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RESUMEN
Para determinar el efecto del complejo enzimtico producido por Aspergillus oryzae CECT 2094 y CECT 2095
sobre la produccin de etanol por Saccharomyces cerevisiae en condiciones de laboratorio, se acondicionaron
cuatro sistemas de fermentacin empleando botellas con 400 ml de caldo melaza, a las que se adicion extracto
enzimtico a las concentraciones de 2, 4, y 6% (v/v), y un control sin extracto enzimtico. Los sistemas fueron
inoculados con S. cerevisiae e incubados a temperatura ambiente durante 48h. en condiciones de anaerobiosis,
luego se procedi a medir la concentracin de alcohol expresada en porcentaje, en cada uno de los sistemas de
fermentacin. El mayor porcentaje de alcohol se obtuvo en el tratamiento con 4% de extracto enzimtico, con una
media de 4,47% de alcohol y una biomasa final de 1,36 x 108 cel/ml a diferencia del control en el que se obtuvo
3,73% de alcohol y la biomasa final de 9,92X107 cel/ml. En todos los tratamientos se observ una disminucin
del Brix (14 a 6,57B). Se concluye que el complejo enzimtico producido por A. oryzae tiene efecto positivo
sobre la produccin de etanol por S. cerevisiae en condiciones de laboratorio.
Palabras clave: Aspergillus oryzae, complejo enzimtico, produccin de etanol.
ABSTRACT
In order to determine the effect of the concentration of the enzyme complex produced by Aspergillus oryzae
CECT 2094 and CECT 2095 on the production of ethanol by Saccharomyces cerevisiae in laboratory conditions,
four fermentations systems were conditioned using bottle with 400 ml molasses broth, which was added
enzymatic extract at concentrations of 2, 4, and 6% (v / v) and a control without enzyme extract. The systems
were inoculated with S. cerevisiae and incubated at environment temperature for 48hrs under anaerobic
conditions, then it was proceeded to measure the concentration of alcohol expressed in percent in each of the
fermentation systems. The highest percentage of alcohol was obtained in the treatment with 4% extract enzyme,
with an average of 4,47% alcohol and a biomass at the end of 1,36 x 108 cells / ml as opposed to the control
which was obtained 3,73% and its biomass at the end of fermentation was 9,92 X10 7 cel / ml. In all treatments was
observed a decrease of the Brix (14 a 6,57B). The conclusion was that the enzyme complex produced by A.
oryzae has an positive effect on ethanol production by S. cerevisiae under laboratory conditions.
Key words: Aspergillus oryzae, enzyme complex, ethanols production.
respectivamente, previo lavado de la superficie del Absorbancia del Tubo Problema= Absorbancia del
cultivo con 10 ml de solucin de Tween 80 al 0,1 %; producto de la reaccin debido a la actividad del
luego, cada solucin del lavado se centrifug a 2800 extracto enzimtico originado por la cepa A. oryzae
rpm, durante 3 minutos. Posteriormente, se decant 2094.
y se resuspendi en 10 ml de agua destilada estril, Determinacin de la actividad de las enzimas
este proceso de lavado se repiti una vez ms. proteolticas.
Finalmente, se resuspendieron en 10mL de agua Se trabajaron con tres tubos (I, II, III). A los tubos I
destilada estril. Seguidamente, se cogi una y II se les aadi 2 ml de casena al 1% y 2ml de
alcuota de cada suspensin y se llev a la cmara de buffer fosfato 0,1 M pH 8. A los tubos I y III, se les
Neubauer para el recuento de esporas por ml aadi 2ml del preparado enzimtico. Para igualar
haciendo las diluciones necesarias para obtener el los volmenes se aadi agua destilada a los tubos II
inculo de 2,7x10 8 esporas/ml de cada cepa10,11. y III. Se mezclaron y se colocaron en bao de agua a
Preparacin del sustrato slido e inoculacin de 37C durante 30 minutos. Finalizado el tiempo de
esporas reaccin, se tomaron alcuotas de 0,5 ml de cada uno
En dos botellas de vidrio planas de 1000 ml (una de los tubos y se trasladaron a otro sistema de tubos
para cada cepa), se colocaron 80 g de salvado de numerados (I, II, III) a los cuales se les agreg 1
trigo cada una y se llevaron al autoclave a una ml de solucin de ninhidrina a cada uno. Se
presin de 15 libras, con temperatura de 121C mezclaron y se llevaron a un bao de agua hirviendo
durante 15 minutos. Seguidamente, se humedeci el (franca ebullicin) durante 3 a 5 minutos, luego se
salvado con solucin tampn estril (buffer - acetato les retir y agreg 3,5 ml de agua destilada.
a pH 5,0) en cantidad suficiente para alcanzar una Finalmente, se mezclaron por inversin y se midi la
humedad relativa de 50%. Posteriormente, se le absorbancia en espectrofotmetro a 640 nm. Se
adicion 6 ml del inculo (de cada cepa en su defini que una unidad de actividad enzimtica
respectiva botella) homogenizndose con una proteoltica UE/g corresponde a la cantidad de
bagueta estril. Estos recipientes se ubicaron enzimas que libera un 1g de casena por minuto
horizontalmente en la incubadora a 24C durante bajo las condiciones de ensayo. Este anlisis de la
cinco das10. Todos los ensayos se ejecutaron en actividad fue hecha para el extracto enzimtico
triplicado. producido por la cepa A. oryzae 209513.
Extraccin de enzimas
Una vez cumplido el tiempo de incubacin, el Absorbancia (Blanco) Absorbancia (Problema)
sustrato de fermentacin (de cada cepa por Amilasa, UA/dL X 1000
Absorbancia (Blanco)
separado) se pas a un matraz estril (un matraz para
cada cepa) y se les agreg 200 ml de la solucin
tampn. Se agit aproximadamente por una hora en Preparacin del inculode S. cerevisiae.
un agitador magntico, luego se separ la fraccin A partir del cultivo puro, se reactiv sembrando en
soluble de la insoluble, filtrando a travs de un placas conteniendo Agar Sabouraud Glucosa
lienzo (prensado). Se recolectaron los sobrenadantes Enriquecido (ASGE), y se incubaron a 30C durante
(preparados enzimticos) y se centrifugon a 2500 36 horas.Luego secosecharon las clulas de
rpm por 10 minutos a 4 C y finalmente se filtraron levaduras utilizando de 2 a 3 ml de Solucin Salina
a travs de un filtro bacteriolgico estril que Fisiolgica (SSF) por placa de cultivo.
seguidamente se guardaron en refrigeracin a 4C Seguidamente, se reunieron todas las suspensiones
hasta la determinacin de la actividad enzimtica de en un tubo estril y se homogeniz la suspensin.
cada uno de los extractos12. Posteriormente, se realiz una observacin en fresco
Determinacin de la actividad de Alfa Amilasa utilizando azul de metileno para determinar la
Se rotularon 3 tubos de la siguiente manera: Tubo I ( viabilidad de las levaduras. Finalmente, se tom una
reactivos), Tubo II (testigo) y Tubo III (Problema). alcuota de la suspensin y se hizo recuento celular
En los tubos II y III se agreg 10l del extracto en cmara de Neubauer haciendo diluciones
enzimtico, luego al tubo I y III se agreg 0,5ml de necesarias para obtener la concentracin de 2,7x108
la solucin de almidn bufferado pH 5. Luego se cel/ml14.
incubaron los tres tubos a 37C por 7.5 minutos. Determinacin de la fase logartmica de
Finalizando dicho tiempo se le aadi 4.5ml de la crecimiento de S. cerevisiae.
solucin reveladora (0,006% de I2+0,06% de KI en 300ml de caldo melaza (melaza diluda hasta 14B,
HCl de 0,02M) a los tres tubos y se completaron los refrigerada a 4C por 2 horas y decantada) a una
volmenes con 10 L y 0,5mL de agua destilada en densidad de 1,05 Kg/dm3 y a pH 4,5 fueron
los tubos I y II , respectivamente12. Luego se midi esterilizados en autoclave a 121C por 15 minutos.
la absorbancia a 574nm. Para el clculo del Se pas 200ml a un biorreactor aireado con
resultado, se us la siguiente frmula agitacin de 150 rpm, se enfri e inocul 20ml de
donde: suspensin de levadura ( equivalente a una
Absorbancia del Tubo Blanco= Abs. del Tubo I + concentracin final del 10% v/v en el sistema) y se
Abs. del Tubo II incub a temperatura ambiente (201C) durante 48
horas. Los recuentos de clulas se llevaron a cabo
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cada hora con el mtodo de conteo directo en Durante las 48 horas de incubacin, con el
cmara de Neubauer, luego con los datos obtenidos Ebulloscopio de Malligan se midi el porcentaje (%)
se elabor la curva de crecimiento14. de etanol en cada uno de los cuatro biorreactores.
Fermentacin. Los resultados obtenidos se organizaron y
En 4 biorreactores de 500 ml estticos y en analizaron estadsticamente en base a la prueba de
condiciones anaerbicos se colocaron 352, 344, 336 anlisis de varianza (ANAVA)16.
y 360 ml de caldo melaza de 14B a pH 4,5. A cada
uno de los biorreactores, se inocularon con 40 ml RESULTADOS
(equivalente al 10% de volumen final en todos los Se observ que el momento ptimo de pasar la
biorreactores) de suspensin de levaduras en fase levadura a la fase anaerbica fue a las 5 horas 23
logartmica. Posteriormente, se les adicion 8, 16, y minutos (Fig. 1). As mismo, se observ que la
24 ml de la mezcla (en proporcin 1 a 1) de los mezcla de los extractos enzimticos (complejo
extractos enzimticos ( producido por A. oryzae) en enzimtico) favoreci (efecto enzimtico, Tabla 1)
los tres primeros biorreactores completndose un la concentracin de etanol llegando al mximo valor
volumen final de 400ml; sindo el ltimo biorreactor de produccin (Fig. 2) en la fase estacionaria
el control al que no se le aadi extracto enzimtico, (despus de las 12 horas).
luego se les hizo recuento inicial de levaduras en Se encontr que el porcentaje de etanol producido
cmara de Neubauer. Finalmente, se dejaron los 4 por S. cerevisiae fue mayor en el tratamiento con
biorreactores en incubacin durante 48 horas a 4% de complejo enzimtico obtenindose una media
temperatura ambiente (201C)15. Todos los ensayos de 4,47% de etanol a diferencia del control en el
se ejecutaron en triplicado. cual se obtuvo 3,73% (Fig. 3). Sin embargo, se
Mediciones finales de poblacin celular y grados obtuvo menor grado Brix en el tratamiento con 6%
Brix. de complejo enzimtico (Fig. 4).
Despus de las 48 horas, en cmara de Neubauer se El anlisis de varianza indic que si existe diferencia
hizo recuento de poblacin celular de S. cerevisiae significativa entre las variables de estudio
en diluciones de caldo melaza fermentado. As (produccin de alcohol y concentracin del compleo
mismo, con el hidrmetro se midi los grados Brix enzimtico) a un nivel de confianza de 95% (Tabla
finales en los 4 biorreactores de fermentacin13. 2). As mismo, el post anava seala que existe dos
Determinacin del porcentaje de etanol. grupos estadsticamente homogneos. (Tabla 3).
Tabla 1. Actividad enzimtica de los extractos de A. oryzae determinadas por la absorbancia promedio de los
ensayos de reaccin.
Fig. 1. Curva de crecimiento de S. cerevisiae (cel/ml) cultivado enmedio caldo melaza evaluado hasta las
25horas.
Efecto del complejo SCINDO 15(2): 1-12, 2012
4.5
4.1
3.7
% de etanol
3.3 control
2.9 2% CE
2.5 4% CE
6% CE
2.1
1.7
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
Tiempo de fermentacin (h)
Fig.2 Concentracin de etanol producido por S. cerevisiae en fermentacin de caldo melaza con tres
concentraciones del complejo enzimtico producido por A. oryzaeevaluado hasta las 48 horas.
0% 2% 4% 6%
Fig 3. Porcentaje de alcohol producido por S. Fig 4. Grados Brix de fermentacin alcohlica
cerevisiae en fermentacin de caldo melaza con tres suplementada con tres concentraciones de complejo
concentraciones de complejo enzimtico producido enzimtico.
a
por A. oryzae a las 48 horas de fermentacin.
b b b
a
Tabla 3. Contraste mltiple de rango para porcentaje de alcohol segn concentracin enzimtica
SCINDO 15(2): 1-12, 2012 Snchez, Otiniano, Arellano, Chvez, Robles y Lescano
_________________________________________
Mtodo: 95.0 porcentaje LSD
Nivel Frec. Media Grupos homogneos
________________________________________________
0 3 3.73333 X
2 3 4.26667 X
6 3 4.26667 X
4 3 4.46667 X
________________________________________________
Contraste Diferencias +/- Lmites
________________________________________________
0-2 *-0.533333 0.380472
0-4 *-0.733333 0.380472
0-6 *-0.533333 0.380472
2-4 -0.2 0.380472
2-6 0.0 0.380472
4-6 0.2 0.380472
_________________________________________
* indica una diferencia significativa.
mismo que puede ser asimilado por la levadura para actividad de enzimas involucradas en la gliclisis y
mejorar la estructura conformacional de la produccin de alcohol23.
membrana celular 14; y por tanto dar una mayor Una de las etapas en el proceso de fermentacin es
tolerancia a la inhibicin por concentracin de la preparacin del mosto, el cual en este caso, se
alcohol y aumentar la poblacin celular 21. ajust los grados Brix a 14 Brix (13.31% de
Existen muchos mtodos bioqumicos que nos azcares); adems una concentracin ptima de
permiten identificar la presencia de aminocidos en azcar est en el rango del 10 al 18%, siendo el
una muestra, dentro stos destacan la formacin de valor ms corriente el de 12%14. Cuando se trabaja
complejos cromforos por interaccin del con concentraciones de azcar muy altas, del orden
aminocido y un reactivo especifico, en esta ocasin de 22%, se ha observado una deficiencia
se trabaj con la Ninhidrina, agente que al entrar en respiratoria en la levadura y un descenso de la
contacto con aminocidos libres da lugar a un velocidad de fermentacin; sin embargo, al trabajar
complejo visible de color azul-violceo, lo que con concentraciones muy bajas, el proceso resulta
permiti demostrar que el extracto enzimtico antieconmico ya que requiere un mayor volumen
adicionado al sistema contena proteasas13, al liberar para la fermentacin 14. Tal es as que, la evaluacin
aminocidos de la casena (fosfoprotena) en la de los grados Brix (slidos solubles), mostr una
prueba de la proteasas. disminucin al final de la fermentacin con respecto
Las melazas se diferencia de otras materias primas al blanco (fermentacin alcohlica sin la adicin de
empleadas en la produccin de etanol como maz, enzima), lo que indica que los azcares reductores se
papa, milo y otros, en que stos son productos de transformaron en etanol por lo tanto se observa la
plantas con alto contenido de carbohidratos disminucin de los grados Brix 26,27.(Fig. 4).
almacenados en la forma de almidn (biomasa Las condiciones de fermentacin tambin
amilcea)1. Por lo tanto, estos materiales deben constituyen factores importantes en la produccin de
pasar por un proceso de pretratamiento para etanol3,14. As tenemos que el pH ptimo para el
hidrolizarlos y obtener azcares fermentables antes metabolismo de la levadura es de pH 4.5, la
de la fermentacin22. Sin embargo, ambas materias temperatura es de 30C y el tipo de sustrato que
primas necesitan la ayuda del complejo enzimtico debe tener azcares fermentables, la levadura solo
antes de la fermentacin para que obtener los metaboliza directamente azcares simples (glucosa y
azcares fermentables y puedan ser metabolizados fructosa). Para fermentar disacridos como la
por la levadura. sacarosa presentes en jugos y mieles de caa, la
Para procesar materiales que contienen azcares no levadura emplea la enzima invertasa para desdoblar
fermentables (se hidrolizarn con la actividad del la sacarosa en sus azcares simples glucosa y
complejo enzimtico para obtener azcares fructosa28.
fermentable), azcares simples y disacridos, como El porcentaje de alcohol producido por S. cerevisiae
las mieles de la industria de la caa de azcar, se empleando diferentes concentraciones del extracto
consigui concentraciones apropiadas (14B) y enzimtico de A. oryzae arroj valores bajos entre
luego se agreg cantidades de levadura suficientes 4,27 y 4,47% (Fig. 3); en comparacin con otra
(inculo de concentracin de 2,76x108 cel/mL que al investigacin que reportan el incremento del grado
ser aadido al sistema al 10%, la concentracin alcohlico del 8% a 10% v/v con la adicin de
inicial fu de 2,76 X107 cel/mL). Sin embargo, el enzimas obtenidas por fermentacin en sustrato
porcentaje de alcohol que se obtuvo en la slido con Rhizopus niveus6. Valores satisfactorio
fermentacin fu limitado (4,47%) posiblemente pero muy bajos probablemente porque la cepa de
debido a la mediana tolerancia de la levadura a las Saccharomyces usada no fue una cepa mejorada y ni
concentraciones de alcohol como lo observado en especfica para obtencin de alcohol por no
otras investigaciones, vara de una cepa a otra23. El presentar tolerancia al alcohol (cepas con tolerancia
etanol ejerce influencia negativa sobre muchos al alcohol soportan de 9 a 11% de alcohol) ; pero al
componentes y eventos intracelulares; tales como la aadir el complejo enzimtico present mediana
inhibicin y desnaturalizacin de varias protenas tolerancia (cepas con mediana tolerancia soportan
internas y enzimas glicolticas, la inhibicin del de 4 a 8% de alcohol)23.
flujo de protones inducidos por glucosa, as como la Segn el ANAVA, Puesto que el p-valor del
induccin de una acelerada reentrada pasiva de test F es inferior a 0,05, hay diferencia
protones.23 As mismo, se ha demostrado que las estadsticamente significativa entre las porcentaje de
membranas citoplasmticas de varios organelos son alcohol medias de un nivel de concentracin
el blanco principal para la inhibicin por etanol21,24. enzimtica a otro para un nivel de confianza del
El alcohol ocasiona alteraciones en la organizacin y 95,0% (Tabla 2). Por lo tanto; se concluye que el
permeabilidad de las mismas al afectar su complejo enzimtico producido por A. oryzae tiene
composicin lipdica y el funcionamiento de efecto positivo sobre la produccin de etanol por S.
protenas de membrana involucradas en el transporte cerevisiae en condiciones de laboratorio. El post.
de azcares y aminocidos25. Estos cambios en la ANAVA (Tests de Rangos Mltiples), aplica un
permeabilidad, causan la fuga de cofactores, procedimiento de comparacin mltiple para
coenzimas y nucletidos, esenciales para la determinar las medias que son significativamente
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diferentes unas de otras. El asterisco que se produccin de alcohol etlico a partir de melaza.
encuentra al lado de los 3 pares, indica que stos Fac. de Ciencias Agropecuarias.Universidad del
muestran diferencias estadsticamente significativas Cauca. Popayn (Colombia) 2004; 2(1): 33-42.
a un nivel de confianza 95,0%. En la parte superior 7. Castro C, Navas C, Caro O, Pieros Y. [En lnea]
de la tabla, se identifican 2 grupos homogneos Obtencin de amilasas fngicas a partir de
segn la alineacin del signo X en la columna, lo Aspergillus sp. aislado de semillas de lentejas.
que indic que cualquiera sea la concentracin del Universidad Jorge Tadeo Lozano; Bogot-
extracto enzimtico se tendra el mismo efecto Colombia.[Fecha de consulta: 19 agosto 2009].
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CONCLUSIONES http://www.utadeo.edu.co/dependencias/publicacion
1. El complejo enzimtico producido por A. oryzae, es/alimentica3/amilasas.pdf
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entre los tratamientos ( 2, 4 y 6% de fermentacin slida para la produccin de esporas
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CORRESPONDENCIA
Liz Snchez Torres
Direccin
Espinar N 221 Moche
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E-mail: pamelaunt18@hotmail.com