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CTB Biorreactores PDF
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BIOTECNOLOGIA
(FCEyN UBA )
Biotecnologa Industrial
Produccin industrial de Metabolitos
Biorreactores
Miryan Cassanello
PINMATE Dep. Industrias, FCEyN-UBA
E-mail: miryan@di.fcen.uba.ar
Productos biotecnolgicos: estn en todos los sectores de la
vida diaria: Relevancia econmica de los
drogas (genricas productos generados industrialmente
y no-genricas) mediante procesos biotecnolgicos
productos de
belleza Estadstica: ao 2002
procesamiento de (Fuente: Kent y Riegel, 2007)
alimentos para
humanos y
animales
procesamiento
textil y artculos
de limpieza
aplicaciones
industriales:
produccin masiva
de alcohol
suplementos
nutricionales
Productos obtenidos mediante procesos biotecnolgicos
Productos Organismo tpico utilizado Mercado
mundial
(ton/ao)
Alcoholes Etanol Saccharomyces cerevisiae 20 millones
Butanol/acetone Clostridium acetobutylicum 2.000
cidos Acido ctrico Aspergillus niger 230.000
orgnicos Acido glucnico Aspergillus niger 50.000
Acido lctico Lactobacillus delbrueckii 20.000
Aminocidos Acido L- Corynebacterium glutamicum 300.000
glutmico
L-lisina Brevibacterium flavum 30.000
L-fenilalanina Corynebacterium glutamicum 2.000
L-arginina Brevibacterium flavum 2.000
Antibiticos Penicilinas Penicillium chrysogenum 40.000
Cefalosporinas Cephalosporium acremonium 10.000
Tetraciclinas Streptomyces aureofaciens 10.000
(Fuente: Doran, 1995)
Producto Organismo tpico utilizado Mercado mundial
(ton/ao)
Enzimas Proteasas Bacillus spp. 600
-Amilasa Bacillus amyloliquefaciens 400
Glucoamilasa Aspergillus niger 400
Glucosa isomerasa Bacillus coagulans 100
Pectinasa Aspergillus niger 10
Polmeros Xantanos Xanthomonas campestris 5.000
Dextrano Leuconostoc mesenteroides 200
Vitaminas B12 Propionibacterium shermanii 10
Vacunas Difteria Corynebacterium diphterie < 50 kg/ao
Ttanos Clostridium tetani Pequea
Protenas Insulina Escherichia coli recombinante < 20 kg/ao
teraputicas Interfern-2 Escherichia coli recombinante 10
Hormona de Escherichia coli recombinante o Pequea
crecimiento clulas recombinantes de
mamferos
Ingeniera Qumica
Biologa
Qumica
Bioqumica
Biotecnologa AZUL:
Aplicacin en
Biotecnologa ROJA: organismos marinos
Aplicacin en medicina
Biotecnologa Biotecnologa
ROJA AZUL
BIOTECNOLOGIA
Biotecnologa Biotecnologa
VERDE BLANCA
Biotecnologa VERDE:
Aplicacin en agro- Biotecnologa BLANCA (o industrial):
alimentos Aplicacin en la industria en general,
productos qumicos, nuevos materiales,
biocombustibles, etc.
BIOTECNOLOGIA
INDUSTRIAL
Metabolitos Metabolitos
Primarios Secundarios
Metabolitos primarios
-Molculas generalmente sencillas, que participan de los caminos
metablicos esenciales. Son casi idnticos en todos los organismos.
-Son ms baratos y sencillos de producir, tienen bajo contenido de
actividad biolgica y frecuentemente son commodities
1. Componentes esenciales de las clulas/microorganismos:
protenas, cidos nuclicos, polisacridos (gelanos, xantanos) y
polisteres, cidos grasos (insaturados), esteroles.
2. Derivados del metabolismo intermedio: azcares (fructosa,
ribosa, sorbosa), cidos orgnicos (gluconato, cido lctico,
ctrico, actico, propinico, succnico, fumrico), alcoholes
(xilitol, etanol, glicerol, sorbitol, butanol), aminocidos (Lys,
Thr, Glu, Trp, Phe), vitaminas (B2, B12), nucletidos
saborizantes (cidos inocnico y guanlico), polisacridos y
polisteres de reserva.
Microorganismos productores: bacterias, levaduras y hongos
Metabolitos secundarios
-Molculas mas complejas, que participan de caminos metablicos
no-esenciales, pero confieren capacidades de supervivencia en
situaciones de stress.
-Son muy variados y su estructura es fuertemente dependiente de la
especie y variedad utilizada para su produccin. Se generan en
condiciones particulares y son ms valiosos y complicados de
producir alto contenido de actividad biolgica
-Generalmente son productos especiales (alto precio). Funcionan
en los organismos que los producen como:
1. Armas contra otros microorganismos (antibiticos, toxinas,
inhibidores enzimticos, pesticidas)
2. Factores de crecimiento (hormonas)
3. Ionforos
4. Agentes de interaccin microbiana
5. Efectores externos
PROCESOS BIOTECNOLOGICOS o
FERMENTACIONES
Procesos que se llevan a cabo en un bio-reactor mediante los cuales
se transforman los sustratos de un medio de cultivo (materias primas)
en metabolitos y/o en biomasa (productos) empleando para este fin
microorganismos, clulas o enzimas.
Biorreactor
o
Fermentador
Operaciones Operaciones
unitarias unitarias
Principales etapas de un proceso biotecnolgico industrial:
Fermentacin
Propagacin Separacin
de los cultivos Tratamiento
Esterilizacin de efluentes
Purificacin
Preparacin de
medios
1) Propagacin de cultivos: comienza en un tubo de ensayo o un tubo
congelado o liofilizado donde se conserva la cepa de inters, o de
una colonia del microorganismo previamente seleccionado. Se
propaga en el laboratorio progresivamente aumentando el volumen
del medio de cultivo.
S + X P + nX
aumento en el nmero de clulas
Crecimiento aumento del tamao de las clulas
El crecimiento microbiano es un ejemplo de reaccin auto-
cataltica. La velocidad de crecimiento est relacionada con la
concentracin de clulas.
neta = g k d
Tambin se puede expresar la velocidad en funcin de la
concentracin de nmero de clulas en lugar de la concentracin
msica de las mismas. Si no se pueden medir las dos, se prefiere
la concentracin msica.
Formas de medir la concentracin de clulas
Se busca un mtodo rpido, fcil de seguir en lnea o de respuesta
rpida.
Directos
Mtodos Indirectos
Determinacin de la concentracin msica de clulas:
Mtodos directos (en ausencia de otros slidos en suspensin):
Masa de clulas secas (centrifugado/filtrado/lavado/secado)
Volumen de clulas centrifugadas en condiciones estndar
Absorcin de luz por clulas en suspensin
luciferasa Sensible
luciferina + ATP + O 2 LUZ
> 10-12 gATP/L
Cintica de crecimiento de un cultivo en batch
Etapas:
1) de latencia o
induccin
2) de crecimiento
exponencial
3) de desacelera-
cin
4) estacionario
5) de muerte o
declinacin
celular
3)4)
Desaceleraci por consumo
n: velocidad de de un nutriente
crecimiento nula.esencial
Las o generacin
clulas an son de
Latenciabaja el nmerodel inculo
clulas,aldifcil definir el lmite con
la
5) Estacionario:
Muerte:
1)
subproductos
2) : adaptacin
Crecimiento txicos crecimiento
exponencial: medio. Depende
rpida multiplicacin
desbalanceado, de del
las inculo
clulas
clulas deben
activas
etapa y pueden producir metabolitos secundarios (ej. antibiticos,
(edadanterior.
y tamao)
crecimiento
readaptarse a las y de los(composicin
balanceado
condiciones nutrientes.
hostiles. Sedepuede adaptar
clulas constante).
ex-situ.
hormonas) productos de la desregulacin celular
1) Latencia: adaptacin del inculo al medio. Depende del
inculo (edad y tamao) y de los nutrientes. Se puede adaptar
ex-situ.
2) Crecimiento exponencial: rpida multiplicacin de clulas
crecimiento balanceado (composicin de clulas constante).
3) Desaceleracin: por consumo de un nutriente esencial o
generacin de subproductos txicos crecimiento
desbalanceado, las clulas deben readaptarse a las condiciones
hostiles.
4) Estacionario: velocidad de crecimiento nula. Las clulas an
son activas y pueden producir metabolitos secundarios (ej.
antibiticos, hormonas) productos de la desregulacin celular
5) Muerte: baja el nmero de clulas, difcil definir el lmite con
la etapa anterior.
Crecimiento balanceado: todos los componentes de las clulas
crecen con la misma velocidad la composicin media de las
mismas permanece constante. Es vlido para la etapa de crecimiento
exponencial.
exponencial
En este perodo, la velocidad de crecimiento es independiente de los
nutrientes y resulta en una cintica de primer orden.
1 dX dX neta t
g neta = = neta dt X = X 0e
X dt X
Tiempo necesario para duplicar la biomasa:
ln(2)
X = 2X 0 d =
neta
Crecimiento no balanceado: los componentes de las clulas no
crecen con la misma velocidad la composicin media se modifica.
Esta situacin caracteriza especialmente a la etapa estacionaria
El estrs producido por la falta de nutrientes o por la existencia de
subproductos o toxinas inhibidoras que generan un medio hostil
induce una reestructuracin de las clulas para adaptarse a las nuevas
condiciones.
g neta = g k d
Puede ocurrir:
La concentracin msica de clulas (X) es constante pero baja el
nmero de clulas viables.
X baja por lisis de clulas. Puede aparecer un segundo perodo
de crecimiento, los productos de lisis o las clulas muertas
constituyen un sustrato alternativo (crecimiento crptico).
X constante pero su metabolismo es activo; cambia la regulacin
celular produciendo metabolitos secundarios.
Coeficiente de mantenimiento: se emplea para definir la velocidad
especfica de consumo de sustrato para energa de mantenimiento.
Energa de mantenimiento: necesaria
para mantener la membrana celular activa
1 dS
m= - y el transporte de nutrientes, y para
X dt m funciones metablicas esenciales como la
movilidad y la reparacin de estructuras
daadas.
Los rendimientos
dependen del medio
y de la fuente de C.
Para la mayora de
los casos:
YX /S = 1 0,4 g/g
g biomasa
g de C consumido
Relacin del crecimiento de biomasa con la formacin de
productos: Definimos la velocidad
1 dP
especfica de formacin qP = = YP / X g
de producto, qP X dt
Se encuentran 3 situaciones:
(a) qP asociada al crecimiento celular, ej: produccin de una
enzima constitutiva de la biomasa (metabolito primario).
q P = g = YP / X
(b) qP parcialmente asociada (etapa de desaceleracin y
estacionaria), ej: fermentacin de cido lctico, xantanos y algunos
metabolitos secundarios. q = +
P g
(c) qP no-asociada al crecimiento celular (etapa estacionaria, donde
la g=0) ej.: metabolitos secundarios como antibiticos.
q P = = cons tan te; g = 0
Relacin del crecimiento de biomasa con la formacin de
productos:
1 dP 1 dX
qP = = YP / X g = YP / X
X dt X dt
El O2 se
introduce por
burbujeo y su
concentracin
depende de la
agitacin.
Velocidad de
OTR = k L a LG C*O C O b
transferencia: 2 2
Concentracin de CO2 disuelta puede afectar. Puede ser txica para algunas
clulas y necesaria para otras.
Se regula modificando la concentracin en la corriente de burbujeo.
CH m O n + a O 2 + b NH 3 c CH O N + d H 2O + e CO 2
i,sustratos i i = i,productos i i
i :coef .estequiometri cos ; i :grados de reduccion
Cintica de crecimiento microbiano: Modelos
productos mayor cantidad
Sustrato + biomasa +
extracelulares de biomasa
S + X P + nX
(
neta g k d )
1 dX
X dt
neta: Velocidad especfica neta de crecimiento (h-1)
g: Velocidad especfica de crecimiento de biomasa (h-1)
kd: constante de muerte celular o disminucin de masa celular por
metabolismo endgeno (h-1)
X: concentracin msica de clulas (g/L)
t: tiempo (h)
Cuantificacin de la cintica de crecimiento: modelos cinticos
Descripcin detallada Fdebera involucrar diferenciaciones en la
estructura de la clula y la segregacin del medio de cultivo en
unidades que pueden tener diferentes concentraciones y propiedades
fsico-qumicas Fmodelos estructurados-segregados
(
X f X 0 = YX / S S0 S )
kg
m3
La mayora de las fermentaciones operan con una relacin Xf/X0 de
aproximadamente 1020. La velocidad de produccin de biomasa
por operacin del reactor batch, rb , se calcula dividiendo la masa
total que podemos formar por el tiempo que lleva la operacin:
YX / SS0 kg
rb =
(1/ neta )ln(Xf )
X0 + t m m 3s
Masa que sale Masa consumida Masa que entra Masa generada
del V.C. con + = al V.C. con +
los productos dentro del V.C. los reactivos dentro del V.C.
Quimiostato - ecuaciones de diseo
Masa que sale Masa consumida Masa que entra Masa generada
del V.C. con + = al V.C. con +
los productos dentro del V.C. los reactivos dentro del V.C.
Fv Fv Balance de masa de clulas:
S0, X0, P0 S, X, P
FV X = FV X 0 + V neta X
V
(
FV X = FV X 0 + V g k d X )
FV: caudal volumtrico de medio
Gas de cultivo agregado (L/h)
Definiendo el factor de dilucin como caudal/volumen: D = FV/V
(
DX = DX 0 + g k d X ) Si se alimenta medio estril (X0= 0) y
el mecanismo endgeno es despreciable
(
DX = DX 0 + g k d X ) D = g
Importancia de este resultado: En un quimiostato en
D= g EE, alimentado con medio estril y en condiciones
en las que el metabolismo endgeno es despreciable,
la velocidad o factor de dilucin, D, iguala a la
velocidad de crecimiento de clulas
F se puede manipular la velocidad de crecimiento como un parmetro
independiente modificando las variables de operacin
F el quimiostato es una herramienta experimental poderosa
m S
D = g = S: concentracin de sustrato limitante
Ks + S del crecimiento de biomasa en EE
Masa que sale Masa consumida Masa que entra Masa generada
del V.C. con + = al V.C. con +
los productos dentro del V.C. los reactivos dentro del V.C.
1 1
FVS + Vg X M + Vq P X = FVS0
YX /S YP /S
Formacin de biomasa Formacin de producto
(
X = YXM/S S0 S )
M
D 2
Ks
mS DK s DX = YX /S DS0
D = g = S=
D
Ks +S m D m
D op K s
DX )op = YXM/SD op S0
m
D
op
DX )op = YX /S m 1
M
K
Ks
+ S
(
S + K K K +S
0 s s s 0
( ))
s 0
M
Normalmente Ks<< S0 DX)op YX /S mS0
Efecto del factor de dilucin sobre la concentracin de clulas,
concentracin de sustrato y la productividad. D (1/h) S (kg/m ) X (kg/m3)
3
0.2 0.4 DX
3
0.3)
(kg/h.m
0.1 0.2
3
S (kg/m )
0.2
0 0
0 0.2 0.4 0.6 0.8
-1
D (h ) 0.1
m 0
0 0.2 0.4 -1
0.6 D (h0.8)
Algunas aplicaciones de los sistemas continuos:
- produccin de algunas protenas
- tratamiento de efluentes, en particular cuando se emplean
microorganismos o enzimas inmovilizadas.
- produccin de etanol
- produccin de productos asociados a crecimiento,
especialmente en gran escala (por ejemplo, cido
lctico)
Fv : relacin de reciclo
S0,X0,P0 basada en caudales
Fv
Fv(1+) volumtricos.
S1,cX1,P1
S1,X1,P1 c: factor de concentracin
relacin de la
concentracin de
clulas en la corriente
Fv
de reciclo sobre la que
V S1,X2,P1
sale del reactor
(
V neta X1 = (1+ ) FV X1 FV cX1 ) V
Fv
S1,X2,P1
neta = D(1+ c ) Gas
Fv
Fv S0,X0,P0
neta = D[1+ (1 c)]
S1,cX1,P1 Fv(1+)
S1,X1,P1 Como c > 1 (1-c) < 0
neta < D
Fv Cuando hay reciclo, el
V S1,X2,P1 quimiostato puede operar con
una velocidad de dilucin
Gas
mayor que la de crecimiento
BM sustrato limitante (en EE):
Masa que sale Masa consumida Masa que entra Masa generada
del V.C. con + = al V.C. con +
los productos dentro del V.C. los reactivos dentro del V.C.
1 1
(1+ )FVS1 + Vg X1 M + Vq P X1 = FVS0 + FVS1
YX /S YP /S
Formacin de biomasa Formacin de producto
BM sustrato limitante
(en EE y en ausencia de productos extracelulares):
1 1
(1+ )FVS1 + Vg X1 M + Vq P X1 = FVS0 + FVS1
YX /S YP /S
1
( )
V g X1 M = FV S0 + S1 (1+ )FVS1
YX /S
X1 =
D
g
(
YXM/S S0 S1 )
(
YXM/S S0 S1 )
Si k d = 0 g = neta = D[1+ (1 c)] X1 =
1+ (1- c )
Fv
Velocidad de Fv S0,X0,P0
generacin de S1,cX1,P1 Fv(1+)
X1,cr
biomasa S1,X1,P1
c = 2 ; = 0.5
X1,sr
V
con reciclo Gas
sin reciclo Fv
S1,X2,P1
Quimiostatos mltiples en cascada: en algunas fermentaciones,
particularmente para la produccin de metabolitos secundarios (ej.:
un antibitico), conviene separar las etapas de crecimiento de
biomasa y de formacin del producto deseado pues las condiciones
ptimas son diferentes
F con mltiples quimiostatos, se pueden fijar condiciones
distintas en cada uno: pH, temperatura, conc. de nutrientes
Vf
V0 V
X0,S0,P0 Xf,Sf,Pf
X,S,P
1)Carga 3)Recuperacin
2)Realimentacin
del producto
1) Desde la carga hasta el momento de la realimentacin peridica,
el sistema se comporta como un batch: X = X + Y M S S
0 X /S
(0 )
Xm es la mxima X a alcanzar con S0 , que se da
X m = YXM/SS0
cuando S << S0 y para la cual tambin X0 << Xm
Operacin con alimentacin semi-continua Fed-batch:
Cuando X Xm , se agrega una corriente de
Fv,S0 (X0) nutrientes frescos con un caudal volumtrico
Fv y de una concentracin S0. La variacin de
volumen es: dV
= Fv V = V0 + (Fv ) t
dt
V
Durante la realimentacin, el BM de biomasa
X,S,P es: d(VX ) dX dV
2)Realimentacin FV X 0 + V neta X = =V +X
dt dt dt
entra + se genera = se acumula
dX FV
= X 0 + neta X
dt V
X dV
V dt
( )
= DX 0 + X neta D
dX
dt
(
X neta D )
Como el sustrato se consume casi todo dX/dt 0
(condicin de estado cuasi-estacionario). Luego:
neta D
Como D porque V, neta va disminuyendo continuamente.
Operacin con alimentacin semi-continua Fed-batch:
BM para el sustrato:
Fv,S0 (X0) Vg X Vq X d(VS)
FVS0 P =
YXM/ S YP / S dt
entra se consume = se acumula
Si no consideramos la formacin de
V productos y dado que la masa de sustrato
X,S,P se mantiene siempre g (XV )
2)Realimentacin baja y constante: FVS0 =
YXM/ S
d(XV )
= neta (XV ) FVS0 YXM/ S (XV )= X 0 V0 + FVS0 YXM/ S t
dt
(es igual en ausencia de metabolismo endgeno)
V (mL)
1000 (h-1)
Variacin de las X (g/L)
P (g/L) 0.6
concentraciones de V (mL)
800
biomasa, sustrato y
producto, y de la
velocidad de 600 0.4
crecimiento y volumen
del cultivo en funcin
del tiempo, para el 400 (h )
-1
0 0
0 0.5 1 1.5 t 2(h)
Sistemas con microorganismos inmovilizados: la inmovilizacin
de microorganismos tiene aplicacin si los productos son
extracelulares
Ventajas sobre los cultivos con clulas en solucin:
Proveen una alta concentracin de clulas
Las clulas se usan en forma continua y se eliminan costosos
procesos de recuperacin y reciclo de clulas
Se eliminan el problema del washout a altas velocidades de
dilucin
Se pueden lograr altas productividades
Se puede lograr un medio local favorable que conduce a mayores
rendimientos y una mejor performance del biocatalizador
En algunos casos mejora la estabilidad gentica
En algunos casos disminuye el dao por abrasin de las clulas
Sistemas con microorganismos inmovilizados
Esquema de una
columna de burbujeo
H/D~12
Tanques agitados de escala
laboratorio
Tanques agitados de escala
laboratorio con clulas
inmobilizadas
Fermentadores comerciales de escala laboratorio (V ~ 2-20 litros)
H ~ 15 m de alto
D ~ 4,2 m de dimetro
vrtice
Agitacin y distribucin de gas en reactores agitados
La determinacin de la velocidad de transferencia de oxgeno y el
calor liberado son claves para el diseo de los fermentadores.
La velocidad de transferencia de O2 depende de la dispersin de gas,
que es funcin del tipo de reactor; ej: en tanques agitados, aumenta al
aumentar la velocidad de agitacin.
> RPM
Influencia de la velocidad de agitacin sobre la turbulencia y la
dispersin de gas inducida por agitacin mecnica en un reactor
de laboratorio de 2L.
Reactor agitado en
suspensin de escala
banco: 20cm de
dimetro y de alto
(volumen ~ 8L)
Reactor tanque agitado:
Problemas ocasionados por
la evolucin de espuma:
-peligro de contaminacin
-complica la circulacin de
gases vrtice
-complica el mezclado
-cambian las velocidades
de transferencia masa y de
calor
Configuraciones comunes de fermentadores: columnas de burbujeo
Columna de burbujeo de escala banco: V~10L
Columnas de burbujeo
Regmenes de flujo en columnas de
burbujeo: depende del caudal de gas y del
distribuidor que se emplee
Columnas de burbujeo para el
cultivo de algas
Configuraciones comunes de fermentadores
Configuraciones de recirculacin interna inducida por el flujo de
aire Air-lift
Escala
banco
(0,2 x 2)m
La multiplicacin implica
replicar muchas veces el
resultado que se obtiene
en un reactor de escala
relativamente pequea, en
lugar de llevar a cabo el
proceso en un reactor de
mayor tamao.
Produccin de cido glucnico
Produccin de gluconato de sodio con A. niger
Produccin de antibitico
Produccin de lisina (10000 ton/ao)
en 20 fermentadores de 250 m3
Drogas medicinales
Reglas de uso : basadas en anlisis dimensional y criterios de
similaridad de algunos parmetros
30 Potencia/Volumen
30 kLaLG
20 Concentracin de oxgeno
La concentracin de
oxgeno es diferente en
distintas zonas del
reactor. Se puede simular
considerando varios
reactores con distinta
alimentacin de oxgeno
Modelo del sistema que supone
dos compartimientos con distinta
concentracin de oxigeno