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Plataformas de Proteomica PDF
Plataformas de Proteomica PDF
Curso:
Mtodos Fisco-Qumicos en Biotecnologa
Plataformas de Protemica
Presentan:
Ing. Daniela Morales Snchez.
Ing. Lil Esmeralda Gallo Ramrez.
1. Introduccin 1
1.1 Tecnologa de la protemica 3
1.1.1 Separacin de protenas 3
1.1.2 Identificacin y caracterizacin de protenas 5
2. Fundamentos de la electrofresis 7
3. Tipos de electrofresis 8
3.1 Electrofresis libre 8
3.2 Electrofresis zonal 9
3.2.1 Equipamiento de la electrofresis 9
3.3 Tipos de soporte 10
3.3.1 Soportes no restrictivos tipo I 10
3.3.2 Soportes restrictivos tipo II 11
3.4 Factores que afectan la electroforesis 11
3.4.1 Campo elctrico 11
3.4.2 Muestra 11
3.4.3 Tampn 12
3.4.4 Soporte 12
3.5 Tipos de electroforesis 13
3.5.1 Inmunoelectroforesis 14
3.5.2 Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) 16
3.5.2.1 Formacin del gel de poliacrilamida 16
3.5.2.2 Tipos de monmeros 18
3.5.2.3 Catalizadores empleados en la formacin del gel de
poliacrilamida 18
3.5.2.4 Sistemas de tampones que se emplean en la electroforesis en
geles de poliacrilamida 19
3.5.2.5 Formatos de la PAGE 19
3.5.2.6 PAGE en condiciones no desnaturalizantes 20
3.5.2.7 PAGE en condiciones desnaturalizantes 20
3.5.2.8 PAGE-SDS 21
3.5.3 Electroforesis en geles de gradientes 25
3.5.4 Electroforesis en geles de azarosa 26
3.5.5 Electroforesis capilar 26
3.5.6 Enfoque isoelctrico 27
3.5.7 Electroforesis bidimensional 29
4. Informacin sobre la estructura de las protenas 30
4.1 Fragmentacin de protenas 30
4.1.1 Protelisis 30
4.1.1.1 Digestin en solucin 31
4.1.1.2 Digestin en gel 31
4.1.2 Rompimiento qumico 32
4.2 Anlisis de secuencia amino y carboxilo terminal 33
4.2.1 Secuenciacin del extremo amino terminal 33
4.2.1.1 Protenas con modificaciones en el amino terminal 34
4.2.2 Secuenciacin del extremo carboxilo terminal 35
5. Espectrometra de masas 35
5.1 Preparacin de la muestra 35
5.2 Ionizacin de la muestra 35
5.2.1 MALDI (Matrix Assisted Lasser Desorption Ionization) 36
5.2.2 ESI (ElectroSpray Ionization) 36
5.3 Anlisis de masa 38
5.3.1 Analizador de cuadrupolo 38
5.3.2 Analizalizador de tiempo de vuelo (Time of Flight, ToF) 40
5.3.3 Analizador de trampa de iones 41
5.3.4 Analizadores hbridos. 41
5.3.5 Analizadores ToF/ToF 42
5.3.6 FT-ICR (Fourier transform-ion cyclotron resonance) 42
5.3.7 Fragmentacin de iones 43
6. Identificacin de protenas utilizando bases de datos. 43
6.1 Huella de masa del pptido (peptide mass fingerprint, PMF) 44
6.2 Secuenciacin utilizando datos generados con la tcnica product
ion scan MS/MS 45
6.3 Secuenciacin de novo 45
7. Identificacin de modificaciones post-traduccionales 46
7.1 Identificacin de sitios de fosforilacin 47
7.1.1 Enriquecimiento de fosfoprotenas 47
7.1.2 Determinacin de sitios de fosforilacin mediante degradacin
de Edman 47
7.1.3 Determinacin de sitios de fosforilacin mediante
espectrometra de masas 47
8. Bibliografa 49
1. INTRODUCCIN
La protemica es uno de los campos que puede ayudar a establecer una conexin
entre las secuencias genmicas y su comportamiento biolgico, constituyendo una
herramienta importante en el anlisis funcional de genes de funcin desconocida.
El trmino Proteoma fue usado por vez primera en 1995 para describir el
conjunto de PROTEnas de un genOMA, en una clula o un tejido. De forma
imperceptible, la palabra proteoma dio lugar a una nueva disciplina, la Protemica.
Pero, qu es la protemica? Esencialmente la protemica es el estudio a gran escala de
los productos gnicos de un genoma mediante mtodos bioqumicos, con el fin de
obtener una visin global integrada de los procesos celulares. El trmino protemica se
ha asociado tradicionalmente con la separacin de un gran nmero de protenas de una
clula u organismo mediante 2D-PAGE. Segn esto, la protemica comienzo en los
aos setenta cuando se empezaron a construir bases de datos de protenas utilizando la
electroforesis bidimensional. Sin embargo, la identificacin de las protenas era difcil
debido a la falta de mtodos analticos rpidos y sensibles para la caracterizacin de las
protenas. En los aos noventa la espectrometra de masas surge como un mtodo
analtico muy poderoso, ya que limita la mayora de las limitaciones del anlisis de
protenas. Este desarrollo, junto con la disponibilidad de los genomas secuenciados
marca el comienzo de una nueva era. Actualmente muchas reas de estudio han sido
agrupadas dentro de la protemica. Se pueden incluir, entre otros, los estudios de
interacciones de protenas, de modificaciones pos-traduccionales, el anlisis funcional
de las protenas y estudios de localizacin.
1
en transduccin de seales, la identificacin de protenas especficas de una
enfermedad y protenas de inters en microbiologa mdica.
Protemica Estructural
de Protenas afinidad, IEX, E-2D, E-1D, FFE,
y E-2D)
SEC, HIC CZE
Protemica Funcional
Caracterizacin posttraduccionales: covalentes
fosforilacin, glicosilacin, Uniones por enlaces
Conformacin de
metilacin, acetilacin disulfuro
protenas
Fig. 1. Estrategias utilizadas en protemica para la identificacin y el anlisis de protenas. Siglas: (SEC)
Size-exclusion chromatography; (IEX) ion-exchange chromatography; (HIC) hidrophobic interaction
chromatography; (FFE) free flow electrophoresis; (CZE) capillary zone electrophoresis; (FRET)
flourescence resonance energy transfer.
2
Como respuesta a estmulos externos e internos, las protenas pueden ser modificadas
post-traduccionalmente, translocadas, sintetizadas o degradadas (Fig. 2).
Fig. 2 Mecanismos por los que un gen puede dar lugar a mltiples productos gnicos.
Mapeo celular
3
realiza mediante isoelectroenfoque, durante el cual las protenas son separadas en un
gradiente de pH hasta alcanzar una posicin en la que su carga neta es cero, es decir,
su punto isoelctrico. En una segunda dimensin, las protenas son separadas
mediante electroforesis en presencia de SDS. La alta resolucin de la tcnica se basa en
que las dos separaciones se basan en parmetros independientes. La innovacin clave
para la 2D-PAGE fue el desarrollo de geles con un gradiente de pH inmovilizado (IPG).
El gradiente de pH inmovilizado elimina los problemas de inestabilidad del gradiente
y baja capacidad de carga que iban asociados a los gradientes de pH preparados con
anfolitos acarreadores. En los geles IPG, el gradiente es generado por las llamadas
inmobilinas y est copolimerizado con la matriz de acrilamida del gel. Este sistema
ha permitido mejorar la resolucin y reproducibilidad de los geles as como aumentar
la cantidad de protena que puede ser cargada. La reproducibilidad conseguida con los
IPGs ha hecho posible la comparacin de mapas entre distintos laboratorios,
facilitando as el intercambio de informacin.
4
extractos. Debido a estas limitaciones, la mayor aplicacin de esta tcnica en el futuro
ser el anlisis y caracterizacin de subproteomas y de complejos proteicos.
Las protenas pueden ser identificadas por diversos procedimientos, entre los
que se incluyen la secuenciacin del extremo N-terminal, deteccin con anticuerpos
especficos, composicin de aminocidos, co-migracin con protenas conocidas, y
sobre-expresin y delecin de genes. Todos estos mtodos generalmente son lentos,
laboriosos, o caros, y por tanto no resultan apropiados para su utilizacin como
estrategias a gran escala.
Los espectrmetros de masa estn formados al menos por una fuente de iones,
un analizador de masas y un detector que mide la relacin masa/carga (m/z) de los
iones en fase gaseosa.
5
2.- Separacin de los iones segn su m/z en un analizador de masas (por ejemplo un
analizador tipo ToF (Time of Flight), cuadrupolo, trampa inica, etc.)
3.- Fragmentacin opcional de los iones peptdicos.
4.- Medida de las masas en un detector obteniendo un espectro de masas que refleja la
abundancia de los iones frente a su valor m/z.
Fig. 3 Estrategia para la identificacin de protenas mediante espectrometra de masas (Pitarch et al. 2003).
6
Fig. 4 Dos nuevas aproximaciones para la deteccin y cuantificacin diferencial de protenas. A. ICAT
(isotope coded affinity tag). B. DIGE (Differential gel electrophoresis). (Pitarch et al. 2003).
2. FUNDAMENTOS DE LA ELECTROFORESIS
7
La velocidad de migracin (v) de la partcula es directamente proporcional al
producto de su carga efectiva (q) y el gradiente de potencial elctrico (E) e
inversamente proporcional al coeficiente de friccin (f) relativo a la talla y forma de la
molcula, o sea, a la resistencia que le ofrece el medio.
V=qE/f
3. TIPOS DE ELECTROFORESIS
8
Fig. 5 Las molculas cargadas migran hacia los electrodos, aunque no bien separadas por tratarse de una
disolucin.
Este mtodo tiene gran poder resolutivo porque se aplica una cantidad pequea de
protena a una zona estrecha, mientras que la longitud del trayecto es mucho mayor
que la zona de aplicacin. El equipamiento requerido es simple (fuente de poder y
cubeta vertical u horizontal donde se coloca el soporte y 2 electrodos). Con el
desarrollo de la ciencia se han diseado equipos automatizados de electroforesis como
el PhastSystem.
Para llevar a cabo una separacin electrofortica zonal se necesitan los elementos
mostrados en la Fig. 7:
Soporte electrofortico.
9
Fig. 7 Equipo electrofortico. La cubeta tiene en sus extremos los reservorios para el tampn de
electroforesis. En el centro se aloja el soporte (gel) con la muestra aplicada en su zona central.
Fig. 8 Estructura qumica de la agarosa, polisacrido lineal formado por la repeticin de la estructura
bsica (agarobiosa), con un peso molecular medio de 120kDa (que corresponde a unas 400 unidades). Las
caractersticas de la agarosa se ven modificadas dependiendo de la naturaleza de los diferentes radicales
R.
10
3.3.2 Soportes restrictivos tipo II
3.4.2 Muestra
11
tamao y carga, pero de diferente forma, pueden tener una movilidad electrofortica
diferente y ser, por tanto, separables mediante una electroforesis.
3.4.3 Tampn
Durante una electroforesis, se produce una electrolisis del agua por accin del
campo elctrico, lo cual genera protones en la proximidad del nodo e iones hidroxilo
en el ctodo. El tampn es, por esta razn, esencial durante la electroforesis para evitar
que el nodo se acidifique y el ctodo se haga ms bsico, pero no debe afectar a las
molculas a separar.
3.4.4 Soporte
La simple presencia del soporte en una electroforesis hace que se presenten una serie
de fenmenos de elevada trascendencia para el resultado del proceso:
12
Fig. 9 Efecto electroendosmtico en la superficie de un soporte cargado negativamente. Los aniones
migran desplazndose por el centro del poro, mientras que los cationes lo hacen por la superficie.
Las protenas son molculas cuya carga neta depende del contenido de una serie de
aminocidos (fundamentalmente cido glutmico, cido asprtico, lisina, arginina e
histidina) y del grado de ionizacin de stos al pH considerado (Fig. 10 ).
Fig. 10 Principales aminocidos responsables de la carga neta de una protena, dependiendo del pH.
13
de desplazamiento de la misma) y de forma perpendicular a la direccin del campo
elctrico. Conviene evitar la proximidad de los bordes del papel, ya que all el campo
elctrico no es homogneo y se distorsionan las bandas segn avanzan. El volumen que
se aplica suele ser inferior a 10 L y si se necesitan mayores volmenes porque la
muestra se encuentre muy diluida, pueden hacerse aplicaciones sucesivas sobre la
misma zona, dejando secar entre aplicacin y aplicacin. Es necesario humedecer el
soporte (papel o acetato de celulosa) para que sea conductor; para ello, se impregna el
soporte de tampn de electroforesis por ambos extremos y de forma simultnea para
que por capilaridad se desplace hacia la zona de aplicacin de la muestra.
En los geles de agarosa, se perfora el gel con ayuda de un troquel o una pipeta
de dimetro adecuado y se elimina esa porcin por succin. La perforacin puede ser
cilndrica o rectangular, dependiendo del nmero y cantidad de muestra a analizar y la
muestra se deposita en el orificio practicado sin que llegue a rebosar. En este caso, el
tampn est embebido en el soporte (agarosa).
En todos los casos, la zona de aplicacin debe ser lo ms estrecha posible, para
aumentar la resolucin y evitar solapamientos entre bandas que migren en posiciones
cercanas.
3.5.1 Inmunoelectrofresis
14
Los geles se mantienen as a temperatura ambiente (20-22C) durante 24-48 horas.
Los anticuerpos y las protenas (que actan como antgenos) difunden, y si se
encuentran en la proporcin adecuada, producen complejos antgeno-anticuerpo
insolubles que precipitan y aparecen en el gel como bandas elipsoidales.
Una vez formadas las bandas de precipitacin, el gel puede lavarse para eliminar
las protenas que no hayan inmunoprecipitado y, posteriormente, teirse como se ha
descrito anteriormente. Cada protena de la muestra produce una banda de
precipitacin independiente, por lo que es posible identificar el nmero de
constituyentes de la muestra que son reconocidos por los anticuerpos.
15
3.5.2 Electrofresis en gel de poliacrilamida (PAGE)
16
acrilamida (% C) representa el porcentaje de este monmero en el gel y determina el
grado de entrecruzamiento.
La estructura del gel comienza a ser evidente a 4 % T; 0,2-5 % C. Los factores que
gobiernan la talla del poro del gel son complicados, pero en general el tamao del poro
disminuye con el incremento del % T. Las proporciones en que ambas se encuentran
determinan las propiedades fsicas del gel como su densidad, elasticidad, resistencia
mecnica y el tamao del poro. En general se recomiendan valores de T de 5 a 15 % y
de C de 2 a 4 %. Para separar molculas por tamao, es necesario tomar en cuenta la
relacin entre el poro efectivo del medio y el tamao de la molcula que se pretende
separar. Si el poro del medio es significativamente mayor que la molcula, la
separacin electrofortica ser sobre la base de diferencias de carga y el tamizaje
molecular ser mnimo. Al aplicar muestras biolgicas en un gel con gradiente de
acrilamida, todas las macromolculas comienzan su migracin a bajo porcentaje y en la
medida en que avanzan se encuentran con poros ms pequeos que retardan su
movimiento. Las molculas menores comienzan a tener alta friccin cuando los poros
son ms pequeos, mientras que las grandes comienzan la friccin en los poros de
mayor tamao.
17
parte delantera de la banda se frenan ms (encuentran antes los poros ms pequeos)
que las molculas de la parte trasera, con lo que las bandas se estrechan,
concentrndose sobre su parte delantera, produciendo bandas muy finas y con una
gran resolucin.
En la cubeta, el tampn del reservorio superior cubre el gel y los pocillos en los que
se ha de cargar la muestra. Con el fin de que sta, disuelta en el mismo tampn, no
difunda al depositarla en los pocillos, se le puede aadir un compuesto que aumente
su densidad (normalmente, glicerol o sacarosa). El volumen de muestra que puede
aplicarse a cada pocillo depende del tamao de la propia muestra y del pocillo, pero
oscila entre 10- 100L con un mximo de 200L. En el tampn de la muestra, tambin
se aade el marcador electrofortico (el ms utilizado es el azul de bromofenol) para
poder determinar el final del proceso.
Fig. 13 Preparacin del gel para una electroforesis en placa. Elementos para ensamblar el molde. Los
espaciadores (sujetados con pinzas de presion) colocados sobre los cristales forman el molde. Adicin de la
solucin de monmeros. Colocacin del peine en la parte superior. El gel formado presenta los pocillos
donde aplicar la muestra. Las dimensiones habituales de los geles son: 10-20 cm (L) x 10-15 cm (A) x 0.5-1.5
mm (E).
18
Persulfato de amonio y 3-dimetilamino propio-nitrilo (DMAPN).
Perxido de hidrgeno, sulfato de hierro y cido ascrbico.
(H 3O+) migran hacia el ctodo, esto provoca un movimiento relativo del solvente
respecto al soporte slido y que las molculas no cargadas sean transportadas hacia el
ctodo a pesar de no tener grupos ionizados.
La fuerza inica del sistema tampn debe mantenerse a un nivel adecuado para
garantizar la solubilidad de la muestra y suficiente capacidad amortiguadora. Es usual
utilizar concentraciones de tampn en un rango entre 0,025 y 0,1 mol/L, pero pueden
emplearse concentraciones sobre 0,5 mol/L en sistemas fuertementes cidos, pues a
bajos valores de pH muchos cidos dbiles (que son los ms empleados) estn
dbilmente ionizados y es necesaria una alta concentracin para obtener la adecuada
capacidad amortiguadora.
19
tiempos de tincin y destincin son menores tambin porque la difusin es muy
rpida; sin embargo como el gel es tan fino es ms propenso a perturbaciones y
problemas en la polimerizacin.
Este hecho es debido a que la zona de concentracin tiene un tamao de poro muy
grande (2.5-3.0%T), por lo que no es restrictiva frente al de la zona de resolucin cuyo
tamao de poro s es restrictivo.
En algunas protenas hay puentes disulfuro entre los residuos de Cys (para formar
cistinas) de una misma cadena polipeptdica (puentes intracatenarios) o de diferentes
cadenas (puentes intercatenarios) de algunas protenas con estructura cuaternaria.
20
Estos puentes se pueden romper mediante tratamiento con determinados agentes
reductores, como por ejemplo, el -mercaptoetanol (-ME) o el ditiotreitol (DTT).
Detergentes inicos. Pueden tener carga positiva (catinicos) que se usan para
la separacin de protenas muy cidas o muy bsicas; el ms utilizado es el
cetiltrimetilamonio (CTAB). Otros poseen carga negativa y un fuerte carcter
desnaturalizante; el ms empleado es el dodecilsulfato sdico o lauril sulfato
sdico (SDS).
3.5.2.8 PAGE-SDS
Permite el clculo de parmetros moleculares (al contrario que el resto de los tipos
de electroforesis), pues los complejos SDSprotena se separan estrictamente segn su
tamao molecular. El SDS interacciona con las protenas formando complejos de
caractersticas comunes independientemente de las de cada protena.
Las protenas unen una molcula de SDS por cada dos aminocidos, lo que implica
que las cargas propias de las protenas quedan enmascaradas o anuladas; asimismo, la
molcula de SDS proporciona una carga negativa, por lo que los complejos SDS-
protena estn cargados negativamente de forma uniforme (la carga por unidad de
masa es prcticamente constante para todos los complejos).
21
complejos SDS-protena (que, adems, tienen la misma forma elipsoide), esta
movilidad es solamente funcin de la masa molecular, es decir, cuanto menor sea la
masa molecular de la protena, mayor ser la movilidad de la misma y viceversa.
En resumen, la SDS-PAGE es la electroforesis ms utilizada para el anlisis de
protenas debido a:
Todos los complejos SDS-protena tienen carga negativa y migran, por lo tanto,
en el mismo sentido.
El SDS debe incluirse en el tampn de los reservorios, en los de los geles (de
concentracin y de resolucin) y en el de la muestra para mantener las condiciones
desnaturalizantes. La PAGE-SDS puede realizarse en condiciones reductoras o no
reductoras; la ausencia de reductores se traduce en que si las protenas poseen puentes
disulfuro, el SDS slo producir una desorganizacin parcial de la estructura (Fig. 15).
Si son dos o ms las cadenas unidas por puentes disulfuro intercatenarios, en presencia
de SDS, quedarn ms o menos desplegados en funcin de la posicin de los puentes
disulfuros (Fig. 16).
22
Fig. 15 Efecto del SDS y del DTT en la movilidad electrofortica de protenas monomricas. En una
protena nativa de 25 kDa, carente de puentes disulfuro, el tratamiento con SDS ( ) SDS+DTT ( )
producen idntico resultado. La protena con un puente disulfuro intracatenario, en presencia de SDS se
desnaturaliza parcialmente, manteniendo sin desplegar la zona que abarca el disulfuro. El tratamiento con
SDS+DTT rompe el puente disulfuro y permite el despliegue total de la protena.
23
Fig. 16 Efecto del SDS y del DTT en la movilidad electrofortica de protenas oligomricas.
Una vez finalizada la PAGE, se separa el gel de las placas de vidrio haciendo
palanca con una esptula y se visualiza con un colorante; el ms utilizado es el azul de
Coomassie con el que se pueden visualizar 0.1-0.5 g de protena por banda. Otro
mtodo de tincin es con sales de plata, que tiene como principal ventaja su elevada
sensibilidad (hasta 0.1ng de protena por banda), aunque tiene como desventajas que es
muy laboriosa y cara, presenta elevado background, baja reproducibilidad, algunas
protenas no se tien y, sobre todo, no es totalmente especfico de protenas, ya que
algunos lipopolisacridos, cidos nucleicos y polisacridos tambin se tien.
24
nmero mnimo de componentes (bandas) de cada muestra. Cada banda se caracteriza
por su movilidad electrofortica relativa (Ur).
Ur = Lmuestra/Lmarcador
donde:
Lmuestra = Longitud recorrida por la muestra
Lmarcador = Longitud recorrida por el marcador
Es importante sealar que la relacin lineal entre logM y Ur se mantiene para una
concentracin dada de poliacrilamida (%T) y slo en un corto intervalo de peso
molecular. De forma general, en geles del 15%T la relacin lineal es vlida para
protenas comprendidas entre 12 y 45 kDa; en geles del 10%T, el intervalo lineal va
entre 15 y 70 kDa, y en los del 5%T, entre 25 y 200 kDa.
Hay protenas con un comportamiento anmalo en SDS-PAGE; en las
glicoprotenas y las lipoprotenas, que llevan unidos azcares o lpidos, la parte no
proteica no une SDS y puede impedir el acceso del mismo a la protena. Por ello, las
glicoprotenas y lipoprotenas unen menos SDS que la mayora de las protenas; esto
hace que la relacin carga/tamao sea menor y, por lo tanto, tengan menor movilidad
electrofortica y se comporten como si tuvieran mayor tamao.
25
bandas pues las concentra en regiones mas estrechas, adems de incrementar el rango
de pesos moleculares que se pueden resolver en un mismo gel comparado con los de
una concentracin fija.
La electroforesis capilar (Fig. 19) se basa en los mismos principios de las tcnicas
electroforeticas convencionales, pero utiliza condiciones y tecnologa distinta que nos
permiten obtener una serie de ventajas al respecto. Esta separacin de pptidos
realizada sobre un capilar de silica fundida a potenciales elevados 20 a 30 Kv en un
campo de 400 a 500 v/cm refrigerados por aire.
La corriente electroendosmtica (FEO) generada por los grupos silanol de la
superficie interna del capilar da como resultado una corriente plana del frente del
lquido que contrasta con el frente parablico de la cromatografa lquida de alta
resolucin. La ventaja de esta tcnica es que el capilar de silica fundida que
generalmente se cubre con una capa de polimina para darle mayor rigidez y
resistencia, tiene una ventaja a travs de ella que permite el pasaje de la luz UV de tal
manera que la visualizacin es on-line.
Con esta tcnica descrita es posible separar cationes, aniones, protenas,
macromolculas y sustancias no cargadas en forma simultnea.
26
Fig. 19 Electroforesis capilar
Fig. 20 Curva de titulacin de una protena. Representacin de la carga neta (Q) de una protena en
funcin del pH.
27
grupos cidos y bsicos, con un pI que abarca desde 2.5 hasta 11.0, con gran capacidad
de tamponacin cerca de su pI y con una gran solubilidad y conductividad.
28
vez corrido el gel, se trocea el carril III y cada segmento (de 1-2 mm) se introduce en
1mL de agua, determinndose su pH. Finalmente, se representa el pH de cada fraccin,
frente a su posicin en gel. La distancia migrada por la muestra (X) se interpola en la
recta obtenida, determinndose as su pH.
Hay que volver a destacar, una vez ms, que el EEF es un criterio de pureza
negativo, es decir, varias bandas indican que la muestra es heterognea, pero la
aparicin de una nica banda no permite afirmar que la muestra sea homognea, ya
que pueden coexistir protenas diferentes con igual pI; no obstante, cuanto menor sea
el gradiente de pH utilizado, mayor ser la probabilidad de que al aparecer una banda,
la muestra sea homognea.
29
Sin embargo, normalmente, la idea de electroforesis bidimensional suele referirse a
la combinacin de los dos tipos de electroforesis ms resolutivos: electroenfoque
(primera dimensin) y SDS-PAGE (segunda dimensin) (Fig. 22).
4.1.1 Protelisis.
30
especificidad y eficiencia en el rompimiento de las protenas, as como un mnimo de
reacciones laterales.
31
azul de Coomassie de la muestra se afectar la eficiencia de digestin de la tripsina ya
que ste se une a los residuos bsicos de las protenas. La presencia de iones de plata,
de azul de Coomassie, y de detergentes como el SDS (que se ioniza fcilmente) puede
afectar tambin el anlisis de MS.
32
4.2 Anlisis de Secuencias Amino y Carboxilo terminal
33
Figura 23. Mtodo de degradacin de Edman.
Estimaciones empricas sugieren que cerca del 40-50% de las protenas que se
resuelven por electroforesis en 2-D estn bloqueadas en el extremo N-terminal por
grupos formil, acetil y piroglutamil (por ciclizacin de residuos de glutamina en
condiciones cidas). Si la protena de inters no est bloqueada naturalmente an
puede sufrir un bloqueo de su N-terminal durante la preparacin de la muestra, en
especial durante la electroforesis. Para evitar el bloqueo del extremo N- terminal en las
protenas de inters se han implementado algunas medidas tales como: adicionar
glicerol grado HPLC al buffer de muestra o correr la electroforesis con slo el gel de
corrida y antes de colocar el gel empacador para evitar que los monmeros de
poliacrilamida reaccionen con los N- terminales de las protenas. Existen tambin
diversos mtodos para desbloquear protenas, aunque no han probado ser muy
eficientes; es por ello que no se recomienda su empleo para protenas poco abundantes.
34
4.2.2 Secuenciacin del extremo carboxilo terminal.
5. ESPECTROMETRA DE MASAS
Para el anlisis de muestras biolgicas por MS es necesario que las molculas estn
cargadas elctricamente y secas. Este requisito se cumple convirtiendo las molculas en
iones desolvatados. Han sido varias las tcnicas que se han desarrollado con este fin,
las primeras de ellas se basaron en el impacto de electrones y en la ionizacin qumica.
Estas tcnicas resultaron efectivas para ionizar molculas pequeas pero no para la
ionizacin de molculas de alto peso molecular, como las biomolculas. La
espectrometra de masas se revolucion en 1981 gracias a la introduccin del
bombardeo rpido de tomos (FAB, fast atom bombardment) por Barber. Esta tcnica
posibilit la ionizacin y deteccin de biomolculas con relativamente buena
sensibilidad. Hoy en da, los mtodos ms comnmente empleados para generar iones
desolvatados son el MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionization) y el ESI
(electrospray ionization), estos han reemplazado por completo al FAB. Tanto el MALDI
como el ESI son mtodos de ionizacin suaves donde se mantiene relativamente la
integridad de la muestra.
35
5.2.1 MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionization)
Este mtodo fue descrito en 1989 por Fenn. En el ESI, la muestra lquida fluye
desde un microcapilar hasta el orificio del espectrmetro de masas, donde una
diferencia de potencial entre el microcapillar y la entrada al espectrmetro de masas
genera una nube de finas gotas cargadas elctricamente. Conforme se evapora el
solvente, disminuye el tamao de las gotas mientras que la carga de las mismas
permanece constante, dando como resultado iones desolvatados. Las cargas elctricas
se distribuyen estadsticamente en los sitios potenciales de carga de las molculas de
36
analito, dando como resultado iones multivalentes. A cada in multivalente se le
denomina un estado de carga, y es comn obtener una distribucin de estados de carga
al analizar macromolculas por ESI. Las protenas tambin generan iones
multivalentes, sin embrago generalmente la resolucin de cada in multivalente no es
suficiente para determinar el nmero de cargas que posee el in, con el cual se podra
determinar su masa real. Por lo tanto se utilizan las masas de al menos 2 iones
multivalentes para calcular la masa real de la protena mediante algoritmos de
deconvolucin.
La tcnica de electrospray genera flujos que van de 10 a 100 L/min. Este flujo
resulta problemtico para el anlisis de protenas, especficamente debido a que la
muestra se consume rpidamente y a que el tiempo de anlisis es muy corto. Por ello,
una mejora importante a este mtodo de ionizacin ha sido el desarrollo de la
ionizacin por nanospray, donde se utilizan microcapilares con dimetro interno de 1
a 2 m y velocidades de flujo de 5 a 10 nL/min. Estos flujos permiten reducir la
cantidad de muestra consumida e incrementar el tiempo disponible para el anlisis.
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Tabla 3. Ventajas y desventajas de los mtodos de ionizacin MALDI y ESI
Ventajas Desventajas
MALDI
Lmite de tamao 300,000 Da Ruido de fondo generado por la matriz,
Sensibilidad en el orden de fentomoles a problemas en compuestos de menos de 1,000
picomoles. Da.
Ionizacin suave con baja o nula Imposible estudiar interacciones no
fragmentacin de los pptidos. covalentes.
Apropiado para anlisis de mezclas complejas. Capacidad mnima para secuenciacin
Las muestras no requiren preparacin previa. (MS/MS) y determinacin de modificaciones
post-traduccionales a menos que se equipe con
un reflectrn (post-source decay).
ESI
Lmite de tamao 70,000 Da Baja tolerancia a sales. Necesario utilizar RP-
Sensibilidad en el orden de fentomoles a HPLC.
picomoles. Alta sensibilidad a contaminantes.
Ionizacin suave. Capaz de observar Baja tolerancia a mezclas. La pureza de la
interacciones no covalentes nativas. muestra es muy importante.
No hay interferencia de alguna matriz. Iones multivalentes. Puede ocasionar
Fcil de adaptar a anlisis de tripe confusin especialmente al analizar mezclas.
cuadrupolo.
Formacin de iones multivalentes: mayor
precisin en el clculo de masas, anlisis de
iones de alto peso con un relativamente bajo
rango m/z del instrumento.
Excelente para determinar modificaciones
post-traduccionales.
Capacidad para secuenciacin de pptidos
excelente.
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Figura 26. Analizador de iones de cuadrupolo.
En precursor ion scan, el primer cuadrupolo permite que todos los componentes de
la mezcla pasen a la celda de colisin (segundo cuadrupolo). El tercer cuadrupolo, que
acta como filtro de masas, est fijo en un valor de masa, de manera que slo los
pptidos que hayan generado fragmentos con la masa especificada por el filtro podrn
ser detectados en el analizador de masas.
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Figura 28. Modos en que se emplea un cuadrupolo triple. 1) Product ion scan, 2) Precursor
ion scan, 3) Neutral loss scan.
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Figura 29. Analizador de tiempo de vuelo.
Los analizadores hbridos se han convertido en una herramienta muy til para la
secuenciacin de protenas. Combinando un cuadrupolo que acte como filtro de masa
y una celda de colisin con un analizador ToF con reflectrn, es posible obtener
informacin con alta precisin, resolucin y sensibilidad. Los analizadores hbridos
usualmente estn acoplados a un sistema de HPLC.
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5.3.5 Analizadores ToF/ToF.
Este tipo de analizador, acoplado a una fuente de iones MALDI, se utiliza para
secuenciacin de pptidos y huella de masa de pptidos. Dos analizadores ToF se
encuentran separados por una celda de colisin. El primer analizador ToF se emplea
como selector de iones. En la celda de colisin se producen choques de alta energa
entre los iones. Y el segundo analizador ToF resuelve los iones.
El FT-ICR, es una trampa de iones magntica. En este analizador los iones son
atrapados en una celda que est bajo un campo magntico fuerte. La celda est
compuesta por tres pares de placas (figura 31): placas de confinamiento
(perpendiculares al campo magntico), transmisoras y receptoras. Dentro de la trampa,
los iones se mueven en rbita circular, perpendicular al campo magntico. Los iones se
mantienen en la celda debido al potencial elctrico aplicado a las placas de
confinamiento. Cuando se aplica un potencial elctrico de radio-frecuencia en las
placas transmisoras los iones atrapados se excitan. Una frecuencia dada excita iones
con una relacin m/z particular. La excitacin de los iones provoca que giren en
rbitas mayores. Cuando los iones excitados pasan cerca de las placas receptoras se
detecta su frecuencia de rotacin (que es inversamente proporcional a su masa) y se
induce una corriente en las placas. A esta corriente se le denomina corriente de imagen.
Mediante las transformadas de Fourier es posible medir simultneamente todas las
frecuencias de rotacin al mismo tiempo.
Figura 31. Analizador de masas FT-ICR. A) Placas de confinamiento, atropamiento de iones por campo
magntico. B) Placas transmisoras, excitacin de los iones. C) Placas receptoras, generacin de corriente de
imagen.
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5.3.7 Fragmentacin de Iones.
Una vez que los iones son dirigidos a la cmara de colisin del espectrmetro de
masas, estos interactan con el gas de colisin (N2 o Ar) y sufren una fragmentacin
primaria.
Los fragmentos que se generan pueden ser muy variados (Figura 32). Si el despus
de la fragmentacin la carga se mantiene en el extremo N-terminal, el in es designado
como in -b; en cambio, si la carga se mantiene en el extremo C-terminal, el in es
denominado un in -y. La diferencia en masa entre un in -b y un in -y corresponde
a un aminocido. Esta diferencia de masa entre los iones se utiliza para identificar los
aminocidos, y con ello, la secuencia peptdica. Para distinguir entre los aminocidos
leucina e isoleucina, que poseen la misma masa molecular, es necesario que la
fragmentacin se lleve a cabo con energas de colisin muy altas, de manera que se
propicie la fragmentacin de cadenas laterales de los aminocidos.
Tanto los iones -b como los -y pueden perder NH3 (principalmente de los residuos
bsicos como arginina y lisina), H2O (principalmente del alcohol contenido en residuos
de serina y treonina; y de los residuos que contienen grupos carboxilo libres como el
cido glutmico y el asprtico) y CO. Cuando un in b pierde CO se forma un in-a.
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Tabla 4. Bases de datos utilizadas para identificacin de protenas.
Esta tcnica comprende los siguientes pasos: digestin de la protena, anlisis por
MALDI-ToF y empleo de algoritmos de bsqueda en bases de datos.
Para llevar a cabo el anlisis de datos, cada protena en la base de datos es digerida
tericamente empleando el mismo agente utilizado para fragmentar la protena
problema. Posteriormente se compara el espectro obtenido por MS (la huella de masa
del pptido) con los espectros tericos generados en la base de datos; se calcula y
asigna una puntuacin, la cual refleja la paridad entre los datos experimentales y los
tericos obtenidos por la base de datos. La protena identificada como la ms probable
es aquella con la puntuacin ms alta.
Esta tcnica posee la ventaja de ser bastante rpida, sin embargo no es buena
cuando se trabaja con mezclas de protenas a pesar de que se han desarrollado algunos
programas para tal fin. La presencia de un alto nmero de modificaciones post-
traduccionales en la protena problema puede generar un espectro de masa distinto a
los predichos por las bases de datos, lo que representa un problema para el anlisis.
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6.2 Secuenciacin utilizando datos generados con la tcnica product ion scan en
MS/MS.
Es posible llevar a cabo un anlisis manual del espectro de masa para determinar la
secuencia tomando como base los iones (de la serie b y y) generados.
Los datos tambin pueden interpretarse en bases de datos, a este tipo de bsqueda
se le denomina MS/MS no interpretado (uninterpreted MS/MS). Y generalmente basta
con obtener la secuencia de 2 pptidos para identificar una protena de un genoma
conocido. Son muchas las bases de datos disponibles para realizar bsquedas de este
tipo, sin embargo presentan problemas en el anlisis cuando existen modificaciones y
polimorfismo en las protenas.
Cuando los pptidos son obtenidos por digestin con tripsina, el extremo C-
terminal de los mismos es arginina o lisina. En un espectro MS/MS, el residuo C-
terminal se puede observar en el fragmento correspondiente al in-y1. Por tanto, el
punto de inicio de la serie y siempre ser conocido. A la masa observada del in-y1 hay
que aadir la masa de una molcula de agua y de un protn. Si la masa del in y1 es
de 175 Da, entonces el residuo es arginina; en cambio, si la masa es de 147 Da el
residuo es lisina. Una vez identificado el in y1 en el espectro, la secuencia de la serie
puede iniciarse a partir de ese punto.
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Figura 33. Identificacin de protenas por MS/MS. A) Resolucin y digestin de la protena. Anlisis en
espectrmetro de cuadrupolo-ToF. B) Barrido del espectro y seleccin de in precursor. C) Ampliacin de
in precursor. Identificacin de la carga del in. D) In precursor se somete a MS/MS. Espectro de iones
hijos. E) Identificacin de la protena mediante bases de datos.
Debido a que la MPT representa una fraccin muy baja del peso total de la
protena, se requieren mayores cantidades de la muestra para el anlisis.
En algunos casos, los enlaces entre la MPT y el pptido se desestabilizan durante la
preparacin de la muestra.
Frecuentemente las MPT son transitorias, por lo que para el anlisis resulta
complicado recuperar las protenas en su estado modificado.
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7.1 Identificacin de sitios de fosforilacin.
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grupo fosfato (PO3- ) con una relacin carga/masa de 79. La mezcla de pptidos se
roca bajo condiciones bsicas o neutras, y slo se detectan los pptidos que al
fragmentarse generan un in con m/z igual a 79. Una vez que se detecta un
fosfopptido, la mezcla se roca bajo condiciones cidas y el anlisis de la secuencia se
realiza por MS/MS convencional. Durante la fragmentacin del pptido los residuos
modificados pueden ser identificados por la formacin de productos especficos de la
eliminacin del fosfoaminocido. La fosfoserina produce deshidroalanina (69 Da),
mientras la fosfotreonina produce deshidroamino-2 cido butrico.
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8. BIBLIOGRAFA
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