1

2
 Ministerio de Salud
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
Jr. Cpac Yupanqui 1400, Jess Mara
Telf. 471-3254 / Fax: 471-7443
Lima, Per, 1997

Diseo e impresin : Art. Lautrec S.R.Ltda.

3
 MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO
PARA EL DIAGNOSTICO DE MICOSIS
OPORTUNISTAS Y PROFUNDAS

COMIT DE REDACCION:
Dra. Susana Zurita Macalupu
Blgo. Jos Casquero Cavero

COMIT EDITOR:
Dr. Alfonso Zavaleta Martnez-Vargas
Dr. Csar Cabezas Snchez
Dr. Carlos Carrillo Parodi
Dr. Jaime Chang Neyra

MINISTERIO DE SALUD
ALTA DIRECCIN
Dr. Marino Costa Bauer
Ministro

Dr. Alejandro Aguinaga Recuenco

Viceministro

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

Dr. Carlos Carrillo Parodi
Jefe

CENTRO NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PUBLICA

Dr. Csar Cabezas Snchez
Director General

4
PERFIL DE LOS AUTORES

Dra. Susana Zurita Macalupu

Mdico Cirujano, Especialista en Enfermedades Infecciosas y Tropicales
Jefe, Divisin de Micologa, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pblica, INS, MINSA
Profesor Auxiliar, Departamento Acadmico de Microbiologa, Facultad de Ciencias y Filosofa, Universidad Peruana Cayetano
Heredia

Blgo. Jos Casquero Cavero

Bilogo, Egresado de Maestra en Microbiologa Escuela de Postgrado Vctor Alzamora Castro Universidad Peruana Cayetano
Heredia
Jefe, Laboratorio de Micosis Oportunista, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pblica, INS, MINSA

PERFIL DE LOS EDITORES

Dr. Alfonso Zavaleta Martnez-Vargas

Mdico Cirujano, Doctor en Farmacologa
Director General, Centro Nacional de Control de Calidad, INS, MINSA
Profesor Principal, Seccin Farmacologa, Departamento Acadmico de Ciencias Fisiolgicas, Facultad de Ciencias y Filosofa,
Universidad Peruana Cayetano Heredia
Miembro, Instituto de Medicina Tropical Alexander Von Humbolt, Universidad Peruana Cayetano Heredia.

Dr. Csar Cabezas Snchez

Mdico Cirujano, Master en Medicina, Especialista en Enfermedades Infecciosas y Tropicales
Director General, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pblica, INS, MINSA.
Profesor invitado de Medicina Tropical, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Universidad Peruana Cayetano Heredia.

Dr. Carlos Carrillo Parodi

Mdico Cirujano, Doctor en Medicina
Profesor Principal, Departamento Acadmico de Microbiologa, Facultad de Ciencias y Filosofa, Universidad Peruana Cayetano
Heredia.
Jefe, Instituto Nacional de Salud

Dr. Jaime Chang Neyra

Mdico Cirujano, Master of Science in Community Health in Developing Countries
Director Ejecutivo de Garanta de la Calidad, Centro Nacional de Control de Calidad, INS, MINSA
Investigador, Instituto de Medicina Tropical Alexander Von Humbolt, Universidad Peruana Cayetano Heredia.

La edicin de este Manual se efectu en el marco del Convenio de Cooperacin suscrito entre el Instituto Nacional de Salud y la
Universidad Peruana Cayetano Heredia.
El Comit Editor agradece al Dr. Jorge Barnaby Rodrguez, por la revisin y los comentarioes efectuados a esta obra.

5
 INDICE

Presentacin ..................................................................................................................................... 7
Resolucin Jefatural ......................................................................................................................... 9

CAPITULO I
Introduccin ..................................................................................................................................... 11

CAPITULO II
Bioseguridad .................................................................................................................................... 17

CAPITULO III
Obtencin de la Muestra .................................................................................................................. 23

CAPITULO IV
Procesamiento de la Muestra ............................................................................................................ 25

CAPITULO V
Reactivos y Medios de Cultivo ........................................................................................................ 27

CAPITULO VI
Identificacin de Hongos Patgenos ................................................................................................ 33

CAPITULO VII
Transporte y Remisin de Muestras ................................................................................................. 47

CAPITULO VIII
Bibliografa ...................................................................................................................................... 49

CAPITULO IX
ANEXOS ......................................................................................................................................... 51
Anexo 1:
Ficha epidemiolgica ....................................................................................................................... 53
Anexo 2:
Fluxograma para identificar hongos Patgenos verdaderos ............................................................. 55
Anexo 3:
Fluxograma para identificar principales Mohos patgenos .............................................................. 57
Anexo 4:
GLOSARIO ..................................................................................................................................... 59

6
 PRESENTACIN

Las micosis humanas son infecciones frecuentes en nuestra poblacin en todo el territorio
nacional. A nivel mundial las micosis por oportunistas y profundas son cada vez ms frecuentes
y actualmente tienen una alta prevalencia. El empleo de antibiticos de amplio espectro, la
quimioterapia en cncer, los transplantes de rganos, la infeccin con VIH, y otros procedi-
mientos teraputicos son las causas principales de la emergencia de las micosis por oportunistas
y profundas en especial como complicacin grave.

El laboratorio de diagnstico juega hoy da, un rol cada vez ms importante para confirmar
la presencia del agente etiolgico y complementar el manejo clnico para proporcionar un
tratamiento ms adecuado al paciente.

El Instituto Nacional de Salud en cumplimiento de la poltica sectorial, presenta el manual

para Procedimientos de laboratorio para el diagnstico de Micosis Oportunistas y Profundas,
dirigido a personal profesional y tcnico en esta rea, con la finalidad de promover las Buenas
Prcticas de Laboratorio Diagnstico desde la recepcin de la muestra hasta el aislamiento e
identificacin del agente etiolgico de la enfermedad, reforzar las medidas de bioseguridad y
difundir el conocimiento tcnico cientfico en la especialidad.

EL COMIT EDITOR
.

7
8
 CAPITULO I

INTRODUCCION

El Instituto Nacional de Salud a travs de su rgano tcnico normativo el Centro Nacional de

Laboratorios en Salud Pblica promueve, fortalece y desarrolla la Red Nacional de Laboratorios;
asimismo acta como Centro de Referencia de los Laboratorios del pas y brinda capacitacin
especializada al personal de salud con la finalidad de realizar vigilancia epidemiolgica de las
enfermedades transmisibles, control de las mismas y participar en investigaciones epidemiolgicas.

La Divisin de Micologa y sus componentes los Laboratorios de Micosis Oportunista y de Micosis

Profunda han elaborado este manual con la finalidad de establecer criterios uniformes para la
identificacin de los principales hongos que originan estas etiologas en nuestro pas.

A continuacin se presentan algunas definiciones y se describen las principales caractersticas de los

hongos patgenos ms comunes.

1.1 MICOLOGIA MEDICA

Estudia las manifestaciones patolgicas causadas directa o indirectamente por hongos patgenos. El
diagnstico definitivo de las infecciones micticas est basado en la informacin que proporciona el
laboratorio. Los mtodos diagnsticos son el examen directo y cultivo con aislamiento e
identificacin del agente etiolgico a partir del espcimen. La eficiencia de estos mtodos depender
de la apropiada toma de muestra y del envo al laboratorio para el procesamiento respectivo.

1.2 MICOSIS OPORTUNISTA

Son infecciones causadas por hongos saprofitos que estn mediadas por factores predisponentes
(TBC cavitaria, neoplasia, infeccin-HIV, uso de antibiticos de amplio espectro, drogadiccin,
alcoholismo, diabetes, embarazo, etc...) presentes en el hospedero humano. Entre las principales
infecciones tenemos: Aspergilosis, Criptococosis, Candidiasis, y Fusariosis. Por lo tanto los agentes
micticos de mayor incidencia son Candida spp., Cryptococcus neoformans, Aspergillus spp. y
Fusarium spp.

1.2.1. Candida spp.

Es un gnero que se encuentra distribuido universalmente y forma parte de la flora nonnal de
las mucosas del tracto gastrointestinal y genitourinario del hombre, por lo que la principal
fuente de infeccin es endgena. La infeccin puede ser aguda o crnica, superficial o
profunda presentando un amplio espectro de manifestaciones clnicas: Candidiasis cutnea,
ungueal, sistmica, y de mucosas. Entre las especies ms frecuentes tenemos a Candida
albicans, Candida tropicalis, Candida krusei y Candida glabrata. La identificacin se realiza
macroscpicamente y mediante pruebas morfolgicas, bioqumicas y fisiolgicas.

1.2.2 Aspergillus spp.

Presenta una distribucin mundial y es ubicuo en la naturaleza. Se le encuentra con mayor
frecuencia en ambientes hmedos asociado a material orgnico (plantas, tierras, telas, granos
almacenados y filtros de aire acondicionado). La clasificacin clnica basada en la asociacin
hongo-hospedero refiere tres grupos de enfermedades: Aspergilosis pulmonar, colonizacin
por Aspergillus, y Aspergilosis invasiva. Se han estudiado ms de un centenar de especies,
pero slo tres originan la mayora de las infecciones en el hombre: Aspergillus fumigatus,
Aspergillus flavus y Aspergillus niger.

1.2.3 Cryptococcus neoformans

9
 La criptococosis humana es causada principalmente por Cryptococcus neoformans y se
encuentra asociada a pacientes infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).
Este es un hongo monomrfico que se caracteriza por presentar una cpsula de
mucopolisacrido visualizada al examen directo utilizando tinta china. Se le puede distinguir
en dos variedades segn el tipo de hbitat, esto es C. neofonnans var. neoformans asociado a
suelo contaminado con excretas de palomas y C. neoformans var. gattii asociado a rboles de
Eucalyptus en floracin.

1.2.4 Fusarium spp.

Microorganismo presente en forma comn en suelo y como patgeno de plantas. Es uno de
los agentes etiolgicos que ocasionan la Hialohifomicosis, infeccin que agrupa a hongos de
tipo oportunista que se caracterizan por presentar una clnica heterognea. La caracterstica
comn de esta micosis es el desarrollo de hifas hialinas, septadas en los tejidos del hospedero.
Dentro de las infecciones localizadas se diagnostican casos de queratitis, endoftalmitis,
peritonitis, infeccin nasal y pulmonar, articulaciones y lesiones post-traumticas del hueso.
En los ltimos aos se describe en forma creciente infecciones invasivas en pacientes
neutropnicos.

1.3 MICOSIS PROFUNDA

Denominada tambin micosis sistmica. La va de ingreso es a travs de la inhalacin de esporas del

hongo hacia el pulmn, a partir de la cual puede diseminarse a otros rganos llegando a producir la
muerte del paciente. Entre los agentes etiolgicos causantes de este tipo de infeccin en nuestro pas
tenemos: Paracoccidioides brasiliensis, e Histoplasma capsulatum.

1.3.1 Paracoccidioides brasiliensis

Este hongo dimrfico produce la infeccin denominada Paracoccidioidomicosis la cual
constituye una de las micosis sistmicas por hongos verdaderos patgenos ms importantes en
Amrica Latina. Actualmente se desconoce su hbitat natural pero todo indica al suelo de
zonas endmicas como probable nicho ecolgico.
La infeccin es primariamente de origen pulmonar presentndose como un infiltrado
micronodular simulando una tuberculosis. Con frecuencia la enfermedad involucra boca,
cavidades nasales, amgdalas o laringe producindose lceras supurativas y granulomatosas
progresivas.
En nuestro pas se reportan como zonas endmicas Quillabamba (Cusco), Sibia y San
Francisco (Ayacucho), Chanchamayo (La Merced).

1.3.2 Histoplasma capsulatum var. Capsulatum

Es el agente etiolgico de la Histoplasmosis clsica. La infeccin se adquiere por inhalacin
de conidias y fragmentos de hifas al tener contacto el hospedero con polvo de lugares como
cavernas, cuevas donde se acumulan excretas de aves y murcilagos compuestos de elevado
contenido de nitrgeno.
La forma comn de esta enfermedad es la infeccin subclnica y afecta a individuos con
inmunidad celular disminuida, cncer, infeccin por VIH, y verruga peruana. En nuestro pas
existen reportes de reas endmicas como Hunuco (Cueva de las Lechuzas), Tingo Mara,
Pucallpa, y San Francisco (Ayacucho). La Histoplasmosis diseminada ha sido incluida por el
Centro de Enfermedades Comunicables de Atlanta-Estados Unidos como una de las
infecciones oportunistas que definen el caso de SIDA.

En la Tabla 1 se muestra la relacin existente entre el tipo de Muestra y Micosis.

En la Tabla 2 se muestran las principales caractersticas fngicas al examen directo.

10
 TABLA 1
RELACION ENTRE TIPO DE MUESTRA Y MICOSIS

11
 TABLA 2
CARACTERISTICAS FUNGICAS AL EXAMEN DIRECTO

12
 CAPITULO II

BIOSEGURIDAD

2.1. CONCEPTOS GENERALES:

2.1.1 Definicin
Es un conjunto de medidas preventivas de sentido comn que permiten proteger la salud y la
seguridad del personal que labora en laboratorio frente a diferentes riesgos producidos por
agentes biolgicos, fsicos, qumicos, y mecnicos.

2.1.2 Agentes de riesgo

Las actividades que realiza el personal de laboratorio le pueden originar enfermedades o
dao, pudiendo afectar a sus familiares y a la comunidad.
Estas enfermedades pueden ser causadas por:
- Agentes biolgicos transmitidos por ingestin, inhalacin, inoculacin, por contacto
directo a travs de la piel, y por la formacin de aerosoles.
- Agentes fsicos y mecnicos como las temperaturas extremas, radiaciones ionizantes,
contactos elctricos, o conexiones defectuosas, vidrios resquebrajados de recipientes
daados o tubos rotos.
- Agentes qumicos que pueden ser: Corrosivos causando destruccin o alteracin de los
tejidos; Txicos cuyos efectos se manifiestan segn la va de exposicin, por inhalacin,
ingestin o contacto directo con mucosas o piel, carcinognicos, inflamables, o explosi-
vos.

2.2. MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICOLOGIA

- El Laboratorio debe de estar adecuadamente ventilado e iluminado, funcionando

correctamente los servicios de luz, agua, desage y gas.
- Colocar en la puerta de acceso al rea de trabajo y en forma obligatoria la seal de RIESGO
BIOLOGICO.
- Usar zapatos cerrados que cubran la totalidad del pie.
- Usar mandil limpio de manga larga.
- Pipetear reactivos o fluidos corporales con una propipeta.
- Limpiar los pisos del laboratorio con una tela limpia impregnada con desinfectante.
- Desinfectar el rea de trabajo diariamente, evitando la acumulacin de polvo en las esquinas o
grietas, donde las esporas y conidias pueden germinar.
- No colocar plantas en el laboratorio.
- No comer ni almacenar alimentos en el laboratorio.
- Tratar a todas las muestras como altamente infecciosas evitando un posible contagio.
- Nunca oler un cultivo de hongo.
- Utilizar cabina de bioseguridad para manipular mohos aislados de secreciones respiratorias,
biopsias, orina, sangre, y lquido-cefaloraquideo.
- Manipular en cabina de bioseguridad las formas infectantes de hongos sistmicos.
- Antes de descartar los cultivos esterilizarlos por autoclave.
- Las pipetas de vidrio reutilizable, pipetas Pasteur, lminas portaobjetos y cubreobjetos deben
ser colocadas horizontalmente en un depsito con desinfectante para proceder a esterilizarlas.

2.3. AGENTES MICOTICOS

2.3.1 Cryptococcus neoformans

Slo se ha reportado una exposicin en el laboratorio a Cryptococcus neoformans, en la cual
se produjo una laceracin por una hoja de bistur muy contaminada con clulas
encapsuladas. Esta fuerte exposicin no produjo infeccin local o sistmica lo que sugiere

13
 que el nivel de patogenicidad es bajo. No se ha reportado infecciones respiratorias como
consecuencia de la exposicin en Laboratorio.

Riesgo de Laboratorio: La inoculacin accidental parenteral de cultivos u otros materiales

infecciosos, mordidas por ratones infectados o manipular materiales infectados representa un
riesgo potencial para el personal de Laboratorio, particularmente aquellos que pueden ser
inmunocomprometidos. (Tabla 3)

Precauciones Recomendadas: Nivel de bioseguridad 2 para trabajar con muestras clnicas,

cultivos o con animales experimentales infectados. Nivel 1 2 para trabajar con muestras de
suelos u otros materiales afines. (Tabla 4)

2.3.2 Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides brasiliensis

La histoplasmosis es un peligro documentado; se han reportado infecciones pulmonares
como resultado de un pinchazo accidental con una aguja de cultivo viable, colectando o
procesando muestras de tierras de reas endmicas. Las esporas son resistentes al secado y
pueden permanecer viables por largos perodos de tiempo. El pequeo tamao de la
macroconidia (< 5 um) hace que se pueda producir una dispersin en el aire y retencin
pulmonar. Se seala que slo 10 esporas son capaces de producir muerte en ratones.
Asimismo la Paracoccidioidomicosis con base en el frecuente compromiso pulmonar de los
pacientes y en los datos experimentales disponibles, se acepta que el hongo ingresa al
hospedero por va inhalatoria a partir de muestras que contengan conidias infectantes.

Riesgos de Laboratorio: La forma infecciosa de estos hongos dimrficos (conidia) est

presente en los cultivos y en tierras de reas endmicas. La forma levaduriforme est
presente en tejidos o fluidos de animales infectados.

Precauciones Recomendadas: Nivel de bioseguridad 2 para las actividades con materiales

clnicos, tejido animal y animales infectados. Nivel de bioseguridad 3 para procesar los
cultivos de moho, tierra y otros materiales que se conozca que contengan conidias infec-
ciosas. (Tabla 4)

14
 TABLA 3
CLASIFICACION DE HONGOS SEGN GRUPO DE RIESGO

15
 TABLA 4
NIVELES DE BIOSEGURIDAD

16
 CAPITULO III

OBTENCION DE LA MUESTRA

El paciente debe estar sin terapia antimictica. De lo contrario suspender el tratamiento cinco das antes
de la obtencin de la muestra. En el caso de utilizar hisopos de algodn estriles para la toma de
muestras y una vez realizada sta colocar los hisopos en tubos de vidrio con tapa rosca conteniendo 1
mL de solucin salina estril.

En el Anexo 1 se muestra la ficha recomendada para el Registro de los datos epidemiolgicos necesarios
para la toma de la muestra.

3.1. MUCOSA ORAL

Se obtienen por raspado de superficies epiteliales daadas utilizando un bistur romo o esptula y en
el caso de observar placas blanquecinas recolectar mediante hisopo de algodn.

3.2. MUCOSA VAGINAL

Se realiza mediante la utilizacin de un espculo introduciendo un hisopo de algodn estril en el

fondo del saco vaginal rotndolo por espacio de 10 a 15 segundos aproximadamente. La muestra
debe ser tomada por un mdico.

3.3. MUCOSA GENITAL MASCULINA Y PERIANAL

Los especmenes se recolectarn de la zona interna del prepucio y glande con ayuda de un hisopo de
algodn estril, y de la zona perianal se realizar mediante un bistur romo o hisopo de algodn.

3.4. ESPUTO

El paciente antes de emitir la muestra deber haber realizado una higiene bucal previa con solucin
salina y permanecer en ayunas. Para emitir la muestra realizar una inspiracin profunda expirando
fuertemente y tosiendo al mismo tiempo. En el caso de no expectorar se inducir una nebulizacin.
La muestra ser vertida en un frasco de vidrio o recipiente estril descartable de cierre hermtico (30
mL de capacidad aproximadamente). Aquellas muestras que contengan trazas de saliva, alimentos y
secreciones nasales o farngeas no sern procesadas. Para ejecutar un adecuado diagnnstico de
laboratorio se recomienda obtener como mnimo 3 muestras seriadas consecutivas.

3.5. CEPILLADO BRONQUIAL Y LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA)

Es realizado por el mdico especialista mediante un broncoscopio de fibra ptica. La muestra deber
ser colocada en un tubo o frasco estril de tapa rosca.

3.6. ORINA

En el caso de mujeres realizar un lavado previo de genitales externos. Depositar 40 a 50 mL de

muestra a partir del chorro medio en un frasco de vidrio estril de boca ancha o en un recipiente
descartable de cierre hermtico. Los especmenes tambin pueden ser obtenidos mediante puncin
suprapbica o a travs de un catter instalado con esa finalidad. En el caso de nios utilizar bolsas
colectoras colocadas preferentemente en el centro de salud.

3.7. LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO (LCR)

Es realizado por un mdico mediante puncin lumbar. La muestra ser vertida en un tubo de vidrio
estril de tapa rosca. Para un adecuado examen micolgico se requiere como mnimo 5 mL.

17
3.8. ABSCESOS CERRADOS, FISTULAS Y ULCERAS

Limpiar la zona afectada y realizar una puncin aspiracin mediante una jeringa con aguja N 18
conteniendo 0,5 a 1,0 mL de solucin salina estril.

3.9. BIOPSIA

Es realizado por el mdico a partir de los bordes de la lesin. La muestra ser colocada en una placa
petri o en un frasco de vidrio conteniendo solucin salina estril. De realizarse extendidos stos no
sern coloreados hasta su llegada al laboratorio (Patologa: Hematoxilina-eosina o Mucicarmin de
Mayer).

3.10 LIQUIDOS CORPORALES

Se realiza mediante una aspiracin percutnea o drenaje utilizando una jeringa o tubo estril de tapa
rosca conteniendo anticoagulante.

18
 CAPITULO IV

PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA

Consiste en realizar un examen directo (KOH 10%, Tinta china, Giemsa), mediante una tcnica sencilla y
rpida de implementar en cualquier laboratorio, proporciona un diagnstico presuntivo o preliminar,
mientras que el definitivo lo proporciona el Cultivo. Todo tipo de muestras se debe trabajar cerca a un
mechero de alcohol o bunsen, no olvidando de tomar las medidas de bioseguridad anteriormente
sealadas. El cultivo (Agar Sabouraud Dextrosa) se realiza por duplicado y se incuba a 2 temperaturas
(25 C y 37 C) para demostrar el dimorfismo en aquellos gneros que lo presenten.

4.1. MUCOSA ORAL, GENITAL, PERIANAL

Colocar en una lmina portaobjeto una gota de KOH 10% con la muestra. Homogenizar
suavemente con ayuda de una laminilla. Observar al microscopio. Controlar el cultivo diariamente
hasta por un lapso de 15 das.

4.2. LIQUIDO CEFALORAQUIDEO

Centrifugar a 3000 r.p.m. por 30 minutos. A partir del sedimento realizar el examen directo. No
desechar el sobrenadante a partir del cual se podrn hacer pruebas serolgicas. Controlar los
cultivos hasta por 4 semanas.

4.3. ORINA

Centrifugar la muestra a 3000 r.p.m. por 10 minutos. El sobrenadante se puede emplear para
inmunodiagnstico, mientras que del sedimento se realizar el examen directo y el cultivo. Incubar
a 25C. Controlar hasta por 30 das.

4.4. ESPUTO-CEPILLADO BRONQUIAL-LAVADO BRONCOALVEOLAR

De encontrarse muy adheridas las muestras a las paredes de los recipientes que las contienen se
puede aadir 1 mL de solucin salina estril. El examen directo se realiza utilizando KOH,
mientras que el cultivo se controla hasta por 4 semanas.

4.5. BIOPSIA-FISTULA-ULCERAS-ABCESOS CERRADOS

El examen direclo se realiza usando KOH homogenizando con la muestra a estudiar. Controlar el
cultivo por espacio de 4 semanas.

4.6. LIQUIDOS CORPORALES

Si la muestra es purulenta no necesita ser centrifugada, de lo contrario centrifugar a 3000 r.p.m.

por 10 minutos. Los exmenes micolgicos (examen directo y cultivo) se realizan a partir del
sedimento.

19
 CAPITULO V

REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO

5.1 REACTIVOS

5.1.1 Hidrxido de Potasio:

Es el reactivo que ms se utiliza en micologa mdica. Digiere el material proteico, aclara los
pigmentos, y disuelve el cemento que mantiene pegadas a las clulas queratinizadas y las de
otros tejidos, permitiendo observar elementos fngicos.

KOH ........................................................................................................ 10 g
Agua destilada ....................................................................................... 100 mL

Preparacin:
- Agregar los cristales de KOH al agua destilada.
- Mezclar hasta disolver totalmente.
- Cuando se observen precipitados filtrar con papel filtro.

Nota: Se puede aadir Glicerol al 20%, para evitar la precipitacin del KOH.

5.1.2 Tinta china:

Es un mtodo de contraste que permite visualizar microscpicamente la presencia de la cpsula
de Cryptococcus neoformans al no poder penetrarla. Se utiliza tinta china.

20
 5.1.2.a Tcnica: (KOH y tinta china)
- Colocar una gota de KOH 10% y tinta china sobre una lmina portaobjeto.
- Agregar una gota de la muestra. Mezclar.
- Colocar una laminilla. Evitar la formacin de burbujas de aire.
- Observar al microscopio con objetivos de 10X y 40X.

5.1.3 Coloracin Giemsa:

Se utiliza para el diagnstico de Histoplasmosis.

5.1.3.a Solucin concentrada del colorante:

Giemsa en polvo ............................................................................... 0,6 g
Metanol ............................................................................................. 50,0 mL
Glicerina neutra ................................................................................. 50,0 mL

5.1.3.b Preparacin:
- Triturar el colorante en un mortero con 30 mL de glicerina.
- Transferir la mezcla a un frasco limpio y completar el volumen de glicerina.
- Colocar al bao Mara a 55 C por 2 horas.
- Utilizar 20 mL de alcohol para remover el colorante adherido al mortero.
- Retirar el frasco del bao Mara. Dejar enfriar. Completar el volumen de alcohol.
- Dejar reposar el colorante por 2 semanas. Luego filtrar.
- Guardar la solucin en frasco mbar.

5.1.3.c Solucin Tampn pH 7,2:

Na2HPO4 ............................................................................................... 6,77 g
KH2PO4 ................................................................................................. 2,59 g
Agua destilada ...................................................................................... 100 mL

5.1.3.d Solucin de Trabajo:

Solucin concentrada del colorante ........................................................... 2 mL
Solucin Tampn ....................................................................................... 6 mL
Agua destilada ...................................................................................... 1000 mL
Mezclar.

5.1.3.e Tcnica:
- Fijar el extendido con metanol por 3 a 5 minutos.
- Agregar la solucin de trabajo por 15 minutos.
- Lavar con agua.
- Secar la lmina. Observar al microscopio con objetivo de inmersin.

5.2 MEDIOS DE CULTIVO

5.2.1 Agar Sabouraud Dextrosa:

Es el medio de cultivo que ms se utiliza en micologa mdica debido a que las caractersticas

21
 que se estudian y describen se ajustan cuando los hongos desarrollan sobre este medio de
cultivo (no se sugiere ninguna marca en especial). Para inhibir el desarrollo bacteriano se
puede agregar Cloramfenicol al 0,05%.

Dextrosa .............................................................................................................. 20 g
Peptona ............................................................................................................... 10 g
Agar .................................................................................................................... 20 g
Agua destilada ................................................................................................. 1000 mL

pH final: 7,0 + 0,2 a 25 C. Disolver y autoclavar a 121 C por 15 minutos.

Preparacin del antibitico:

Disolver una cpsula de Cloramfenicol de 250 mg en 10 mL de metanol. Agregar 2 mL del
antibitico en un litro de Agar Sabouraud Dextrosa estril a 45 a 50 C. Vertir en placas o
tubos.

5.2.2 Agar Harina de Maz:

Se utiliza para realizar la prueba de Clamidospora. Se puede adquirir en forma comercial como
Com Meal Agar (Difco), Agar Clamidospora (BBL), o preparar ingrediente por ingrediente.

Harina de maz amarillo .............................................................................................. 62 g

Agua destilada ......................................................................................................... 1000 mL

Preparacin:
- Incubar en bao Mara (55-65C) por 1 hora. Filtrar.
- Llevar a volumen de 1 L. Agregar 20 g de Dextrosa y 20 g de Agar.
- Disolver y autoclavar a 121C por 15 minutos. Repartir sobre lminas estriles formando
un rea de 1 cm2.

5.2.3 Medio Base-Carbohidratos:

Se utiliza como base para proporcionar los requerimientos nutricionales indispensables para el
desarrollo de levaduras.
Peptona ...................................................................................................................... 5 g
Extracto de Carne ...................................................................................................... 1 g
Cloruro de Sodio ....................................................................................................... 5 g
Agar ......................................................................................................................... 15 g
Agua destilada ....................................................................................................... 990 mL
Indicador .................................................................................................................. 10 mL

pH final: 5,6 Disolver y autoclavar a 121 C por 15 minutos.

22
 Indicador:
Disolver 0,1 g de Prpura de Bromocresol en 18,5 mL de NaOH 0,01N. Diluir a 250 mL con
agua destilada para obtener una solucin al 0,04%.

Carbohidratos:
Se utiliza: Glucosa, Lactosa, Sacarosa, Galactosa, Maltosa, y Rafinosa.
Se disuelven en agua destilada estril y se esterilizan por filtracin (Dimetro de filtro: 0,2
um). Concentracin final de cada carbohidrato 10%. Agregar al medio base a temperatura de
45 a 50C. Mezclar y repartir en tubos 13 x 100 mm de tapa rosca. Antes de utilizar controlar a
37 C por 24 horas.

5.2.4 Agar Urea Base:

Su uso es sealado para la identificacin de Cryptococcus neoformans y algunas especies del
gnero Candida. El medio se adquiere en forma comercial. Su preparacin requiere seguir las
indicaciones dadas por el fabricante.

5.2.5 Agar Infusin Cerebro Corazn:

El propsito de su uso es el aislamiento y subcultivos de Paracoccidioides brasiliensis e
Histoplasma capsulatum.

Infusin de cerebro de ternero ............................................................................... 200,0 g

Infusin de corazn de res ..................................................................................... 250,0 g
Proteosa-peptona ...................................................................................................... 10,0 g
Bacto-dextrosa ........................................................................................................... 2,0 g
Agua destilada ........................................................................................................ 990,0 mL
Cloruro de Sodio ......................................................................................................... 5.0 g
Fosfato disdico .......................................................................................................... 2.5 g
Agar ........................................................................................................................... 15.0 g
pH final: 7,4 + a 25 C.

En el caso de utilizar el medio comercial seguir las indicaciones dadas por el fabricante.

23
 CAPITULO VI

IDENTIFICACION DE PRINCIPALES HONGOS

PATOGENOS

6.1 IDENTIFICACION DE Candida sp

6.1.1 Prueba del Tubo Germinativo:

Suspender un inculo de la cepa pura de Candida en 0,5 mL de suero humano. Incubar a 37 C
por 2 a 3 horas. Observar al microscopio con objetivo de 40X. Se considera como prueba
positiva el visualizar una estructura elongada que se origina de una levadura (Figura 4). Esta
caracterstica identifica a la especie C. albicans.

De ser negativo el tubo germinativo realizar las siguientes pruebas para determinar otras
especies. (Fluxograma 1)

24
 FLUXOGRAMA 1

FLUXOGRAMA PARA IDENTIFICAR PRINCIPALES

LEVADURAS PATOGENAS

6.1.2 Produccin de Clamidospora:

Sembrar la cepa sobre el medio Agar harina de maz. Colocar una laminilla sobre el inculo.
Incubar en cmara hmeda a temperatura ambiente 25 C por 5 das. Observar al
microscopio sin retirar la laminilla. Considerar presencia de clamidospora al observar estruc-
turas circulares de pared gruesa, intercalares o terminales a una hifa. Asimismo esta prueba
permite visualizar diversas morfologas como: Blastosporas, Pseudohifas e Hifas.

25
6.1.3 Asimilacin de Carbohidratos:
Sembrar sobre la superficie del medio de cultivo. Incubar a temperatura ambiente o 25 C por 2
a 3 das. La reaccin se considera positiva al observar un viraje de color hacia el amarillo. (Ver
tabla 5)

TABLA 5

PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA IDENTIFICAR

ESPECIES DE Candida DE IMPORTANCIA MEDICA

ABREVIATURAS

TG: TUBO GERMINATIVO CHL: CLAMIDOSPORA

HF: HIFA PH: PSEUDOHIFA
FP: FORMACION DE PELICULA LEV: LEVADURA
GLU: GLUCOSA LAC: LACTOSA
SAC: SACAROSA MAL: MALTOSA
GAL: GALACTOSA RAF: RAFINOSA

26
6.2 IDENTIFICACION DE Aspergillus sp

Desarrollan bien a temperatura ambiente y a 37C. La identificacin se realiza evaluando el aspecto

macroscpico (color y textura cuando desarrollan sobre Agar Sabouraud Dextrosa) y el aspecto
microscpico: presencia de conidiforo, cabezuela, conidias, distribucin y nmero de hileras de
esterigmas. (Ver Tabla 6)

TABLA 6

Identificacin de las principales especies de Aspergillus

27
28
29
30
6.3 IDENTIFICACION DE Cryptococcus neoformans

Desarrollan a 37 C. Macroscopicamente presentan color blanco que en el transcurso de los das se

torna crema oscuro. Presenta textura lisa. Al realizar la prueba con la tinta china se observar la
presencia de un halo de color blanco alrededor de la levadura indicando la presencia de la cpsula de
mucopolisacrido. Esta levadura se caracteriza por producir ureasa, reaccin visualizada al observar
un viraje de color del medio de cultivo (Agar Urea Base) hacia el rojo grosella o intenso.

31
6.4 IDENTIFICACION DE Fusarium sp.

Las colonias macroscopicamente prcsentan micelio areo algodonoso que puede adquirir por el
anverso un color rosado-cremoso con zonas de color amarillo, caf, prpura o violeta, muestras que
el reverso puede presentar un color cremoso, rojo vino o caf. A temperatura de 20 a 25 C esporulan
alrededor de los 10 a 15 das. Microscpicamente presentan macroconidias y microconidias
originadas a partir de filides. Las microconidias uni o bicelulares de forma ovoide se desprenden de
filides muy delgadas. Mientras que las macroconidias hialinas, y multicelulares son fusiformes
(Media luna o falciforme) presentando de 2 a 11 septaciones. Las clamidosporas pueden estar
ausentes o presentes.

32
6.5 IDENTIFICACION DE Paracoccidioides brasiliensis

En el examen directo (KOH-10%) de muestras clnicas se observan levaduras de diferente tamao

con pared gruesa y refringente presentando inclusiones citoplasmticas intracelulares. Las levaduras
pueden presentar una nica o mltiples gemaciones dando un aspecto de Timn de barco o Cara
de Ratn. Esta prueba presenta una sensibilidad del 85% con respecto a la prueba estndar (cultivo).
En cuanto a las caractersticas macroscpicas del hongo al desarrollar sobre Agar Sabouraud
Dextrosa o Agar Infusin Cerebro Corazn, presenta un color blanco-beige de aspecto cerebriforme.
Para su identificacin hay que demostrar el dimorfismo. Es decir a 25 C la cepa no muestra conidias
caractersticas, mientras que a 37 C se observan levaduras grandes de forma oval o irregular sin
cpsula.

Se puede evidenciar la forma levaduriforme o parasitaria con la tincin Hematoxilina-Eosina. Sin

embargo stas pueden ser observadas ms fcilmente usando las tinciones de PAS (Acido peridico-
Schiff) o Gomori-Grocott (Methenamine-Nitrato de plata). (Ver Tabla 7).

33
6.6 IDENTIFICACION DE Histoplasma capsulatum

El examen directo (KOH-10%) de muestras clnicas carece de valor diagnstico. Por lo tanto es
necesario realizar una coloracin Giemsa observando levaduras pequeas de 2 a 4 um de dimetro
intracelulares a los macrfagos, alrededor de ellas se observa un halo de material no teido que
representa la pared celular (Tabla 7). El cultivo (Agar Sabouraud Dextrosa o Agar Infusin Cerebro
Corazn) es el mtodo estndar para determinar el diagnstico, sin embargo esta tcnica es poco
sensible en la mayora de las formas clnicas y tarda entre 1 a 5 semanas. La macroscopia refiere
colonias de color blanco-pardo. La demostracin de macroconidias tuberculadas o dentadas en la fase
filamentosa (25 C) y su conversin a la fase levaduriforme (370 C) es necesario para su
identificacin definitiva.

Las pruebas inmunolgicas permiten sospechar el diagnstico en la mayora de casos y sugieren la

necesidad de obtener muestras para demostrar la presencia del hongo.

TABLA 7
Caractersticas diferenciales de H. capsulatum y P. brasiliensis

34
6.7 IDENTIFICACION DE HONGOS Y MOHOS PATGENOS

En los anexos 2 y 3 se muestran los fluxogramas para identificar hongos patgenos verdaderos y los
principales mohos patgenos.

35
 CAPITULO VII

TRANSPORTE Y REMISION DE MUESTRAS

Una vez obtenidas las muestras, stas debern ser transportadas de inmediato al laboratorio para su
procesamiento. Un LCR de no procesarse de inmediato mantenerlo a temperatura ambiente. Mientras que
en el caso de una muestra de Esputo el tiempo transcurrido entre la toma de muestra y su procesamiento
no debe ser mayor de 2 horas. En las muestras provenientes de mucosas (vaginal, perianal y genital
masculina) de no procesarse de inmediato es recomendable realizar un extendido al momento de su
obtencin, el cual se colorear con Tincin Gram al llegar al laboratorio.

7.1 RECOMENDACIONES

El envase donde estar contenida la muestra deber estar etiquetado con cinta Masking tape o
esparadrapo para ser rotulado mediante bolgrafos de tinta indeleble o lpiz Faber N 2. La escritura
deber efectuarse con letra de imprenta y en forma legible; considerando las siguientes especificacio-
nes:

- N de Cdigo.
- Fecha de coleccin de la muestra.
- Tipo de muestra.

Cada muestra deber estar acompaada de una ficha epidemiolgica donde se debe consignar:

- Nombre del paciente.

- Direccin del Hospital o Centro de Salud.
- Nombre del Mdico solicitante.
- Antecedentes clnicos.
- Tipo de muestra.
- Direccin y nombre del Laboratorio al que se remite.

36
 CAPITULO VIII

BIBLIOGRAFIA

1. Arango, M; Castaeda E. 1995. Micosis Humanas. Procedimientos diagnsticos, Exmenes

directos. Instituto Nacional de Salud. Colombia.

2. Campbell M; Stewart J. 1980. The Medical Mycology Handbook. John Wiley Sons. New York.

3. Daz. F.J. 1988. Seguridad en el laboratorio Clnico. En Bioseguridad en el laboratorio. Acta

Bioquim Clin Latinomaer. (Sup 4):35-40.

4. Favero M. S. 1987. Etiological Hazards in the Laboratory. Lab. Med. 18 (10):665-670.

5. Grigoriu D; Delacretaz J; Porelli D. 1987. Medical Mycology. Ediciones Roche. Basilea.

6. Hall C. T. 1986. La seguridad en el Laboratorio de Microbiologa Clnica. En Sonnenwirth AJ,

Gradwohl L. Mtodos y Diagnstico de Laboratorio Clnico. Edit. Mdico Panamericana 8va. Ed.
Buenos Aires.

7. Organizacin Mundial de la Salud. Manual de Bioseguridad en el laboratorio. 1994. Ginebra 2

Edic. 149 pp.

8. Organizacin Mundial de la Salud. Manual de normas bsicas para un laboratorio de Salud. 1983.
Publicacin cientfica N 439.

9. Koneman E. W; Roberts G. D. 1996. Micologa. Prctica de Laboratorio. Cuarta reimpresin de

Tercera impresin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires. Argentina.

10. Ministerio de Salud Pecos. 1991. Manual de Bioseguridad para VIH SIDA. Publicacin N 3. 1-40.

11. Morales C; Paz E; Medina J; Yoza M; Narvez J. 1996. Histoplasmosis Diseminada en Nios.
Reporle de dos casos. Diagnstico. 35 (3): 39-45.

12. Rippon, J. W. 1988. Micologa Mdica-Hongos y actinomycetos patgenos. 3 Edicin.

Interamericana McGraw-Hill. Mxico.

37
CAPITULO IX

ANEXOS

38
ANEXO 1

39
 ANEXO 2

FLUXOGRAMA PARA IDENTIFICAR HONGOS

PATOGENOS VERDADEROS

40
 ANEXO 3

FLUXOGRAMA PARA IDENTIFICAR PRINCIPALES

MOHOS PATOGENOS

41
 ANEXO 4

GLOSARIO

LEVADURA: Hongo unicelular que presenta gemacin y reproduccin sexual o asexual.

CLAMIDOSPORA O CLAMIDOCONIDIA: Es una espora tlica asexual que se redondea y agranda

con el incremento en el grosor de la pared celular y densidad protoplsmica. Se liberan por
desintegracin de clulas vecinas. Son estructuras de supervivencia.

ESCLEROCIO: Conjunto de clulas que bajo condiciones desfavorables pueden permanecer latentes
durante largos perodos de tiempo. Esta estructura germina cuando se esta en condiciones ambientales
favorables.

CONIDIOFORO: Hifa especializada sobre la cual se desarrollan las conidias.

CONIDIA: Estructura de reproduccin asexual que se forma de nuevo a partir de clulas hifales
preformadas.

CAPSULA: Cubierta hialina de mucopolisacridos que rodea a la clula.

CABEZUELA: Dilatacin del extremo del conidiforo sobre la cual se desarrollan las filides o clulas
conidigenas.

HIFA: Estructura tubular que representa la unidad estructural de la mayora de hongos.

PSEUDOHIFA: Cadena de blastoconidias que permanecen adheridas formando un filamento semejante

a una hifa.

BLASTOSPORA: Estructura de reproduccin asexual originada por gemacin. Son liberadas por fisin
a travs de un septo doble.

FIALIDE: Clula conidigena en forma de botella o frasco.

DIMORFICO: Que presenta dos formas. Se usa comnmente para describir a aquellos hongos que
crecen como mohos a temperatura ambiente y como levaduras a 37 C.

GEMACION: Multiplicacin asexual. Se caracteriza por la formaci6n de una pequea evaginacin o

gema a partir de una clula madre. La evaginacin se agranda, se individualiza y se separa de la clula
madre, originando una clula independiente. Es una estructura tpica de levaduras donde se les conoce
como blastosporos o blastoconidias, aunque algunos mohos tambin los presentan.

TUBO GERMINATIVO: Parte inicial de la germinacin de una blastoconidia, conidia, o de una espora,
y que de seguir desarrollndose forma una hifa e incluso micelio.

HABITAT: Nicho ecolgico donde crece y vive normalmente un hongo.

MACROCONIDIA: Es la ms grande de dos tipos de conidias en hongos.

Esta publicacin se termin de imprimir

en diciembre de 1997 en los
Talleres Grficos de Art. Lautrec S.R.Ltda.
Av. Paseo de la Repblica 731 - Lima 13
Tel/Fax: 423-7616

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