeadas de halo prpura (o de los principales
tipos) y realizar la prueba de la citocromo oxidasa (ver Anexo F). Esta prueba permite
discernir si las colonias crecidas son enterobacterias u otra bacteria que puede crecer en
dicho medio pero no es una enterobacteria, Pseudomonas. Esta bacteria es oxidasa
positiva y las enterobacterias son oxidasa negativas.
Resultados
Recuento: Nmero de enterobacterias totales. Se multiplica las colonias contadas en
medio VRBG y confirmadas, por el factor de dilucin en placa.
Confirmativo: Las enterobacterias son citocromo-oxidasa negativas.
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Tabla 2. Principales aspectos relacionados con los gneros pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae
Lactosa Gnero Hbitats Patogenicidad
Fermentan Escherichia U. Tracto intestinal de animales de sangre caliente y hombre Biotipos y serotipos producen
lactosa gastroenteritis
Enterobacte
r Suelo, agua, agua residual, tracto intestinal hombre y animales Trastornos gastroentricos
Klebsiella 2 Agua, suelo, aguas residuales, tracto respiratorio e intestinal Gastroenteritis, alergias
Citrobacter 3 Intestino, suelo, aguas fecales y alimentos Discutido
Serratia 4 U. Alimentos Patgeno oportunista
U: Muy distribuido en la naturaleza
1
Fermenta excepcionalmente la lactosa
2
Excepto Kb.pneumoniae sb rhinoscleromatis
3
Fermentan la lactosa un 75 % de las cepas
4
Fermantacin de lactosa variable
5
E. Torda se ha encontrado en heces normales y diarreicas
6
Aislado en heces diarricas, infecciones tractourinario
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5.- COLIFORMES
Los coliformes son bacilos gram negativos, no esporgenos pertenecientes a la familia
Enterobacteriaceae que fermentan la lactosa en 48 horas (son las enterobacterias
fermentadoras de la lactosa) con produccin de cido y gas en presencia de sales
biliares.
En este grupo se incluyen cuatro gneros: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter y
Klebsiella, adems de algunas cepas de Serratia (ver Tabla 3).
Material
Tubos de ensayo 16x160mm.
Gradillas.
Pipetas estriles de 10 y 1ml.
Estufa de cultivo.
Tubos con 10 ml caldo lactosado biliado verde brillante (BGBL) y campana Durham.
Agar EMB (eosina azul de metileno).
Procedimiento:
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Lectura e interpretacin:
Observacin de la generacin de gas depositado en la campana Durham (al menos en
1/10 parte de su volumen) y de la aparicin de coloracin amarilla en el medio de cultivo
como consecuencia de la fermentacin de la lactosa.
Confirmacin:
Sembrar por estra (aislamiento) con asa de platino los tubos positivos en agar EMB.
Incubar a 35C durante 24-48 horas.
La aparicin de colonias con brillo verde metlico o negras confirma la presencia de
coliformes.
Anotar el nmero de tubos confirmados en cada serie y recurrir a la tabla del NMP
donde se obtiene el recuento por gramo o mililitro de alimento.
Tabla 2. NMP
Nmero de tubos positivos en cada
dilucin
Dilucin 10 -1
Dilucin 10-2 Dilucin 10-3 NMP por gramo o mililitro
0 0 <3
0 0 01 3
0 1 0 3
1 0 0 4
1 0 1 7
1 1 0 7
1 1 1 11
1 2 0 11
2 0 0 9
2 0 1 14
2 1 0 15
2 1 1 20
2 2 0 21
2 2 1 28
3 0 0 23
3 0 1 39
3 0 2 64
3 1 0 43
3 1 1 70
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3 2 0 90
3 2 1 150
3 2 2 210
3 3 0 200
3 3 1 500
3 3 2 1100
3 3 3 >2400
* Para calcular el NMP de diluciones mayores de las que figuran en la tabla, multiplicar el NMP por
el factor adecuado. Ejemplo: Si los tubos seleccionados corresponden a las diluciones 10- 3, 10-4 y
10-5 multiplicar por 100.
Resultados:
NMP coliformes/g:
NMP coliformes fecales/g:
Material
Sistema de filtracin.
Filtros de 0,45 m.
Pinzas
Placas petri con Agar EMB (eosina azul de metileno).
Procedimiento:
La deteccin de este grupo se fundamenta en su capacidad para fermentar la lactosa en
presencia de sales biliares. La cuantificacin se realiza mediante la tcnica del nmero
mas probable (NMP).
Deteccin y Recuento
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Lectura e interpretacin:
Observacin de las colonias aparecidas sobre el filtro. Todas aquellas de tonalidad azul
oscura con brillo verde metlico son consideradas fermentadoras de lactosa y, por tanto,
coliformes.
Resultados
Recuento: Nmero de coliformes. Se divide el nmero de colonias obtenidas por el
volumen analizado.
UFC coliformes/ml:
Material
Pipetas de 1ml estriles.
Asa de cultivo.
Placas Petri estriles.
Medios de cultivo:
Medio de preenriquecimiento: Caldo nutritivo.
Medio de enriquecimiento: Caldo selenito-cistina.
Medio para deteccin: Agar Hektoen.
Reactivo para la prueba citocromo-oxidasa.
Procedimiento:
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Lectura:
Las colonias de Salmonella en agar Hektoen aparecen verde azuladas con o sin centro
negro.
Resultados
Se expresan como presencia o ausencia en 25 g de alimento.
Material
Torunda de algodn.
Asa de cultivo.
Placas con medio de Chapman (manitol, 7,5% NaCl, rojo fenol).
Procedimiento:
Tomar en condiciones aspticas muestra de la fosa nasal del posible portador.
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Lectura:
S. aureus forma colonias de color amarillento en el medio de Chapman.
Anlisis confirmativo:
Tomar colonias sospechosas y realizar prueba de la DNAsa.
Resultados
Se expresan como presencia o ausencia de S. aureus DNAsa positivos.
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Las levaduras pueden llegar a generar hasta 350 ml de CO 2 por cada 100 g de masa,
hasta un 60% ms del volumen que se consigue con las levaduras sintticas, en las que
el bicarbonato sdico supone una parte importante. La especie predominante es
Saccharomyces cerevisiae, pero no resulta infrecuente la participacin de otras especies
del gnero. El proceso de produccin de la masa panaria se lleva a cabo e diferentes
etapas, en cada una de las cuales tiene lugar el crecimiento microbiano sobre una mezcla
adecuada de agua y harina. En la fase inicial de cada una de las etapas se desarrollan
preferentemente las levaduras, modificando la porosidad de la masa, y posteriormente
crecen los lactobacilos, que influyen de forma mayoritaria sobre la concentracin de
cidos. Durante el proceso se observa un incremento de la temperatura de 22-24C hasta
28-30C.
La masa obtenida se moldea en la forma adecuada y se cuece. Las condiciones de
temperatura y tiempo aplicadas dependen del tipo de pan y de su peso. No obstante, la
zona externa siempre alcanza valores trmicos superiores, hasta el punto de que se
produce la caramelizacin de algunos azcares, lo que favorece la formacin de la
corteza. El resto de la masa experimenta prdida de agua y formacin de compuestos
que contribuyen al aroma y sabor definitivos del pan. Las protenas presentes se
coagulan, proporcionando una mayor consistencia a la masa y, en general, se incrementa
la digestibilidad del producto.
Material
Vasos de precipitado de 250 ml (4).
Matras Erlenmeyer de 250 ml.
Pipeta de 10 ml.
Harina de trigo.
Glucosa.
Balanza.
Estufa.
Procedimiento:
Numerar los vasos de precipitado del 1 al 4.
Aadir a cada uno 25 g de harina de trigo.
Aadir 3 g de glucosa a los vasos 1, 2 y 3.
Aadir 22,5 ml de agua al vaso 1 y 15 ml al 2.
Preparar la suspensin de levadura por adicin de 10 g en 120 ml de agua templada.
Aadir 7,5 ml de la suspensin al vaso 1, 15 ml al vaso 2, y 30 ml a los vasos 3 y 4 y
mezclar adecuadamente.
Incubar a 30C durante 90 minutos e ir observando el incremento de volumen.
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DESARROLLO PRCTICO
Material
Leche fresca entera
Yogur
Vaso de precipitado
Placa Petri
Varilla de vidrio
Procedimiento
Pasteurizar la leche fresca a 85C durante 5 minutos.
Dejar enfriar hasta 50 C.
Inocular con una pequea cucharada de yogur y mezclar bien con la varilla de vidrio.
Tapar con la placa de Petri e incubar a 40C durante 9-12 horas.
Enfriar en refrigerador y conservar.
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Realizar una tincin de Gram a partir del yogur elaborado o del comercial.
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